一种兼性自养型硫氧化反硝化根瘤菌F43b及其应用

摘要

本发明公开了一种兼性自养型硫氧化反硝化根瘤菌F43b及其应用。根瘤菌(Rhizobium sp.)F43bT于2016年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2016158。本发明的根瘤菌(Rhizobium sp.)F43bT为具有硫氧化反硝化功能的兼性自养根瘤菌，能同时去除污染水体或沉积物中的COD、硝酸盐和硫化物，实现污染水体或沉积物处理中碳氮硫共去除，为河道修复和碳氮硫废水处理提供菌种和微生物制剂，同时，该根瘤菌的研究将为其应用于河道修复和碳氮硫去除提供理论指导。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种兼性自养型硫氧化反硝化根瘤菌F43b及其应用。

背景技术：

在厌氧环境中，由于缺乏充足的氧气做电子受体，有机物往往难被氧化去除。同时由于硫酸盐的进入，为硫酸盐还原菌(SRB)提供了条件，这些SRB能利用有机物做能源和碳源，硫酸盐做电子受体而大量繁殖。虽然能去除部分的有机物，但硫酸盐还原也会产生大量的硫化物。这些硫化物不仅是水体发黑发臭的重要原因，还具有生物毒害性和腐蚀性，会危害水体生物健康，导致生物多样性减少，进而使环境更加恶化。

硝酸盐作为一种电子受体，是厌氧环境修复较理想的微生物促生剂。虽然硝酸盐是水体污染物的一种，并且会对人类健康造成危害。但在厌氧条件下，硝酸盐能通过反硝化作用，接受有机物、S^2-、S⁰、S₂O₃^2-和AVS等还原性物质氧化产生的电子，从而实现碳氮硫的共去除。但是，在厌氧条件下，一些微生物还能通过另外一条途径，即硝酸盐异化还原成铵(DNRA)，将硝酸盐还原生成氨氮，加重污染的程度。硫氧化反硝化细菌是一类在自然环境中分布广泛的微生物，该类型的微生物厌氧条件下，能利用硝酸盐和亚硝酸盐等作为电子受体，通过反硝化作用将硝酸盐还原生成氮气，同时将硫化物、单质硫以及硫代硫酸盐等氧化，生成单质硫或者硫酸盐。能进行硫氧化反硝化的细菌有两种类型，一种是严格自养型的硫氧化反硝化细菌，只能在无机环境中存活，在有机物存在的条件下会受到抑制。另一种是兼性自养的硫氧化反硝化细菌，能同时利用有机物和还原性含硫化合物作为电子供体进行反硝化。研究发现，异养反硝化细菌能在一定程度上与硫酸盐还原菌竞争有机物，从而抑制硫酸盐还原作用。在厌氧水体或者沉积物中加入这些兼性硫氧化反硝化细菌，一方面、这些细菌通过自身的代谢作用，将有机物、硫化物和硝酸盐同步去除；另一方面、这些微生物在水体或沉积物中形成一定优势，对硫酸盐还原菌和具有DNRA功能的细菌产生抑制作用，抑制硫化物和氨氮的生成。

目前分离得到的兼性自养硫氧化反硝化细菌有十几多种，分别位于变形菌门的不同菌属中。但是，在根瘤菌属(Rhizobium)中，并没有发现具有兼性自养硫氧化反硝化功能的菌株。大多数根瘤菌只能利用有机物进行反硝化，没有硫氧化的功能，如Rhizobium rosettiformans和Rhizobium skierniewicense等等。而根瘤菌属(Rhizobium)88多个的菌种中，大部分是分离于植物根瘤的共生菌，也有少数在土壤、岩石和反应器中分离得到。而在沉积物中，由ShinichiKaiya在多氯二恶英的微环境中分离得到一株，命名为Rhizobium naphthalenivorans，但没有硫氧化和反硝化功能。因此，寻找一种能在有机物存在的条件下进行硫氧化反硝化作用的菌株，对这些菌株进行分离鉴定，将为河道修复和碳氮硫废水处理提供菌种和微生物制剂。并且，这些菌株的研究将为其应用于河道修复和碳氮硫去除提供理论指导。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种具有硫氧化反硝化功能的兼性自养根瘤菌(Rhizobiumsp.)F43b^T，该细菌于2016年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC>

本发明的第二个目的是提供了根瘤菌(Rhizobium>T在去除碳氮硫中的应用。

优选，根瘤菌(Rhizobium>T在去除污染水体、污染沉积物或污染土壤中的碳氮硫中的应用。

进一步优选，根瘤菌(Rhizobium>T在去除污染水体、污染沉积物或污染土壤中的COD、硝酸盐和/或硫化物中的应用。

研究发现，在某受电子垃圾污染的珠三角河道沉积物中，存在着一定丰度的位于根瘤菌属(Rhizobium)的细菌。本发明通过对广东顺德容桂某电子垃圾处理区河床底泥进行富集培养、分离和纯化得到根瘤菌(Rhizobium>T，为根瘤菌属的一个新种，命名为根瘤菌(Rhizobium>T。

本发明的根瘤菌(Rhizobium>T为具有硫氧化反硝化功能的兼性自养根瘤菌，能同时去除污染水体或沉积物中的COD、硝酸盐和硫化物，实现污染水体或沉积物处理中碳氮硫共去除，为河道修复和碳氮硫废水处理提供菌种和微生物制剂，同时，该根瘤菌的研究将为其应用于河道修复和碳氮硫去除提供理论指导。

根瘤菌(Rhizobium>T于2016年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC>

附图说明：

图1是根瘤菌(Rhizobium>T的透射电镜图和扫描电镜图，A为透射电镜图；B为扫描电镜图；

图2是根瘤菌(Rhizobium>T进行硫氧化反硝化作用时的硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和硫酸盐硫浓度随时间变化曲线，其中CK代表空白对照组，W3代表Rhizobium>T处理组，L61代表Rhizobium>T处理组，F43b代表根瘤菌(Rhizobium>T处理组；

图3是根瘤菌(Rhizobium>T在有机厌氧条件下进行硫氧化反硝化作用时硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和硫酸盐硫的浓度直方图，其中CK代表空白对照组，W3代表Rhizobiumrosettiformans>T处理组，L61代表Rhizobium>T处理组，F43b代表根瘤菌(Rhizobium>T处理组；

图4是根瘤菌(Rhizobium>T在好氧条件下进行硫氧化作用时硝酸盐氮、硫酸盐硫和乙酸钠的浓度直方图，其中CK代表空白对照组，W3代表Rhizobium rosettiformans>T处理组，L61代表Rhizobium>T处理组，F43b代表根瘤菌(Rhizobium>T处理组。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：根瘤菌(Rhizobium>T的分离和鉴定

将取样于广东省顺德容桂某电子垃圾处理区河床底泥10g，去除残渣和大颗粒后，用无菌水洗涤并离心三次，收集到已灭菌处理的120mL顶空瓶中，加入100mL富集培养基(NH₄Cl0.5g，MgCl₂·6H₂O>2PO₄>2S₂O₃·5H₂O>3>3>4·7H₂O0.1g，去离子水1000mL，pH自然，121℃高压灭菌20min；其中，NaHCO₃过滤除菌，MgCl₂·6H₂O、KH₂PO₄和FeSO4·7H₂O单独配置母液灭菌，冷却后按浓度要求添加；固体培养基加入20g/L琼脂)，压上顶空瓶盖子后，于厌氧箱30℃静置培养。一个月后，将培养物摇匀，取20mL培养物8000g离心后，将沉淀接到新的100mL富集培养基中。以此重复两遍。将富集培养物通过稀释涂平板的方法在固体培养基(富集培养基)上涂布，将涂布好的平板置于厌氧箱30℃倒置培养四周后，在10^-6稀释的平板上取得单菌落F43b^T，进一步通过液体培养基和划线的方法对菌株F43b^T进行纯化，没有发现附生菌株。

菌株F43b^T的形态和生理生化特征：菌株F43b^T在富集培养基上，30℃厌氧培养四周后，菌落较小，呈圆形，突起，白色，半透明，有金属光泽，表明光滑，边缘整齐，直径约0.5mm，革兰氏阴性。如图1所示，在透射电镜和扫描电镜下观察可知该菌的菌体呈1.0-2.0μm长，0.6-0.8μm宽的杆状形态，无鞭毛。在根瘤菌通用培养基DSMZ-Medium>2CO₃ 0.2g，去离子水200.0mL，121℃高压灭菌1h，冷却后离心取上清；固体培养基加入20g/L琼脂)上生长速度较快，菌落较大，直径由2mm到10mm不等，菌落呈白黄色，表面产生凝胶状的多糖物质。该菌在好氧和厌氧条件下都能生长，生长温度为20～42℃，最适合生长温度为37℃，生长pH为6.0～9.0，最适生长pH为7.5，耐盐度为3.5％。通过Biology GenIII Microplate进行生化鉴定，发现能利用多种碳源，包括多种糖类、氨基酸、有机酸、醇等，如乙酸钠、葡萄糖和甘露醇等。结果与Rhizobium rosettiformans>T最为相似。

根瘤菌(Rhizobium>T的分子分类鉴定。按照常规方法提取菌株F43b^T的总DNA，以菌株F43b^T的总DNA为模板，采用16S>T的16S rRNA基因序列与Rhizobium rosettiformans>T的序列相似度最高(97.7％)，与Rhizobium>T次之(97.5％)。再通过引物343F：5’-TTCGACCAGAAYTCCTAYAAGG-3’(如SEQ ID NO.6所示)和1043R：5’-AGCTTGTCCTTSGTCTGCG-3’(如SEQ ID NO.7所示)扩增其gyrB看家基因，PCR体系为：10×PCR buffer 2.5μL，10.0mmol/L dNTP 2.0μL，10.0pmol/μL 343F引物1.0μL，10.0pmol/μL 1043R引物1.0μL，2.5U/μL Taq酶0.3μL，去离子水补足25.0μL。PCR程序为：95℃预变性5min后，94℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸1.5min，30个反应循环后，72℃延伸10min。通过BLAST程序与GenBank中的序列比对，并用DNAman程序分析相似性，得到的序列(具体如SEQ ID NO.8所示)与根瘤菌属中公认的模式菌种的相似度最高，且在75-82.2％的范围，其中与Rhizobium rosettiformans>T的相似度为82.0％，与Rhizobium>T为80.4％。

用根瘤菌通用培养基DSMZ-Medium 98(即根瘤菌培养基：酵母提取物1g，10g甘露醇，200.0mL土壤提取液，800.0mL去离子水，其中土壤提取液配方为：80.0g干燥花园土，0.2g Na₂CO₃，200.0mL去离子水，121℃高压灭菌1h，冷却后离心取上清)，对菌株F43b^T及模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和Rhizobium>T进行培养，分别收集1.5L菌液，用无菌水洗涤三次后按照常规方法提取基因组总DNA，加入0.1×SSC缓冲液溶解DNA，以0.1×SSC缓冲液作参比，调整DNA浓度A₂₆₀为1.5～2.0的范围，且测定A₂₆₀、A₂₃₀和A₂₈₀波长，若比值符合A₂₆₀:A₂₃₀:A₂₈₀＝1:0.450:0.515的比例关系，则可进行下一步操作。将符合要求的DNA置于冰浴中进行超声剪切，程序为：40W超声4次，每次15s，间隔59s。剪切完后再测定DNA的浓度和质量，结果变化不大。将超声剪切好的DNA通过复性速率液相杂交法测定DNA-DNA杂交率，分别取菌株F43b^T和Rhizobium rosettiformans>T的DNA样品500μL于两个10mm比色皿中，各取250μL于第三个比色皿中，且在第四个比色皿加入2×SSC缓冲液作参比，将四个比色皿置于相应的样品槽，99℃变性10min后，在降温过程中加入预热的10×SSC缓冲液500μL到前三个比色皿，并用枪头打匀，在最适复性温度71℃复性45min，记录吸光值OD>260，每隔1min记录一次。在复性区段取5-35min以下式计算复性速率，复性速率(V)＝(5min吸光值-35min吸光值)/30，得到V_F43b^T、V_W3^T和V_M，再通过公式：D％＝[4V_M-(V_F43b^T+V_W3^T)]/2V_F43b^TV_W3^T，最后测得菌株F43b^T与模式菌株Rhizobium rosettiformans>T的全基因组DNA-DNA杂交率为37.9％。以同样的方法测得菌株F43b^T与模式菌株Rhizobium>T的全基因组DNA-DNA杂交率为33.5％。

根瘤菌(Rhizobium>T的分子分类地位：该菌的16rRNA基因序列如SEQ ID NO.5所示，通过BLAST程序与GenBank中的序列比对，并用DNAman程序分析相似性，结果与Rhizobium rosettiformans>T序列相似度最高(97.7％)，与Rhizobium>T次之(97.5％)。扩增其gyrB基因，序列如SEQ ID NO.6所示，通过BLAST程序与GenBank中的序列比对，并用DNAman分析相似性，结果与Rhizobium菌属中已有的gyrB基因序列相似度最高，且在75-82.2％的范围，其中与Rhizobium rosettiformans>T的相似度为82.0％，与Rhizobiumdaejeonense>T为80.4％。通过复性速率液相杂交法测定得，菌株F43b^T与模式菌株Rhizobiumrosettiformans>T及Rhizobium>T的全基因组DNA-DNA杂交率分别为37.9％和33.5％。

经过形态学、生理生化和分子分类学的鉴定结果，可以判定菌株F43b^T系属于根瘤菌属(Rhizobium)的一个新种，命名为根瘤菌(Rhizobium>T，于2016年3月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC>

实施例2：根瘤菌(Rhizobium>T在厌氧并自养条件下的硫氧化反硝化功能

将根瘤菌(Rhizobium>T及模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和Rhizobiumdaejeonense>T在根瘤菌培养基上活化，取一定菌量用灭菌处理的富集培养基洗涤三次，分别按蛋白浓度约为100μg/mL的菌液，取100μL接种到已灭菌处理的，含有100mL培养基的120mL顶空瓶中，其中，本实施例的培养基是将实施例1的富集培养基的KNO₃浓度调整为1g/L，培养基其他成分不变，每个菌株设三个重复，设不接菌的空白对照组三个，氮气吹脱后压盖，置于厌氧箱30℃厌氧培养。每隔12h将培养物摇匀一次，分别在0天、2.5天、5天、7.5天、10天和12.5天取样测定，测定指标包括pH、蛋白量、CODcr、NH₄⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N、SO₄^2--S、S₂O₃^2--S和TN。其中，pH由pH/电导率综合仪SevrnMulti测定，蛋白量由考马斯亮蓝G-250孔板法测定，总氮TN由过硫酸钾氧化—紫外分光光度法测定，NH₄⁺–N由纳氏试剂光度法测定，其他指标由离子色谱仪测定。结果如图2所示，菌株F43b^T的NO₃^--N和SO₄^2--S变化显著，在消耗了约5.1mmol/L>3^--N的同时，硫代硫酸盐氧化生成了约9.5mmol/L>4^2--S，硝酸盐消耗没有产生亚硝酸盐的积累，并且总氮也在下降。然而，两个模式菌株Rhizobium>T和Rhizobium>T与空白对照组一样，各项指标浓度没有显著的变化。

由此可见，根瘤菌(Rhizobium>T与两个模式菌株大不相同，模式菌株没有硫氧化反硝化功能，而根瘤菌(Rhizobium>T具有硫氧化反硝化功能。

实施例3：根瘤菌(Rhizobium>T在有机厌氧条件下的硫氧化反硝化功能

将根瘤菌(Rhizobium>T(即菌株F43b^T)及模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和Rhizobium>T在根瘤菌培养基上活化，取一定菌量用无菌水洗涤三次，分别按蛋白浓度约为100μg/mL的菌液，取100μL接种到已灭菌处理的，含有100mL培养基的120mL顶空瓶中，设计三个处理，处理1的培养基是在实施例1的富集培养基中同时添加Na₂S₂O₃·5H₂O>2O>2O>2S·9H₂O>2O>4⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N、SO₄^2--S、S₂O₃^2--S和TN等指标，测定方法与实施例2一致。结果如图3所示，处理1中，模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和菌株F43b^T硝酸盐氮下降，产生亚硝酸盐氮，但是仅菌株F43b^T硫酸盐浓度差异显著，同时其硫酸盐产生量并不消耗那么多的硝酸盐，因此也利用了乙酸。而模式菌株Rhizobium>T与对照组无显著差异。因此模式菌株Rhizobium>T没有硫氧化功能，也没有反硝化功能。模式菌株Rhizobiumrosettiformans>T能利用乙酸钠进行反硝化，但不能利用硫代硫酸盐进行反硝化。菌株F43b^T既能利用硫代硫酸盐进行反硝化，也能利用乙酸进行反硝化。处理2也验证了模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和菌株F43b^T都能利用乙酸进行反硝化作用。处理3中，模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和菌株F43b^T硝酸盐氮和亚硝酸盐氮变化与处理1一致，但仅有菌株F43b^T的硫酸盐有细微的上升。因此，模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和Rhizobiumdaejeonense>T都不能利用硫化钠，菌株F43b^T能利用硫化钠。

因此，菌株F43b^T与两个模式菌株不同，模式菌株没有硫氧化反硝化功能，但有异养反硝化功能，而根瘤菌(Rhizobium>T具有硫氧化反硝化功能，能利用硫代硫酸盐和硫化物，同时还具有异养反硝化功能，是兼性自养的反硝化细菌。

实施例4：根瘤菌(Rhizobium>T在好氧条件下的硫氧化功能

将菌株F43b^T及模式菌株Rhizobium rosettiformans>T和Rhizobium>T在根瘤菌培养基上活化，取一定菌量用无菌水洗涤三次，分别按蛋白浓度约为100μg/mL的菌液，取100μL接种到已灭菌处理的，含有100mL培养基的250mL锥形瓶中。设计三个处理，处理1的培养基是在实施例1的富集培养基中同时添加Na₂S₂O₃·5H₂O>2O>2S₂O₃·5H₂O>2O>4⁺-N、NO₃^--N、NO₂^--N、SO₄^2--S、S₂O₃^2--S和TN等指标，测定方法与实施例2一致。结果如图4所示，处理1中，在好氧条件下，三个菌株的硝酸盐与空白组一样没有下降，且无亚硝酸盐积累，说明都不能进行好氧反硝化作用。而三个菌株乙酸钠的浓度都显著下降，说明都能氧化乙酸钠。而仅有菌株F43b^T明显产生硫酸盐，菌株F43b^T能在好氧条件下进行硫氧化作用。这些结果在处理2和处理3得到了进一步的验证。

因此，菌株F43b^T与两个模式菌株不同，模式菌株在好氧条件下也没有硫氧化功能，并且没有好氧反硝化功能。而根瘤菌(Rhizobium>T在好氧条件下具有硫氧化功能，但也不能进行好氧反硝化作用。

本发明的根瘤菌(Rhizobium>T的硫氧化反硝化功能特征：在富集培养基中，根瘤菌(Rhizobium>T能将硝酸盐还原，且总氮下降，硫代硫酸盐则被氧化生成硫酸盐，说明根瘤菌(Rhizobium>T具有硫氧化和反硝化的功能，能利用硫代硫酸盐进行反硝化。而与其同属亲缘性最高的Rhizobium rosettiformans>T和Rhizobium>T都不能利用硫代硫酸盐，不能利用硫代硫酸盐进行反硝化，且Rhizobium>T没有反硝化功能。