一种杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法

摘要

本发明公开了一种杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法，包括以下步骤：野生鱼收集；利用微卫星标记技术筛选遗传多样性较丰富且二者亲缘关系最远的两个群体；两个群体分别构建超雄黄颡鱼繁育系和全雌黄颡鱼繁育系；两个群体构建的繁育系交叉组合交配，根据子代的雄性率、生长率和存活率，筛选出最佳亲本组合；利用筛选出的最佳亲本组合交配，获得全雄黄颡鱼优良品种。本发明获得的全雄黄颡鱼优势品种其杂种的遗传多样性丰富，存活率和生长率均高于现在的“全雄1号”；本发明构建的超雄繁育系完全摆脱了现有超雄鱼繁育系基因的影响，重新建立新的繁育系，提高了繁殖力。该方法同时减少了选育工作量，降低了育种成本，并提高了选育成功率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法。

背景技术

黄颡鱼是淡水养殖的重要鱼类。据《2015中国渔业统计年鉴》数据显示，2014年黄颡鱼养殖产量达33.4万吨，估计苗种需求量达150亿尾以上。但是由于黄颡鱼苗种生产存在规模小、质量差、市场混乱等问题，优质苗种的匮乏已成为目前限制黄颡鱼养殖业快速发展的瓶颈。

在相同的养殖条件下，雄性黄颡鱼比同胞雌鱼的生长速度快30％以上，因此，发明人发明了采用性逆转和雌核发育持续产生全雄黄颡鱼(专利号：ZL 200610166518.8)的方法，建立了超雄黄颡鱼繁育种群(专利号：ZL 200810197519.8)，通过该技术，培育了国家水产新品种——黄颡鱼“全雄1号”(品种登记号GS-04-001-2010)。但是该品种的父本超雄黄颡鱼长期实施近交和母本来源不清，最终导致“全雄1号”养殖群体出现生长速度减慢、成活率降低、抗病力差等较为严重的退化现象。

为此，发明人发明了一种快速建立YY超雄黄颡鱼改良繁育系的方法(专利号：ZL 201410057631.7)和建立全雌黄颡鱼繁育种群的方法(专利号：ZL 201310034096.9)。但是仍然存在退化现象。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法，进一步改善全雄黄颡鱼的品质，获得生产性能更佳的全雄黄颡鱼，优于现有方法获得的全雄黄颡鱼。

考虑到专利号：ZL 201410057631.7的方法虽然引进野生资源，但还是跟YY♀原系交配，建立的超雄鱼繁育系不纯；专利号：ZL 201310034096.9的方法则未引进野生资源，两者建立的繁育系遗传多态性不够丰富。

本发明提供的杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法，包括以下步骤：

(1)野生鱼收集：从不同水域收集野生黄颡鱼，单独饲养；

(2)利用微卫星标记技术，筛选遗传多样性较丰富且二者亲缘关系最远的两个群体，分别标记为A群体和B群体；

(3)构建超雄黄颡鱼繁育系：以A群体为基础育种群体，构建超雄鱼繁育系A超雄鱼；以B群体为基础育种群体，构建超雄鱼繁育系B超雄鱼；

(4)构建全雌黄颡鱼繁育系：以A群体为基础育种群体，构建全雌鱼繁育系A全雌鱼；以B群体为基础育种群体，构建全雌鱼繁育系B全雌鱼；

(5)亲本组合杂交：A超雄鱼和B全雌鱼交配；B超雄鱼和A全雌鱼交配；繁育得到的子代在相同条件下饲养；

(6)筛选性能最佳的超雄鱼和全雌鱼繁育系组合：根据步骤(5)的子代的雄性率、生长率和存活率，筛选出最佳亲本组合；

(7)获得全雄黄颡鱼优良品种：利用步骤(6)得到的最佳亲本组合交配，获得全雄黄颡鱼优良品种；

其中，步骤(3)和(4)无先后顺序。

利用多个不同地理种群进行杂交选育，根据子代的表型来选择具有重要性状杂交优势的组合，是培育黄颡鱼优良品种(品系)的一条新的重要途径。两个亲本全部采用亲缘关系远的野生品系进行繁育，增加了种群遗传多样性程度，改善了群体基因型，避免近交造成的退化现象，以提高生产性能和质量。

优选地，上述杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法中，步骤(2)的筛选方法具体为：

使用SEQ ID NO:1～20所示的扩增引物和荧光标记引物，以野生黄颡鱼基因组DNA为模板进行PCR扩增，所得扩增产物进行遗传多样性分析和聚类图的构建，筛选出杂合度高和亲缘关系远的两个群体。

选择的10对引物20条序列，能够有效扩增特异性遗传多样性标记，通过以上分析即可筛选出多样性丰富且亲缘关系远的群体。

优选地，上述杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法中，步骤(3)所述的构建超雄黄颡鱼繁育系，每个群体的构建方法具体为：

a.雄鱼和雌鱼取精子和卵子，人工授精，受精卵孵育成鱼苗，包括XY♂雄鱼和XX♀雌鱼；

b.全部鱼苗用雌激素诱导进行性逆转，使XY♂雄鱼成为XY♀生理雌鱼， XX♀雌鱼不变；饲养至性成熟；

c.XY♀生理雌鱼雌核发育，获得XX♀雌鱼和YY♂生理超雄鱼；取部分鱼苗用雌激素诱导进行性逆转获得XX♀雌鱼和YY♀生理雌鱼；

或者XY♀生理雌鱼与XY♂雄鱼交配，获得鱼苗，包括XX♀雌鱼、XY♂雄鱼和YY♂超雄鱼；取部分鱼苗用雌激素诱导进行性逆转，获得XX♀雌鱼、XY♀生理雌鱼和YY♀生理雌鱼；

d.确认YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼：步骤c中的全部鱼苗养至5cm以上，剪鳍条提取DNA，用X、Y染色体特异标记引物进行基因型鉴定，剔除含有X染色体的鱼，保留YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼，作为建立超雄鱼繁育系的亲本；

e.超雄鱼繁育系的建立：YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼交配，建立超雄鱼繁育系。

优选地，上述杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法中，步骤(4)所述的构建全雌黄颡鱼繁育系，每个群体的构建方法具体为：

a.雄鱼和雌鱼取精子和卵子，人工授精，受精卵孵育成鱼苗，包括XY♂雄鱼和XX♀雌鱼；

b.全部鱼苗用雄激素诱导进行性逆转，使XX♀雌鱼成为XX♂生理雄鱼，XY♂雄鱼不变；饲养至性成熟；保留雄性特征的备用；

c.步骤b筛选出来的雄性特征的鱼用X、Y染色体特异标记引物对进行基因型鉴定，剔除含有Y染色体的鱼，保留为XX♂生理雄鱼备用；

d.用XX♂生理雄鱼与XX♀雌鱼交配，产生100％XX♀雌鱼；在鱼苗开口时，取一部分用雄激素诱导进行性逆转，获得XX♂生理雄鱼；XX♂生理雄鱼和XX♀雌鱼交配，可持续生产XX♀雌鱼，建立全雌黄颡鱼繁育系。

优选地，上述杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法中，每个水域收集的野生黄颡鱼在200尾以上。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明获得的全雄黄颡鱼优势品种其杂种的遗传多样性丰富，存活率和生长率均高于现在的国家水产新品种——黄颡鱼“全雄1号”。

2、本发明建立的超雄鱼繁育系，与专利ZL 201410057631.7相比，完全摆脱了现有超雄鱼繁育系(专利号ZL 200810197519.8)基因的影响，重新建立新的繁育系，提高了繁殖力。

3、先从众多的野生黄颡鱼种群中筛选出种群差异大的优势种群，然后再进行杂交，减少了工作量、降低了育种成本和提高了选育成功率。

附图说明

图1是本发明实施例1杂交选育全雄黄颡鱼优良品种的方法流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定，还包括各具体实施方式间的任意组合。

实施例1

1、收集不同水域的野生黄颡鱼：从湖北长湖、湖北洪湖、湖南洞庭湖、广东珠江、安徽淮河、四川合江等6个水域收集野生黄颡鱼作为不同的地理群体，每个地理群体捕捞约200尾雌雄野生黄颡鱼，每个群体用不同颜色的荧光标记区分。

2、黄颡鱼遗传分析：运用微卫星标记技术，不同种群的遗传多样性、遗传距离和遗传相似性系数，筛选出遗传多样性丰富、遗传距离较远的2个群体。

具体分析方法：

按常规方法从不同地理群体黄颡鱼尾鳍样品中提取基因组DNA，样品数量为30～50尾。设计10对微卫星多态性引物(见表1)，进行PCR扩增反应，反应体系为15μL：1.5μL 10×PCR buffer，1.5μL 25mM MgCl₂，0.1μL浓度为5U/μL>

PCR反应后，从每个个体的每个位点的PCR产物中吸出0.5μL，根据片段的大小和荧光标记的颜色，将用FAM、HEX、TAMRA各1个位点的PCR产物混合在一起，作为上机检测的样品，具体混合方法如下：引物HLJYC233、HLJYC200和HLJYC177的PCR产物混合；引物HLJYC265、HLJYC212和HLJYC266的PCR产物混合；引物HLJYC229和HLJYC158的PCR产物混合；引物HLJYC195和HLJYC249的PCR产物混合。将带有荧光标记的PCR混合物与分子量内标混合，用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，然后用peak scanne软件读取原始文件获得各个体在各微卫星位点的基因型，统计不同群体各微卫星位点的基因型，再用Popgene、Cervus软件进行遗传多样性分析和聚类图的构建。

表1 微卫星多态性引物

利用Cervus、Popgene软件统计分析不同群体的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、预期杂合度(He)、观测杂合度(Ho)、多态信息含量(PIC)。同时利用Popgene软件计算不同群体之间的Nei氏遗传相似指数和遗传距离，构建聚类图。

结果：杂合度可以反应群体遗传多样性的高低，平均期望杂合度值越高，反映群体的遗传一致性越低，其遗传多样性就越丰富。另外，根据聚类先后顺序可以反映种群间亲缘关系的远近。亲缘关系越远的群体间杂交所产生的杂种 优势越大。安徽淮河、湖北长湖、湖北洪湖和四川合江群体杂合度均较高，其中又以安徽淮河和湖北洪湖的亲缘关系最远。所以，选择安徽淮河和湖北洪湖群体为超雄黄颡鱼和全雌黄颡鱼繁育系的基础育种群体。

表2 不同群体野生黄颡鱼遗传多样性

3、构建超雄黄颡鱼繁育系：根据步骤2的结果，分别构建安徽淮河超雄鱼繁育系和湖北洪湖群体超雄鱼繁育系，每个繁育系的构建方法如下：

a.雄鱼和雌鱼取精子和卵子，人工授精，受精卵孵育成鱼苗，包括XY♂雄鱼和XX♀雌鱼。具体方法为：

取体表无伤、腹部膨大、柔软的雌鱼，每尾使用催产剂绒毛膜促性腺激素800～1000IU和鱼用促黄体素释放激素类似物2号5～8μg注射，在鱼胸鳍基部注射一次，将其置于26℃的水中，经过24～48小时候可挤出成熟的卵子，再置于冰浴上低温保存备用。

选取生殖突微红的雄鱼，每尾注射相较于雌鱼减半的催产剂。催产后对雄鱼进行解剖取出精巢，用剪刀将精巢剪碎，再用精子保存液洗滤出精子，将精子置于冰浴上低温保存备用。

取卵子和精子混合进行干法人工受精；把受精卵置于27℃生化培养箱中恒温孵育成雄鱼和雌鱼鱼苗并全部出膜；待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口饵料。

b.全部鱼苗用雌激素诱导进行性逆转，使XY♂雄鱼成为XY♀生理雌鱼，XX♀雌鱼不变；饲养至性成熟。具体方法为：

以卤虫幼体作为雌激素载体，将卤虫幼体在100～250μg/L的17-ɑ乙炔基雌二醇溶液中浸泡1小时，再抽滤取出富集雌激素的卤虫投喂已开口摄食的步骤a所得黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续投喂40天，经雌性激素处理后存活的鱼苗中约50％的XY♂雄鱼性 逆转成为XY♀生理雌鱼，XX♀雌鱼不变；将用雌激素处理过的所有幼鱼转移至水泥池用海马牌幼鳖粉状配合饲料培育至性成熟。

c.XY♀生理雌鱼经过雌核发育获得YY♂，或者XY♀生理雌鱼与XY♂交配获得YY♂；

以上两种方法部分鱼苗转雌，获得YY♀；可以使用以下具体方法：

XY♀生理雌鱼经过雌核发育获得XX♀雌鱼和YY♂生理超雄鱼，部分鱼苗按步骤b的方法用雌激素诱导进行性逆转，可得到YY♀生理雌鱼，XX♀雌鱼不变。

或者XY♀生理雌鱼与XY♂雄鱼交配，子代为XX♀雌鱼、XY♂雄鱼、YY♂超雄鱼。部分鱼苗按步骤b的方法用雌激素诱导进行性逆转，可得到XY♀生理雌鱼和YY♀生理雌鱼，XX♀雌鱼不变。

d.确认YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼：步骤c中的全部鱼(包含XY♂、XY♀、YY♂、XX♀和YY♀)养至5cm以上，剪鳍条提取DNA，用X、Y染色体特异标记XY1引物对进行基因型鉴定，剔除含有X染色体的鱼，保留YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼，作为建立超雄鱼繁育系的亲本。

XY1-F引物对序列：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA(SEQ ID NO.21)，

XY1-R引物对序列：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG(SEQ ID NO.22)。

e.超雄鱼繁育系的建立：YY♂超雄鱼和YY♀生理雌鱼交配，建立超雄鱼繁育系。

或者，步骤d获得的确定的YY♂和YY♀，按步骤a人工繁殖方法，获得大量的YY♂，取部分鱼苗转雌，得到YY♀，建立超雄鱼繁育系。

4、构建全雌黄颡鱼繁育系(也可称全雌配套系)：根据步骤2的结果，在进行步骤3的同时，分别构建以安徽淮河全雌鱼繁育系和湖北洪湖全雌鱼繁育系，每个繁育系的构建方法如下：

a.雄鱼和雌鱼取精子和卵子，人工授精，受精卵孵育成鱼苗，包括XY♂雄鱼和XX♀雌鱼。具体方法为：

选择体表无伤、腹部膨大柔软、性腺发育良好的普通雌鱼(15～20尾/kg)，按照每kg雌鱼用绒毛膜促性腺激素2500～3000IU、鱼用促黄体素释放激素类似物2号30～40μg和多巴胺拮抗物地欧酮6～10mg的剂量，对每条鱼胸鳍基部进行两次注射，两次注射间隔10小时。将雌鱼置于26℃的水中，经24小时后挤出成熟的卵子，将卵子置于冰浴上低温保存备用。

选取生殖突微红的雄鱼(15～20尾/kg)，每kg雄鱼使用绒毛膜促性腺激素 2500～3000IU、鱼用促黄体素释放激素类似物2号15～20μg和多巴胺拮抗物地欧酮6～10mg注射催产。一次注射，催产后对雄鱼进行解剖取出精巢，用剪刀将精巢剪碎，再用精子保存液洗滤出精子，将精子置于冰浴上低温保存备用。

取卵子和精子混合进行干法人工受精；把受精卵置于27℃生化培养箱中恒温孵育成雄鱼和雌鱼鱼苗并全部出膜；待卵黄吸收后，鱼苗用卤虫幼体作为开口饵料。

b.全部鱼苗用雄激素诱导进行性逆转，使XX♀雌鱼成为XX♂生理雄鱼，XY♂雄鱼不变；饲养至性成熟；保留雄性特征的备用。具体方法为：

以卤虫幼体作为雄激素载体，将卤虫幼体在100～250IU的甲基睾丸溶液中浸泡1小时，再抽滤取出富集雄激素的卤虫投喂已开口摄食的步骤a所得黄颡鱼苗，每天上午、下午和晚上各投喂一次，投喂量以30分钟内吃完为准，连续投喂40天，经雄性激素处理后存活的鱼苗中部分XX♀雌鱼性逆转成为XX♂生理雄鱼，XY♂雄鱼不变；将用甲基睾丸处理过的所有幼鱼转移至水泥池用海马牌幼鳖粉状配合饲料培育至8cm以上，即可从外表区分雌雄；雄鱼的生殖器已开始突起，而雌鱼则无；剔除XX♀黄颡鱼，剩雄性黄颡鱼XX♂、XY♂备用。

c.步骤b筛选出来的雄性特征的鱼用X、Y染色体特异标记XY1引物对进行基因型鉴定，剔除含有Y染色体的鱼，保留为XX♂生理雄鱼备用。

XY1-F引物对序列：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA(SEQ ID NO.23)，

XY1-R引物对序列：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG(SEQ ID NO.24)。

d.用XX♂生理雄鱼与XX♀雌鱼交配，产生100％XX♀雌鱼；在鱼苗开口时，取一部分用雄激素诱导进行性逆转，获得XX♂生理雄鱼；XX♂生理雄鱼和XX♀雌鱼交配，可持续生产XX♀雌鱼，建立全雌黄颡鱼繁育系。

5、杂交：步骤3、4得到的繁育系进行杂交，安徽淮河超雄鱼繁育系和湖北洪湖全雌鱼繁育系杂交，湖北洪湖群体超雄鱼繁育系和安徽淮河全雌鱼繁育系杂交，繁育得到的子代在相同条件下饲养。

6、筛选性能最佳的超雄鱼和全雌鱼繁育系组合：饲养步骤5得到的杂交鱼苗1个月统计雄性率和夏花存活率，养至10个月以上统计生长率和存活率，筛选生产性能最佳的子代，其亲本即是最佳超雄鱼和全雌鱼配组方案。

7、获得全雄黄颡鱼优势品种：利用步骤6得到的最佳亲本组合交配，获得生长率和存活率比黄颡鱼“全雄1号”更高的全雄黄颡鱼优种。

黄颡鱼“全雄1号”卵黄苗养至夏花的成活率约20～30％，生长速度与普 通雄鱼一样，实际养殖推广过程中，由于母本来源不确定和超雄鱼父本的遗传多态性下降，导致子代“全雄1号”生长性能不稳定，实际生长速度和成活率因地域和生产批次的不同而不同，也有部分地区会出现约5％的尾苗(遗传性别为XY雄鱼，但是生长速度跟雌鱼相似)。而本发明的杂交交配获得的全雄黄颡鱼新品种，超雄鱼父本和雌鱼母本的来源确定统一，子代的生长性能稳定，卵黄苗养至夏花的成活率可提高到50％，生长速度提高约10％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉百瑞生物技术有限公司

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