从细菌发酵液中富集抗菌肽的方法及一种抗菌肽产品

摘要

本发明提供了一种从细菌发酵液中富集抗菌肽的方法，包括以下步骤：1)将细菌发酵液与β‑环糊精在115‑121℃下进行第一接触获得物料1，其中，相对于100ml的细菌发酵液，β‑环糊精的用量为0.5‑2.5g；2)将物料1与沸石粉进行第二接触获得物料2，其中相对于100ml的物料1，沸石粉的用量为1‑5g；3)对物料2进行过滤获得抗菌肽‑沸石复合物。本发明的方法提取工艺简单、无毒无害、成本低廉、且生产周期端、能提高吸附率和提高单位重量吸附剂的吸附量。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物抗菌肽的快速分离制备方法，具体涉及一种从细菌发酵液中富集抗菌肽的方法及一种含有抗菌肽的产品。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptide)简称AMP，又被称为抗微生物肽或肽抗生素，来源于多种生物，是自然界生物体内天然防卫系统的组成部分。在农牧业方面，抗菌肽作为饲料添加剂不仅可以替代饲料当中的抗生素，解决药物残留和耐药性等问题，对畜禽还具有促生长、保健和治疗疾病的功能。

近年来，如何通过各种技术手段高效的获得高纯度的抗菌肽制剂成为抗菌肽分离提取的研究热点，此外，低成本的大规模提取方法是实现抗菌肽工业化生产的关键，也是目前制约抗菌肽市场竞争力的主要因素。在抗菌肽制备方面，主要是通过从原料液中提取、人工方法合成和发酵技术三种制备得到合成肽链。发酵技术是在一定条件下发酵特定分泌抗菌肽的试验菌株，以达到大量富集的目的，再提取制备得到抗菌肽制品。

Yang等通过改变发酵液pH，建立了菌体吸附法提取乳链菌肽的方法，使收率达到93.3％；Coventry等利用硅酸钙抗粘剂(商品名为“Micro-Cel”)从乳酸乳球菌的发酵液中吸附乳链菌肽；高兆建等2013年专利报道一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，将发酵液经过预处理，再用分子筛凝胶柱过滤层析法得到抗菌肽活性溶液，再冷冻干燥得到高浓度抗菌肽粉末，活力回收率达到43.5％以上；吴建伟等2007年专利报道一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，将抗菌 肽粗提取液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌肽性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。1996年曾报道将抗菌肽吸附在食品级吸附剂表面；2010年又有报道将细菌素吸附在两种食品级吸附剂表面上。然而，食品级吸附剂价格较为昂贵，难以实现规模化生产，不利于推广应用。

因此，有必要对抗菌肽的富集技术进行改进，提供一种加工工艺简单、成本低且具有较高生产效率的抗菌肽富集技术。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述缺陷，提供一种工艺简单、成本低廉、且具有高生产效率的抗菌肽富集方法。

为了达到以上目的，本发明提供了一种从细菌发酵液中富集抗菌肽的方法，包括以下步骤：

1)将细菌发酵液与β-环糊精在115-121℃下进行第一接触获得物料1，其中，相对于100ml的细菌发酵液，β-环糊精的用量为0.5-2.5g；

2)将物料1与沸石粉进行第二接触获得物料2，其中相对于100ml的物料1，沸石粉的用量为1-5g；

3)对物料2进行过滤获得抗菌肽-沸石复合物。

其中，本发明对于发酵液的种类没有特别的限制，本领域利用细菌发酵生产抗菌肽发酵结束后所获得的发酵液均可利用本发明所提供的富集方法进行富集。例如所述细菌发酵液为侧孢短芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌的发酵液。优选的，所述细菌发酵液为侧孢芽孢杆菌发酵液。

优选的，所述细菌发酵液中，抗菌肽的浓度为1500-1800AU/ml。

本发明中，第一接触的目的包括提高发酵液中抗菌肽的耐热性和稳定性并保持抗菌肽的生物活性，同时，第一接触结束后，可以杀死发酵液中的生产菌，使得抗菌肽从细胞中释放出来，更利于后续富集。

优选的，相对于100ml的细菌发酵液，β-环糊精的用量为1-2g时 能够获得更好的提高发酵液中抗菌肽的耐热性和稳定性并保持抗菌肽的生物活性的效果。所述第一接触的时间优选为20-30min。

可选的，在步骤2)中，第二接触优选在真空浓缩罐中进行，第二接触的条件包括：在温度40-60℃、气压0.07-0.09Mpa、转速100-200r/min的条件下接触60-120min。

特别优选的，第二接触在温度45-55℃、气压0.08Mpa下进行时能够使得抗菌肽更加充分的吸附在沸石颗粒表面，提高抗菌肽的富集效率。

可选的，所述沸石粉选自由斜发沸石粉、丝光沸石粉、方沸石粉和菱沸石粉所组成的组中的至少一种，粒径为80-180目，沸石粉所发挥的作用包括吸附剂和载体。

其中，在步骤3)中，对于过滤的方法没有特别的限制，只要能够将物料2中的溶液去除保留沉淀即可，优选的，利用真空抽滤机进行抽滤，所利用的滤布的孔径为50-100目。

步骤3)结束后发酵液中的抗菌肽被吸附到沸石表面，形成抗菌肽-沸石复合物。

本发明进一步提供了一种利用前述从细菌发酵液中富集抗菌肽的方法制备获得的抗菌肽-沸石复合物。

本发明还提供一种抗菌肽添加剂产品，其活性成分为所述抗菌肽-沸石复合物。

所述抗菌肽添加剂的制备方法包括，将抗菌肽-沸石复合物通过旋转闪蒸干燥设备干燥，干燥温度为60℃-90℃；或自然晾干或热风房晾干。

可选的，将干燥之后的物料用平模饲料颗粒机加工成颗粒，模孔规格为3-4mm；

所述抗菌肽添加剂产品中β-环糊精。

本发明提供的抗菌肽-沸石复合物能够用于制备生物防腐剂。

本发明提供的饲料添加剂能够用于制备生物防腐剂。

本发明提供的抗菌肽-沸石复合物能够用于制备饲料。

本发明提供的饲料添加剂能够用于制备饲料。

本发明提供的从细菌发酵液中富集抗菌肽的方法克服了现有技术的不足，使用低成本的无机吸附剂沸石粉配合真空浓缩技术，将抗菌肽分子直接吸附到沸石颗粒上，其吸附率高达88％-96％，回收率89％-94％，成型率88％-93％，达到利用廉价的吸附剂从微生物发酵液中制备抗菌肽的目的，在提高回收率的同时实现高抗菌活力和高稳定性。本发明所提供的方法提取工艺简单、无毒无害、成本低廉；能够缩短生产周期、提高吸附率和提高单位重量吸附剂的吸附量。

本发明首次将饲料级无机沸石粉配合真空浓缩技术应用在制备抗菌肽添加剂中，沸石粉不仅具有高吸附率，而且避免了有机吸附剂具有的稳定性低、易变质、易引起牲畜腹泻等问题，沸石粉本身又具有抗氧化、抗腹泻、促进动物生长、提高生产性能等功效。该方法制备出的抗菌肽产品安全稳定，可广泛应用于饲料工业，为抗菌肽的大规模制备提供了一种新方法，具有更广泛及实用的应用效果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料除特别说明外，均为市售。

实施例1抗菌肽富集及抗菌肽添加剂的制备

从侧孢短芽孢杆菌发酵液中提取抗菌肽，制备抗菌肽添加剂，步骤如下：

(1)抗菌肽富集

发酵液预处理：在发酵液中(发酵终了时抗菌肽的浓度为1600AU/ml)添加β-环糊精保护剂，相对于每100ml细菌发酵液β-环糊精的用量为1g，充分混匀，然后加热到121℃保持20min。

真空浓缩吸附：向真空浓缩罐中加入斜发沸石粉(粒径为100目)和发酵液，沸石粉的量为上步获得的物料体积的4％(m/v)，吸附温度为50℃，转速200r/min，搅拌120min，真空度保持在0.08Mpa，使抗菌肽充分吸附在沸石颗粒表面，制成抗菌肽-沸石的复合物；

真空抽滤：使用真空抽滤机抽滤，滤布为100目，除去上清液，保留沉淀，滤出的沉淀即得到饲料级生物抗菌肽-沸石的复合物。

(2)制备抗菌肽添加剂

干燥：将生物抗菌肽-沸石复合物通过旋转闪蒸干燥设备干燥，干燥温度为60℃；

造粒成型：将干燥之后的粉末用平模饲料颗粒机加工成颗粒，模孔规格为4mm；

真空包装：将颗粒状的抗菌肽-沸石复合物进行真空包装即得到抗菌肽添加剂产品。

对抗菌肽添加剂产品中沸石吸附抗菌肽的吸附率、回收率和颗粒成型率进行测定，结果如表2所示。

吸附率％＝(A－B)/A×100％

式中A为吸附前发酵液效价；

B为吸附平衡后上清液效价。

回收率％＝t/T×100％

式中t为干燥后得到沸石粉重量(kg)；

T为沸石粉添加量(kg)。

颗粒成型率％＝(1-r/t)×100％

式中t为干燥后得到沸石粉重量(kg)

r为能够通过5号筛的沸石粉颗粒(kg)

实施例2-13

按照表1列出的条件制备抗菌肽-沸石的复合物以及抗菌肽添加剂产品，其他处理过程均与实施例1相同。

对实施例2-13中沸石吸附抗菌肽的吸附率、回收率和颗粒成型率进行测定，结果如表2所示。

对比例1-5

按照表1列出的条件制备抗菌肽-沸石的复合物以及抗菌肽添加剂产品，其他处理过程均与实施例1相同。

测定对比例1-5中沸石吸附抗菌肽的吸附率、回收率和颗粒成型率，结果如表2所示。

表1产品制备条件

对比例6

采用与实施例1相同的方法制备抗菌肽-沸石的复合物以及抗菌肽添加剂产品。区别仅在于将沸石粉更换为等质量的麦麸，对麦麸吸附抗菌肽的吸附率进行测定，结果如表2所示。

对比例7

采用与实施例1相同的方法制备抗菌肽-沸石的复合物以及抗菌肽添加剂产品。区别仅在于不添加β-环糊精，对沸石吸附抗菌肽的吸附率进行测定，结果如表2所示。

表2产品实施结果

抗菌肽-沸石复合物吸附率(％)回收率(％)颗粒成型率(％)实施例1969492实施例2929490实施例3959191实施例4929291对比例1868487实施例5949392对比例2818082实施例6929090实施例7939393对比例3808584实施例8959390实施例9959289对比例4828080实施例10929390实施例11909391实施例12888988实施例13959390对比例5848081对比例6717572对比例7787675

测试例1生物抗菌肽添加剂产品最小杀菌浓度研究

对实施例1制备的抗菌肽添加剂进行杀菌浓度研究，将指示菌S.aureus ATCC 14458在37℃，转速200r/min条件下培养二代4h时添加饲料级抗菌肽饲料添加剂，当培养基中抗菌肽浓度为50AU/ml时，在4h之后培养基逐渐澄清透明，6h时OD值与无菌培养基相近，因此饲料级抗菌肽饲料添加剂最小杀菌浓度为50AU/ml。

测试例2对比例6制备的生物抗菌肽添加剂产品最小杀菌浓度研究

对对比例6制备的抗菌肽添加剂进行杀菌浓度研究，将指示菌S.aureus ATCC 14458在37℃，转速200r/min条件下培养二代4h时添加饲料级抗菌肽饲料添加剂，当培养基中抗菌肽浓度为65AU/ml时，在4h之后培养基逐渐澄清透明，6h时OD值与无菌培养基相近，因此饲料级抗菌肽饲料添加剂最小杀菌浓度为65AU/ml。

测试例3对比例7制备的生物抗菌肽添加剂产品最小杀菌浓度研究

对对比例7制备的抗菌肽添加剂进行杀菌浓度研究，将指示菌S.aureus ATCC 14458在37℃，转速200r/min条件下培养二代4h时添加饲料级抗菌肽饲料添加剂，当培养基中抗菌肽浓度为64AU/ml时，在4h之后培养基逐渐澄清透明，6h时OD值与无菌培养基相近，因此饲料级抗菌肽饲料添加剂最小杀菌浓度为64AU/ml。

测试例4生物抗菌肽添加剂产品肠道酶作用稳定性

将实施例1、对比例6-7制备的抗菌肽添加剂进行模拟鸡肠道环境试验，研究酶对稳定性的影响，利用琼脂扩散打孔法进行抑菌试验研究，计算处理组和对照组抑菌圈直径，比较计算得到的损失率如表3所示。结果显示纤维素酶影响最大，但也仅仅只有9％左右，所以抗菌肽添加剂在肠道中酶类对抑菌活性的影响并不显著，仍然能够表达出明显的抑菌作用，稳定性较高。

表3不同酶的损失率

抗菌肽添加剂酶类(3％(E/S))胃蛋白酶1:10000脂肪酶纤维素酶实施例1损失率(％)7.551.759.01对比例6损失率(％)20.2119.5327.13对比例7损失率(％)17.6421.8819.42

测试例5生物抗菌肽添加剂产品热稳定性研究

将实施例1的抗菌肽添加剂经过100℃沸水水浴，水浴时间120min，利用琼脂扩散打孔法进行抑菌试验研究，与对照组抑菌圈直径相比，时间处理越长损失率越高，在120min时损失率稳定在10％左右，损失较小，并且处理之后的沸石仍然具有明显的抑菌作用，所以短时间热处理不会影响抗菌肽饲料添加剂抗菌活性，热稳定性高。

用同样的方法测试对比例6-7的抗菌肽添加剂的热稳定性，在120min时损失率分别为17％和15％。

测试例6生物抗菌肽添加剂产品保藏性研究

将实施例1制备的抗菌肽添加剂在常温和0℃冷冻条件下长期储藏，每两周利用琼脂扩散打孔法测定抑菌活性变化，实验周期为10周。结果发现，在常温储藏和0℃冷冻条件储藏抑菌能力没有明显不同，并保持较高的抑菌活性。

测试例7β-环糊精耐热性实验

在微生物发酵液分别添加5、10、20、40、60g/l的β-环糊精，然后将发酵液加热到121℃保持20min，通过牛津杯法计算效价发现当β-环糊精的添加量为5g/l、10g/l、20g/l、40g/l、60g/l时，与对照组相比效价分别高35.04％、39.92％、27.08％、21.98％、40.24％，因此，说明β-环糊精能够提高发酵液中抗菌肽的耐热性，并保持较高的抗菌活性，β-环糊精的添加量为10g/l时效果最佳。

测试例8饲用效果研究

将实施例1制备得到的抗菌肽添加剂产品应用于肉鸡饲养当中，添加量分别为500AU/g、400AU/g、300AU/g，实验结果见表4，结果表 明肉鸡饲养42天之后高、中、低剂量组鸡平均体重和出栏率均比空白组要高，高、中、低剂量组料肉比和死亡率均比空白组要低。这说明这种抗菌肽产品确实能够促进肉鸡的生长发育，能够替代抗生素使用，增强动物免疫。

表4饲用效果实验

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。