一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法

摘要

本发明公开了一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，包括以下步骤：S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中在高温高压下灭菌处理；S2.接种培养：将培养好的金针菇融合子母种接种在诱导培养基中培养，原生质体融合子核进行分裂；S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种进行诱导出菇，形成子实体。本发明通过配制诱导培养基、接种培养和诱导出菇使金针菇原生质体融合子细胞核由1个分裂形成2个细胞核，并能正常形成子实体的，本发明解决了金针菇原生质体进行融合后融合子不能出菇的技术问题，且本发明的方法操作简便、出菇率高、成本低、适用于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法。

背景技术

常用的微生物育种技术主要有自然分离、诱变筛选、细胞结合、原生质体融合、基因导入以及基因破坏等方式，其中，原生质体融合是指通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。这种育种方式可以打破微生物的种界界限，实现远缘菌株的基因重组，使遗传物质传递更为完整，获得更多基因重组的机会，从而把更多优良性状组合到一个单一菌株中。此项技术受到了国内外广大食用菌是育种工作者的重视，尤其我国、日本和韩国研究进展较快，先后在种内、种间、属间都得到过融合子，但所得到的融合子以细胞质融合而细胞核融合的异核体为主，稳定性差是这类融合子的最大缺陷。

金针菇学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，英文为：“Enoki Mushroom”。植物学名为Flammulina velutiper(Fr.)Sing。因其菌柄细长，似金针菜，故称金针菇，属伞菌目白蘑科针金菇属，是一种菌藻地衣类。金针菇具有很高的药用食疗作用。采用原生质体融合技术对金针菇进行优良菌株的筛选是本领域工作人员研究的重点，但是传统的方法存在金针菇原生质体进行融合后融合子不能出菇的难题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，它包括以下步骤：

S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中用棉花塞封口，在105～120℃、0.08～0.12MPa的条件下灭菌处理2.5～3.5h；

S2.接种培养：选取金针菇融合子菌种，转接到PDA培养基上，18～25℃下培养8～10d，即为母种，将母种接种在步骤S1配制的诱导培养基中，在20～25℃的温度下培养30～40d，原生质体融合子核进行分裂；

S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种置于温度为10～18℃、相对湿度为90～95％、光照强度为10～50Lux的条件下进行诱导出菇，形成子实体，所述诱导出菇的时间为50～60d。

进一步地，步骤S1中所述麸皮、棉籽和水的重量比为1:3～6:2～4。

本发明具有以下优点：传统的方法存在金针菇原生质体进行融合后融合子不能出菇的技术问题，因此，金针菇原生质体融合育种的关键技术是解决诱导融合子细胞核发生分裂形成双核体，本发明通过配制诱导培养基、接种培养和诱导出菇使金针菇原生质体融合子细胞核由1个分裂形成2个细胞核，并能正常形成子实体的，本发明解决了金针菇原生质体进行融合后融合子不能出菇的技术问题，且本发明的方法操作简便、出菇率高、成本低、适用于工业化大规模生产。

附图说明

图1为融合子诱导出菇示意图；

图2为融合子的菌丝形态示意图；

图3为诱导后的融合子菌丝形态示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，它包括以下步骤：

S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中用棉花塞封口，在105℃、0.08MPa的条件下灭菌处理2.5h；所述麸皮、棉籽和水的重量比为1:3:2；

S2.接种培养：选取金针菇融合子菌种，转接到PDA培养基上，18℃下培养8d，即为母种，将母种接种在步骤S1配制的诱导培养基中，在20℃的温度下培养30d，原生质体融合子核进行分裂；

S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种置于温度为10℃、相对湿度为90％、光照强度为10Lux的条件下进行诱导出菇，形成子实体，所述诱导出菇的时间为50d。

实施例2：一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，它包括以 下步骤：

S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中用棉花塞封口，在120℃、0.12MPa的条件下灭菌处理3.5h；所述麸皮、棉籽和水的重量比为1:6:4；

S2.接种培养：选取优良的金针菇融合子菌种，转接到PDA培养基上，25℃下培养10d，即为母种，将母种接种在步骤S1配制的诱导培养基中，在25℃的温度下培养40d，原生质体融合子核进行分裂；

S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种置于温度为18℃、相对湿度为95％、光照强度为50Lux的条件下进行诱导出菇，所述诱导出菇的时间为60d，形成子实体。

实施例3：一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，它包括以下步骤：

S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中用棉花塞封口，在110℃、0.09MPa的条件下灭菌处理3h；所述麸皮、棉籽和水的重量比为1:4:3；

S2.接种培养：选取金针菇融合子菌种，转接到PDA培养基上，20℃下培养8.5d，即为母种，将母种接种在步骤S1配制的诱导培养基中，在22℃的温度下培养34d，原生质体融合子核进行分裂；

S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种置于温度为13℃、相对湿度为92％、光照强度为26Lux的条件下进行诱导出菇，形成子实体，所述诱导出菇的时间为54d。

实施例4：一种诱导金针菇种内原生质体融合子核分裂和正常形成子实体的方法，它包括以下步骤：

S1.配制诱导培养基：取麸皮、棉籽混合均匀后加入水，装入玻璃瓶中用棉花塞封口，在115℃、0.103MPa的条件下灭菌处理3.2h；所述麸皮、棉籽和水的重量比为1:5:3；

S2.接种培养：选取金针菇融合子菌种，转接到PDA培养基上，22℃下培养9.5d，即为母种，将母种接种在步骤S1配制的诱导培养基中，在24℃的温度下培养36d，原生质体融合子核进行分裂；

S3.诱导出菇：将接种培养后的金针菇融合子母种置于温度为16℃、相对湿度为94％、光照强度为42Lux的条件下进行诱导出菇，形成子实体，所述诱导出菇的时间为58d。

以下通过实验说明本发明的有益效果：

1.双核体菌株获取实验

将实施例1-4诱导出菇的子实体对其进行组织分离培养获得新的菌种，其分离方法是：取子实体菌盖内部组织放入PDA培养基上，在20～25℃下培养，培养时间为8～10天，实验发现，实施例1-4的子实体均能培养出新的菌株。

2.菌种鉴定方法

经组织分离培养的融合子菌种，需进行鉴定是否为双核体，只有菌丝上具有锁状联合标记和细胞内细胞核为2个的，才是具有造成出菇的双核体菌种。

鉴定方法：(1)锁状联合标记观察

将上述1中组织分离培养的菌种中菌丝体放在载玻片上，展开菌丝体后，覆盖盖玻片，在显微镜(400倍)下观察，菌丝上出现锁状联合的为双核体，即为具有正常出菇的融合子。

(2)细胞核染色观察方法

将无菌的盖玻片插在培养皿上培养的组织分离菌种外侧，在25下培养，待菌丝体生长到盖玻片上后进行显微观察。

3.融合子诱导实验

统计实施例1-4的融合子数量和融合子诱导出菇数量，实验结果如表1和图1所示。

表1：原生质体融合子诱导出菇情况

名称 融合子数量(个) 出菇数量(个) 诱导率 实施例1 32 32 100％ 实施例2 40 40 100％ 实施例3 38 38 100％ 实施例4 35 35 100％

4.融合子双核体分离培养实验

4.1培养基配方及制作方法：

配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，水1000ml。

制作方法：将马铃薯去皮、切片后放入锅内，加入1000ml水，加热煮沸30分钟，过滤、取滤液于锅内，加入琼脂条，煮沸至琼脂条完全融化为止，再加入葡萄糖，加热搅拌融化，然后补充水至1000ml，将培养基分装入试管内，装量为10ml，塞上硅胶塞。在高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度121℃，压力0.103兆帕，时间为30分钟，灭菌结束后，斜排放在木条上，使培养基液面呈斜面状，冷却凝固后，即为斜面培养基。

4.2菌种分离方法：

取诱导形成的子实体，用无菌手术刀切取菌盖与菌柄相交部位的内部组织块，放入PDA培养基上，在20℃下培养5-6天，再切取尖端菌种转接在PDA培养基上，在20℃下培养8-10天，取菌丝在显微镜下观察菌丝形态特征，菌丝上有锁状联合、细胞内细胞核为2个的，即为诱导成功融合子，如图2和图3所示。由图3可知：融合子菌丝形态为无锁状联合、只有1个细胞核，而诱导后的融合子菌丝形态有锁状联合、2个细胞核。