一种基于核磁共振技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于核磁共振技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法及其应用。本发明的方法是对待测患者脑脊液进行核磁共振检测，分别得到3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm和2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量，再根据差异代谢产物的相对表达量大小区分待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者。与传统方法相比，本发明的方法具有样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、重复性好、成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于核磁共振技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法及其应用，特别涉及一种基于脑脊液核磁共振代谢组学技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法及其应用。

背景技术

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是由结核分枝杆菌感染引起的一种神经系统结核病。TBM约占活动性结核病的1％，但却是病情最严重的结核病类型，其死亡率可高达60％，幸存者常伴有严重的残疾和神经系统后遗症。

TBM的早期诊断和及时的抗结核治疗是提高生存率、降低并发症的关键，但目前仍缺乏有效的诊断方法。TBM临床表现错综复杂、无特征性表现，脑脊液常规检查和生化检查缺乏特异性。目前病原学检测仍是TBM诊断金标准，但脑脊液涂片染色镜检阳性率仅0-20％；液体培养法能略提高阳性率，但耗时太长(需2-6周)，且需要专门的生物安全三级实验室；最新的基于实时PCR的Xpert MTB/RIF技术敏感性比涂片镜检显著提高，但其高昂的费用以及在利福平耐药低流行地区存在较高的假阳性限制了它的广泛应用。在TBM免疫学诊断方面，血清学检测一直准确性较差，脑脊液γ干扰素释放实验(Interferon-gamma release assays，IGRAs)则需要样本量大且敏感性不高(50-70％)。因此，有效诊断方法的缺乏使得TBM在诊断过程中常常需要排除其他类型的脑膜炎，如细菌性脑膜炎、真菌性脑膜炎(以隐球菌性脑膜炎为主)、病毒性脑膜炎(viral meningitis，VM)等。目前细菌性脑膜炎和隐球菌性脑膜炎已经有了快捷有效的诊断方法，而VM确诊存在一定困难，并且和TBM有相似的脑脊液表现，如脑脊液外观清亮，常规细菌培养阴性，白细胞计数正常，细胞数增多以单核细胞为主等，因此目前仍需要寻找能够鉴别TBM和VM的方法或标志物。

代谢组学技术是一种相对较新的组学技术，可以用来鉴定和定量特定生物系统内所有的小分子。最近该技术已被用于糖尿病、肝癌、麻风病、多发性硬化症等疾病特异性分子标志物的鉴定。与功能常受表观遗传修饰和调节的基因、mRNA和蛋白质不同，代谢产物是细胞代谢生化活动最直接和最终的信号，与疾病相关的特定代谢途径或代谢产物更有潜力开发用于早期诊断。目前常用的高通量代谢产物检测平台主要有质谱技术和核磁共振技术两种。前者灵敏度较高，但缺点在于样本需要前处理和离子化、具有基质效应、可供确定化合物的数据库有限等。核磁共振技术灵敏度略低，但具有样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、重复性好、成本低等优点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于诊断待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者的系统。

本发明提供的用于诊断待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者的系统包括参数采集设备和具有如下数据处理功能的数据处理装置：

将利用核磁共振检测的待测患者脑脊液的结果进行分析，根据如下标准输出结论：若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为15.5-61.5，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为214.2-442.6，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0.7-5.8，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-2.4，则所述待测患者为或候选为结核性脑膜炎患者；

若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为70.0-120.1，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为42.3-186.1，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0-3.0，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-0.5，则所述待测患者为或候选为病毒性脑膜炎患者；

所述参数采集设备包括检测待测患者脑脊液中3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm和2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量时使用的设备和/或试剂。

本发明的第二个目的是提供一种用于诊断待测患者是否为结核性脑膜炎患者的系统。

本发明提供的用于诊断待测患者是否为结核性脑膜炎患者的系统包括参数采集设备和具有如下数据处理功能的数据处理装置：

将利用核磁共振检测的待测患者脑脊液的结果进行分析，根据如下标准输出结论：若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为15.5-61.5，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为214.2-442.6，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0.7-5.8，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-2.4，则所述待测患者为或候选为结核性脑膜炎患者；否则，所述待测患者不为或候选不为结核性脑膜炎患者；

所述参数采集设备包括检测待测患者脑脊液中3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm和2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量时使用的设备和/或试剂。

本发明的第三个目的是提供一种用于诊断待测患者是否为病毒性脑膜炎患者的系统。

本发明提供的用于诊断待测患者是否为病毒性脑膜炎患者的系统包括参数采集设备和具有如下数据处理功能的数据处理装置：

将利用核磁共振检测的待测患者脑脊液的结果进行分析，根据如下标准输出结论：若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为70.0-120.1，且 3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为42.3-186.1，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0-3.0，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-0.5，则所述待测患者为或候选为病毒性脑膜炎患者；否则，所述待测患者不为或候选不为病毒性脑膜炎患者；

所述参数采集设备包括检测待测患者脑脊液中3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm和2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量时使用的设备和/或试剂。

本发明的第四个目的是提供上述用于诊断待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者的系统的使用方法。

本发明提供的用于诊断待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者的系统的使用方法包括如下步骤：

(1)对待测患者脑脊液进行核磁共振检测，分别得到3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量；

(2)根据所述相对表达量，按照如下方法区分待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者：

若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为15.5-61.5，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为214.2-442.6，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0.7-5.8，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-2.4，则所述待测患者为或候选为结核性脑膜炎患者；

若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为70.0-120.1，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为42.3-186.1，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0-3.0，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-0.5，则所述待测患者为或候选为病毒性脑膜炎患者。

本发明的第五个目的是提供上述用于诊断待测患者是否为结核性脑膜炎患者的系统的使用方法。

本发明提供的用于诊断待测患者是否为结核性脑膜炎患者的系统的使用方法包括如下步骤：

(1)对待测患者脑脊液进行核磁共振检测，分别得到3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量；

(2)根据所述相对表达量，按照如下方法判断待测患者是否为结核性脑膜炎患者：

若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为15.5-61.5，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为214.2-442.6，且3.05ppm化 学位移代表的腐胺的相对表达量为0.7-5.8，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-2.4，则所述待测患者为或候选为结核性脑膜炎患者；否则，所述待测患者不为或候选不为结核性脑膜炎患者。

本发明的第六个目的是提供上述用于诊断待测患者是否为病毒性脑膜炎患者的系统的使用方法。

本发明提供的用于诊断待测患者是否为病毒性脑膜炎患者的系统的使用方法包括如下步骤：

(1)对待测患者脑脊液进行核磁共振检测，分别得到3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量；

(2)根据所述相对表达量，按照如下方法判断待测患者是否为病毒性脑膜炎患者：

若待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为70.0-120.1，且3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为42.3-186.1，且3.05ppm化学位移代表的腐胺的相对表达量为0-3.0，且2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-0.5，则所述待测患者为或候选为病毒性脑膜炎患者；否则，所述待测患者不为或候选不为病毒性脑膜炎患者。

上述系统或方法中，所述相对表达量通过如下方法获得：对待测患者脑脊液进行核磁共振检测，分别得到3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的峰下面积；根据每个化学位移的峰下面积，分别计算得到每个化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量。

上述系统或方法中，所述核磁共振检测采用驰豫编辑脉冲序列(CPMG脉冲序列)(–RD–90–(–180–)n–ACQ)采集待测患者脑脊液样本的数据，观测脑脊液中的小分子代谢产物。其中，CPMG实验的谱宽为8000Hz，采样点数32k，采样时间2s，累加次数64次，为400s，2n为320ms，弛豫延迟为2s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。

本发明的第七个目的是提供检测待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量的物质的新用途。

本发明提供了检测待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量的物质在如下1)-3)中任一种中的应用：

1)制备用于诊断待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者的产品；

2)制备用于诊断待测患者是否为结核性脑膜炎患者的产品；

3)制备用于诊断待测患者是否为病毒性脑膜炎患者的产品。

上述应用中，所述检测待测患者脑脊液中3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量的物质包括利用核磁共振方法检测待测患者脑脊液中3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm和2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量时使用的设备和/或试剂。

本发明的第八个目的是提供3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸作为标志物的新用途。

本发明提供了3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸作为标志物在诊断待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者中的应用。

本发明提供了一种基于脑脊液核磁共振代谢组学技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法。本发明的方法是对待测患者脑脊液进行核磁共振检测，分别得到3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm、2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量，再根据差异代谢产物的相对表达量大小区分待测患者为结核性脑膜炎患者还是病毒性脑膜炎患者。与传统方法相比，本发明的方法具有样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、重复性好、成本低等优点。

附图说明

图1为TBM和VM典型的脑脊液600.13MHz HNMR图谱。图1A为TBM典型的脑脊液600.13MHz HNMR图谱；图1B为VM典型的脑脊液600.13MHz HNMR图谱。

图2为TBM和VM HNMR图谱的多元统计学分析。图2A为PCA模型得分图；图2B为OSC-PLS-DA模型得分图；图2C为PCA模型载荷图；图2D为OSC-PLS-DA模型载荷图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中实验设备：INOVA 600MHz超导核磁共振谱仪购自美国瓦里安公司，配备脉冲场梯度，带梯度场的三共振探头；离心机购自德国Eppendorf MiniSpinPlus。

下述实施例中实验试剂：重水(D₂O)购自美国CIL公司；3-三甲基硅烷基-2,2,3,3- 四氘代丙酸钠(TSP)购自德国Merck公司。

实施例1、一种基于脑脊液HNMR技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法

1、脑脊液样本收集与处理

(1)常规留取20例结核性脑膜炎(TBM)患者和19例病毒性脑膜炎(VM)患者的脑脊液(脑脊液来源于首都医科大学附属北京胸科医院，所有患者均经临床诊断确定，且患者知情)，4℃，2000g离心10min，0.22μm滤膜过滤后分装-80℃保存。

(2)实验前将脑脊液样本室温融化，4℃，13000g离心10min，得到离心后的脑脊液。

(3)将离心后的脑脊液、50μl的TSP重水溶液(TSP浓度为1mg/ml)和200μlD₂O在核磁共振管中混匀，得到待检测的脑脊液。

2、HNMR检测和数据收集

(1)向离心管中分别依次加入100μl TSP重水溶液(TSP浓度为1mg/ml)，200μl磷酸盐缓冲液(0.2M)，以及300μl的待检测的脑脊液样本，充分震荡混匀后，13,000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清液，并将上清液加入5mm核磁共振管中待用。

(2)分别采用驰豫编辑脉冲序列(CPMG脉冲序列)(–RD–90–(–180–)n–ACQ)采集脑脊液样本的数据，分别观测脑脊液中的小分子代谢产物。CPMG实验的谱宽为8000Hz，采样点数32k，采样时间2s，累加次数64次，为400s，2n为320ms，弛豫延迟为2s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。以乳酸甲基信号双峰的左侧峰定为1.33。在对自由感应衰减(free induction decay，FID)信号数据进行填零，加上0.5Hz的线增宽因子后进行傅立叶变换转得HNMR图谱(如图1所示，图1A为TBM典型的脑脊液600.13MHz HNMR图谱；图1B为VM典型的脑脊液600.13MHz HNMR图谱)。

3、核磁共振谱多元统计学分析

将数据输入SIMCA-P+软件(v10.04,Umet图rics,Sweden)进行多元统计分析。数据采用平均中心化(mean centering)或Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理之后采用PCA分析。为强化组间差异，进一步采用Orthogonal signalcorrection-partial least squares discriminant analysis(OSC-PLS-DA)分析。分析结果以得分图(scores plot)和载荷图(loadings plot)的形式表示。

TBM和VM的HNMR图谱的多元统计学分析结果如图2所示。其中，图2A为PCA模型得分图；图2B为OSC-PLS-DA模型得分图；图2C为PCA模型载荷图；图2D为OSC-PLS-DA模型载荷图。

4、差异代谢产物的鉴定

满足VIP值>1和p<0.05的化学位移通过文献报道和人类代谢组数据库(http://www.hmdb.ca/)，得出差异化学位移的物质归属，最终鉴定得到4个差异代谢产物，如表1所示。其中，每一个化学位移都对应一个峰下面积，根据峰面积计算得到每一个差异化学位移对应的TBM组均值和VM组均值(均值表示化学位移所代表的差异代谢产物在脑脊液中的相对表达量)，并根据TBM组均值和VM组均值计算倍数变化：倍数＝TBM组均值/VM组均值。

表1、TBM和VM脑脊液的差异代谢产物及其在脑脊液中的相对表达量

根据表1中的4个差异代谢产物建立了如下区分待测患者为结核性脑膜炎患者和病毒性脑膜炎患者的方法：

对待测患者脑脊液进行核磁检测，分别得到3.50ppm化学位移代表的葡萄糖、3.76ppm化学位移代表的L-谷氨酰胺、3.05ppm化学位移代表的腐胺和2.79ppm化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量；

若3.50ppm的化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为15.5-61.5，且3.76ppm的化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为214.2-442.6，且3.05ppm的化学位移代表的腐胺的相对表达量为0.7-5.8，且2.79ppm的化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-2.4，则待测患者为或候选为结核性脑膜炎患者；

若3.50ppm的化学位移代表的葡萄糖的相对表达量为70.0-120.1，且3.76ppm的化学位移代表的L-谷氨酰胺的相对表达量为42.3-186.1，且3.05ppm的化学位移代表的腐胺的相对表达量为0-3.0，且2.79ppm的化学位移代表的天冬氨酸的相对表达量为0-0.5，则待测患者为或候选为病毒性脑膜炎患者。

实施例2、区分待测患者为结核性脑膜炎患者和病毒性脑膜炎患者的方法的验证

常规留取1例结核性脑膜炎(TBM)患者和1例病毒性脑膜炎(VM)患者的脑脊液(脑脊液来源于首都医科大学附属北京胸科医院，所有患者均经临床诊断确定，且患者知情)，按照根据实施例1中的基于脑脊液HNMR技术区分结核性脑膜炎和病毒性脑膜炎的方法，分别对上述结核性脑膜炎(TBM)患者和病毒性脑膜炎(VM) 患者的脑脊液进行核磁检测，分别得到3.50ppm、3.76ppm、3.05ppm和2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物的相对表达量。

检测结果表明：结核性脑膜炎(TBM)患者在3.50ppm的化学位移代表的差异代谢产物(葡萄糖)的相对表达量为40.2，且3.76ppm的化学位移代表的差异代谢产物(L-谷氨酰胺)的相对表达量均为345.7，且3.05ppm的化学位移代表的差异代谢产物(腐胺)的相对表达量为2.6，且2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物(天冬氨酸)的相对表达量为0.9。

病毒性脑膜炎(VM)患者在3.50ppm的化学位移代表的差异代谢产物(葡萄糖)的相对表达量为109.3，且3.76ppm的化学位移代表的差异代谢产物(L-谷氨酰胺)的相对表达量为96.6，且3.05ppm的化学位移代表的差异代谢产物(腐胺)的相对表达量为2.1，且2.79ppm的化学位移代表的差异代谢产物(天冬氨酸)的相对表达量为0.2。

上述检测结果均与实施例1中的区分待测患者为结核性脑膜炎患者和病毒性脑膜炎患者的方法中的表述一致，说明本发明的区分待测患者为结核性脑膜炎患者和病毒性脑膜炎患者的方法准确，可以用于区分待测患者为结核性脑膜炎患者和病毒性脑膜炎患者。同时本发明的方法也可用于鉴定待测患者是否为结核性脑膜炎患者，或鉴定待测患者是否为病毒性脑膜炎患者。