金银复合纳米粒子溶液、制备工艺及检测三聚氰胺的方法

摘要

本发明提供一种金银复合纳米粒子溶液、制备工艺，涉及三聚氰胺的检测领域，此制备工艺首先制备金纳米粒子溶液，然后采用金纳米粒子做晶种，硝酸银和抗坏血酸做成长溶液，制备金银复合纳米粒子溶液，此制备工艺简单，制得的金银复合纳米粒子的粒度均匀，其中的金银复合纳米粒子在三聚氰胺的作用下聚集，从而实现对三聚氰胺的快速、简便检测，具有较好的灵敏度和选择性。本发明还提供一种检测三聚氰胺的方法，该方法使用金银复合纳米粒子溶液，可快速、简便的检测三聚氰胺。

说明书

技术领域

本发明涉及三聚氰胺的检测领域，且特别涉及一种金银复合纳米粒子溶液、制备工艺及检测三聚氰胺的方法。

背景技术

三聚氰胺(Melamine)，俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，为纯白色单斜棱晶体。食品工业上通常采用凯氏定氮法，通过测定氮含量来推算蛋白质含量，三聚氰胺的含氮量为66％，常被不法分子违法添加到食品中，以造成蛋白质含量达标的假象。

三聚氰胺具有较强的黏性，进入人体后水解生成三聚氰胺，容易在体内吸附形成结石的草酸、鞣酸及钙等物质，并沉淀在泌尿系统中。长期摄入三聚氰胺会造成泌尿系统损害，会损害人体和动物的生殖、泌尿系统，产生肾、膀胱结石。2008年10月7日，国家标准委员会发布了原料乳和乳制品中三聚氰胺的检测方法，包括液相色谱质谱法、气相色谱质谱法、离子色谱紫外检测法三种标准测定方法。

液相色谱质谱法是使奶粉样品的蛋白质部分沉淀，经过纯化、离心后用0.45μm滤膜过滤，再用超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC2MS2MS)分析测定。该方法可测定低含量的三聚氰胺，检测灵敏、结果准确，但使用的仪器昂贵。

气相色谱质谱法是将奶粉样品沉淀离心后，净化、氮气吹干、硅烷化衍生，再由气相色谱-质谱联用仪检测。气相色谱质谱法使用的 试剂用量少，精确度高，安全可行，但必须经过复杂的衍生步骤，操作繁琐，工作效率低。

离子色谱紫外检测法是用乙腈沉降蛋白，用IonPac CS17色谱柱进行分离，配制三聚氰胺不同浓度的系列标准溶液，测其紫外光谱图，用样品的峰面积对照标准曲线回归方程即得样品浓度。该方法精确度高，无色谱干扰，重现性良好，但试验成本较高，柱子易污染，操作较复杂。

除此之外，还可以使用酶联免疫吸附法和比色法检测原料乳和乳制品中的三聚氰胺。酶联免疫吸附法是将样品粉碎处理后，加入PBS溶液充分溶解，用三聚氰胺定量检测试剂盒测量OD值。该方法选择性好、灵敏度高、结果判断客观准确、实用性强、经济、安全，但不能够同时分析多种成分。

比色法是通过金纳米粒子与三聚氰胺结合形成复合物而发生团聚，导致金纳米粒子粒径变大，颜色发生变化，从而反映待测样品中三聚氰胺的含量。例如公开号为CN101846631A的中国专利通过金纳米粒子的制备、冠醚的衍生化、金纳米粒子偶联冠醚、运用金纳米粒子自组装和分子识别检测三聚氰胺。该方法前期制备过程复杂。

综上所述，以上各种方法虽然都具有对三聚氰胺的检测灵敏度高，结果准确的优点，但是它们都需要用到大型精密仪器，或者需要专业操作人员进行复杂的样品前处理，操作起来比较复杂，无法实现对三聚氰胺快速、简便的检测，不能满足我国对乳制品进行批量检测的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金银复合纳米粒子溶液，其中的金银复合纳米粒子在三聚氰胺的作用下聚集，从而实现对三聚氰胺的快速、简便检测，具有较好的灵敏度和选择性。

本发明的另一目的在于提供一种金银复合纳米粒子溶液的制备工艺，工艺简单，制得的溶液可用于快速、简便的检测三聚氰胺。

本发明的另一目的在于提供一种检测三聚氰胺的方法，可快速、简便的检测三聚氰胺。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种金银复合纳米粒子溶液的制备工艺，其包括以下步骤：

称取柠檬酸钠和三水合四氯金酸溶解于水中，剧烈搅拌，得到第一溶液，称取硼氢化钠，用冰水配制成第二溶液，将第二溶液加入到第一溶液中，得到第三溶液；

称取硝酸银和柠檬酸钠溶解于水中，得到第四溶液，将第三溶液在1-2s内加入到第四溶液中，得到第五溶液；以及

量取抗坏血酸，将抗坏血酸在8-12min内逐滴加入到第五溶液中，滴加完毕后继续搅拌0.6-1.5h，得到金银复合纳米粒子溶液。

进一步地，在本发明较佳实施例中，上述第一溶液中柠檬酸钠的浓度为0.07-0.077g/L，第一溶液中三水合四氯金酸的浓度为0.95-0.112g/L；第二溶液中硼氢化钠的浓度为0.08-0.12mol/L。

进一步地，在本发明较佳实施例中，上述第一溶液和第二溶液的体积比为80-120:1。

进一步地，在本发明较佳实施例中，配制第一溶液的方法是：称取柠檬酸钠和三水合四氯金酸溶解于水中，采用磁力搅拌器，在55-60转/min的条件下搅拌20-30min。

进一步地，在本发明较佳实施例中，上述第四溶液中硝酸银的浓度为0.1-0.3g/L，第四溶液中柠檬酸钠的浓度为0.4-0.8g/L。

进一步地，在本发明较佳实施例中，上述第三溶液与第四溶液的体积比为2-4:50。

进一步地，在本发明较佳实施例中，上述抗坏血酸和第五溶液的体积比为10:50-56。

一种金银复合纳米粒子溶液，采取上述的金银复合纳米粒子溶液的制备工艺制得。

一种采用金银复合纳米粒子溶液检测三聚氰胺的方法，其包括以下步骤：

按体积比1-5:10量取金银复合纳米粒子溶液和去离子水，混合得到检测溶液；

将待测样品加入检测溶液中，混合均匀后，室温下放置10-15min，得到待测溶液；以及

对待测溶液进行紫外可见分光光谱分析，测试待测溶液在400nm的吸收值A₄₀₀，以及在636nm处的紫外光吸收值A₆₃₆，根据A₆₃₆/A₄₀₀值，对照A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺的标准浓度曲线图，即可得到待测溶液中三聚氰胺的浓度。

进一步地，在本发明较佳实施例中，上述方法还包括在检测之前绘制A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图的步骤，步骤具体包括：

分别量取至少5份0.1-0.5mL的金银复合纳米粒子溶液，将每份金银复合纳米粒子溶液分别加入1mL去离子水中，并加入不同量的三聚氰胺，混合均匀后，静置8-12分钟，形成不同浓度的三聚氰胺溶液；以及

分别对不同浓度的三聚氰胺溶液进行紫外可见分光光谱分析，测试不同浓度的三聚氰胺溶液在400nm的紫外光吸收值A₄₀₀，以及在636nm的紫外光吸收值A₆₃₆，计算不同浓度的三聚氰胺溶液对应的 A₆₃₆/A₄₀₀，根据不同浓度的三聚氰胺溶液的浓度与对应的A₆₃₆/A₄₀₀，制得A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图。

本发明实施例的有益效果是：本发明实施例的金银复合纳米粒子溶液的制备工艺首先制备金纳米粒子溶液，然后采用金纳米粒子做晶种，硝酸银和抗坏血酸做成长溶液，制备金银复合纳米粒子溶液，工艺简单，制得的金银复合纳米粒子的粒度均匀，其中的金银复合纳米粒子在三聚氰胺的作用下聚集，从而实现对三聚氰胺的快速、简便检测，具有较好的灵敏度和选择性。本发明实施例的检测三聚氰胺的方法使用金银复合纳米粒子溶液，可快速、简便的检测三聚氰胺。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例3制得的A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的金银复合纳米粒子溶液、制备工艺及检测三聚氰胺的方法进行具体说明。

本发明实施例提供一种金银复合纳米粒子溶液的制备工艺，其包括以下步骤：

S1.称取柠檬酸钠和三水合四氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)溶解于水中，剧烈搅拌，得到第一溶液，第一溶液中柠檬酸钠的浓度为0.07-0.077g/L，优选为0.0735g/L；第一溶液中三水合四氯金酸的浓度为0.95-0.112g/L，优选为0.0985g/L。其中配制第一溶液的具体方法是：称取柠檬酸钠和三水合四氯金酸溶解于水中，采用磁力搅拌器，在55-60转/min的条件下搅拌20-30min，实现剧烈搅拌，得到第一溶液。

称取硼氢化钠，用冰水配制成第二溶液，第二溶液中硼氢化钠的浓度为0.08-0.12mol/L，优选为0.1mol/L。

将第二溶液加入到第一溶液中，第一溶液和第二溶液的体积比为80-120:1，优选为100:1，得到第三溶液，即金纳米粒子溶液，第三溶液为棕红色，表明Au NPs种子生成。

S2.称取硝酸银(AgNO₃)和柠檬酸钠溶解于水中，得到第四溶液，第四溶液中硝酸银的浓度为0.1-0.3g/L，优选为0.2g/L，柠檬酸钠的浓度为0.4-0.8g/L，优选为0.6g/L。

将第三溶液在1-2s内加入到量取的第四溶液中，得到第五溶液，第三溶液和第四溶液的体积比为2-4:50，优选为3:50。

S3.量取抗坏血酸，并将抗坏血酸在8-12min内逐滴加入到量取的第五溶液中，抗坏血酸和第五溶液的体积比为10:50-56，优选为10:53，滴加完毕后继续搅拌0.6-1.5h，优选搅拌1h，得到棕黄色的金银复合纳米粒子溶液。

抗坏血酸加入第五溶液的速度与金银复合纳米粒子的均匀性有着密切关系，只有在10分钟左右逐滴加入抗坏血酸，所得金银复合纳米粒子中的金银复合纳米粒子尺寸均匀，反之，若抗坏血酸一次性急速加入，则金银复合纳米粒子尺寸会不一。

本发明实施例还提供一种金银复合纳米粒子溶液，采取上述金银复合纳米粒子溶液的制备工艺制得。

本实施例中，采用紫外-可见分光光谱仪分别对第三溶液(金纳米粒子溶液)和金银复合纳米粒子溶液进行紫外可见分光光谱分析，发现：第三溶液为棕红色/酒红色，在520nm处存在吸收峰；而金银复合纳米粒子溶液呈棕黄色/深黄色，在400nm处存在吸收峰，与纯银纳米粒子溶液的吸收峰值相似。

另外，为了研究金银复合纳米粒子溶液中的金银复合纳米粒子的生长过程，采用紫外-可见分光光谱仪对制备过程中的溶液的吸收光谱进行监测，结果表明，在抗坏血酸加入到第五溶液的瞬间，溶液在520nm处的吸收峰(第三溶液的特征峰)消失，而在400nm处出现新的吸收峰，表明其中有金银复合纳米粒子的生成。这是柠檬酸钠作为表面保护剂，抗坏血酸为强还原剂，第三溶液中的金纳米粒子做晶种，能迅速将硝酸银的银离子还原为纳米银，随着反应的进行，纳米银不断长大，直到形成金银复合纳米粒子，导致溶液在400nm的吸收峰值越来越高，在反应1h后达到最大值并不再变化，表明反应已经完全结束。

进一步地，为了测试金银复合纳米粒子溶液对不同浓度的三聚氰胺的作用规律，首先量取0.2mL金银复合纳米粒子溶液，加入不同量的三聚氰胺，混合均匀后，静置10分钟，再加一定量的去离子水稀释，形成不同浓度的三聚氰胺溶液，然后采用紫外-可见分光光谱 仪分别对这些不同浓度的三聚氰胺溶液进行紫外可见分光光谱表征，以及采用透射电子显微镜观察其中的粒子，结果如下：

(1)将三聚氰胺加入到金银复合纳米粒子溶液后，溶液颜色发生了显著改变，从最初的棕黄色变为深黄色，而且随着三聚氰胺浓度的增大，颜色变为黑黄色。

(2)用金纳米粒子做晶种的方法制备金银复合纳米粒子，第三溶液(金纳米粒子溶液)中金纳米粒子的尺寸约为4nm，金银复合纳米粒子溶液中的金银复合纳米粒子分布均匀，粒子尺寸约为13nm，大小均匀，球形规则，加入三聚氰胺后，金银复合纳米粒子发生聚集，且聚集程度很高，说明三聚氰胺可导致了复合粒子的聚集。

(3)随着三聚氰胺的加入，金银复合纳米粒子溶液在400nm的吸收峰降低，并且随着三聚氰胺溶液浓度的增大，在400nm的吸收峰逐渐降低，同时在636nm出现一个新的吸收峰。在400nm的吸收值A₄₀₀代表单分散的金银复合纳米粒子，而636nm的吸收值A₆₃₆代表聚集的金银复合纳米粒子，因此，A₆₃₆/A₄₀₀代表聚集的纳米粒子与单分散的纳米粒子数目之比，而A₆₃₆/A₄₀₀与三聚氰胺的浓度之间呈线性关系，可得到A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图。

在上述结论的基础上，本发明实施例还提供一种采用上述金银复合纳米粒子溶液检测三聚氰胺的方法，其包括以下步骤：

M、绘制A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图：

M1、分别量取至少5份0.1-0.5mL的金银复合纳米粒子溶液，将每份金银复合纳米粒子溶液分别加入1mL去离子水中，并加入不同量的三聚氰胺，混合均匀后，静置8-12分钟，形成不同浓度的三聚氰胺溶液；

M2、采用紫外-可见分光光谱仪分别对不同浓度的三聚氰胺溶液进行紫外可见分光光谱分析，测试不同浓度的三聚氰胺溶液在400nm 的紫外光吸收值A₄₀₀，在636nm的紫外光吸收值A₆₃₆，计算不同浓度的三聚氰胺溶液对应的A₆₃₆/A₄₀₀，根据不同浓度的三聚氰胺溶液的浓度与对应的A₆₃₆/A₄₀₀，制得A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图。

N、检测三聚氰胺：

N1、按体积比1-5:10，量取金银复合纳米粒子溶液和去离子水，混合得到检测溶液；

N2、将待测样品加入检测溶液中，混合均匀后，室温下放置10-15min，得到待测溶液；以及

N3、采用紫外-可见分光光谱仪对待测溶液进行紫外可见分光光谱分析，测试待测溶液在400nm的吸收值A₄₀₀，以及在636nm处的紫外光吸收值A₆₃₆，根据A₆₃₆/A₄₀₀值，对照A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺的标准浓度曲线图，即可得到待测溶液中三聚氰胺的浓度。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种金银复合纳米粒子溶液，按照以下方法制备得到。

步骤1、金纳米粒子溶液的制备：

将1.4mg柠檬酸钠和1.9mgHAuCl₄·3H₂O溶解在20mL水中，剧烈搅拌，得到第一溶液；用冰水配制0.08mol/L的NaBH₄溶液，即为第二溶液；

将0.25mL新鲜的第二溶液加入到上述第一溶液中，溶液变成棕红色，表明Au NPs种子生成，得到金纳米粒子溶液(第三溶液)。

步骤2、金银复合纳米粒子溶液：

将5mgAgNO₃和20mg柠檬酸钠溶解于50mL水中，得到第四溶液；

将2mL金纳米粒子溶液迅速加入到第四溶液中，得到第五溶液；

将10mL(30mg)抗坏血酸在8分钟内，逐滴加入到上述第五溶液中，加完后继续搅拌1h，得到棕黄色的金银复合纳米粒子溶液。

实施例2

本实施例提供一种金银复合纳米粒子溶液，按照以下方法制备得到。

步骤1、金纳米粒子溶液的制备：

将1.54mg柠檬酸钠和2.24mgHAuCl₄·3H₂O溶解在20mL水中，剧烈搅拌，得到第一溶液；用冰水配制0.12mol/L的NaBH₄溶液，即为第二溶液；

将0.17mL新鲜的第二溶液加入到上述第一溶液中，溶液变成棕红色，表明Au NPs种子生成，得到金纳米粒子溶液(第三溶液)。

步骤2、金银复合纳米粒子溶液：

将15mgAgNO₃和40mg柠檬酸钠溶解于50mL水中，得到第四溶液；

将4mL金纳米粒子溶液迅速加入到第四溶液中，得到第五溶液；

将10mL(30mg)抗坏血酸在12分钟内，逐滴加入到上述第五溶液中，加完后继续搅拌1h，得到棕黄色的金银复合纳米粒子溶液。

实施例3

本实施例提供一种金银复合纳米粒子溶液，按照以下方法制备得到，所用的玻璃仪器都经过王水浸泡，超声器清洗，烘干备用。

步骤1、金纳米粒子溶液的制备：

将1.47mg柠檬酸钠和1.97mgHAuCl₄·3H₂O溶解在20mL水中，剧烈搅拌，得到第一溶液；用冰水配制0.1mol/L的NaBH₄溶液，即为第二溶液；

将0.2mL新鲜的第二溶液加入到上述第一溶液中，溶液变成棕红色，表明Au NPs种子生成，得到金纳米粒子溶液(第三溶液)。

步骤2、金银复合纳米粒子溶液：

将10mgAgNO₃和30mg柠檬酸钠溶解于50mL水中，得到第四溶液；

将3mL金纳米粒子溶液迅速加入到第四溶液中，得到第五溶液；

将10mL(30mg)抗坏血酸在10分钟内，逐滴加入到上述第五溶液中，加完后继续搅拌1h，得到棕黄色的金银复合纳米粒子溶液。

采用本实施例的金银复合纳米粒子溶液检测三聚氰胺，过程如下：

绘制A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图：

分别量取12份0.2mL的金银复合纳米粒子溶液，将每份金银复合纳米粒子溶液分别加入1mL去离子水中，并加入不同量的三聚氰胺，混合均匀后，静置10分钟，形成不同浓度的三聚氰胺溶液；

采用紫外-可见分光光谱仪分别对不同浓度的三聚氰胺溶液进行紫外可见分光光谱分析，测试不同浓度的三聚氰胺溶液在400nm的紫外光吸收值A₄₀₀，在636nm的紫外光吸收值A₆₃₆，计算不同浓度的三聚氰胺溶液对应的A₆₃₆/A₄₀₀，根据不同浓度的三聚氰胺溶液的浓度与对应的A₆₃₆/A₄₀₀，制得A₆₃₆/A₄₀₀对三聚氰胺浓度的标准曲线图，如图1所示，对三聚氰胺(Melamine)的检测限为0.025mM(mmol/L)，检测范围为0.083mM-2.04mM，具有较好的选择性。

检测三聚氰胺：

量取1mL金银复合纳米粒子溶液和去离子水，混合得到检测溶液，将0.1g待测样品加入检测溶液中，混合均匀后，室温下放置13min，得到待测溶液；

采用紫外-可见分光光谱仪对待测溶液进行紫外可见分光光谱分析，测试待测溶液在400nm的吸收值A₄₀₀，以及在636nm处的紫外光吸收值A₆₃₆，根据A₆₃₆/A₄₀₀值，对照三聚氰胺的标准浓度曲线图，即可得到待测溶液中三聚氰胺的浓度。

综上所述，本发明实施例的金银复合纳米粒子溶液，其中的金银复合纳米粒子在三聚氰胺的作用下聚集，从而实现对三聚氰胺的快速、简便检测，具有较好的灵敏度和选择性；本发明实施例的金银复合纳米粒子溶液的制备工艺，工艺简单，制得的金银复合纳米粒子粒度均匀，可用于快速、简便的检测三聚氰胺；本发明实施例的的检测三聚氰胺的方法，可快速、简便的检测三聚氰胺，对于拓宽金银复合纳米粒子的制备途径及其在传感检测方面的应用范围均具有理论和实际意义。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。