一株具有低温降解石油功能的交替假单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一株在海洋环境中具有低温降解石油功能的交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.DC‑2，其保藏号为CGMCC No.11633。该菌株筛选自我国北方受石油污染的海域，可在低温条件下高效地降解石油，特别是可在0℃的极端环境下高效地降解石油。本发明的交替假单胞菌DC‑2可应用于海洋石油污染的生物修复中，尤其可应用于我国北方海域冬季(包括冰期)等低温环境下的溢油生物修复工作中。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一株海洋低温菌及其在海洋石油污染生物修复中的应用。所述菌株在海洋环境中具有能在0℃的极端条件下高效降解石油烃的特点，可用于我国北方海域冰期溢油的生物修复工作。

背景技术

随着海洋运输业的高速发展和海洋开采业的快速崛起，海洋溢油事故日益频发，使得海洋环境的平衡遭到了严重的破坏。在冬季，特别是冰期，发生海上溢油事故，由于短链石油烃蒸发缓慢，长链烃凝为固体，使有机污染物持久存在，会对当地生态系统造成相当大的危害，而且也加大了溢油应急和生态修复工作的难度。在我国北方地区，尤其北黄海和渤海海域，一年中有近5个月处于低温期，冬季海水温度平均在2℃左右，也会有结冰期。虽然目前已经发现了一些能在0℃左右降解石油的海洋低温降解菌，但菌源主要来自极地环境。外源菌的大量引入易对生态环境产生威胁，因此在我国低温海域筛选出高效的低温降解石油烃的细菌本地种，进一步商业化，对我国北方海域的石油污染清除将有很高的应用价值，也会产生出可观的经济效益。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足提供一株在低温条件下可降解石油的海洋石油降解菌。该菌株筛选自我国北方受石油污染的海域，可在0℃的极端环境下高效地降解石油。

本发明所提供的具有在低温条件下降解石油性能的交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DC-2是从大连海域筛选获得的。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)保藏，保藏号为CGMCC No.11633，保藏日期为2015年11月09日。

本发明的Pseudoalteromonas sp.DC-2的特征如下：

(1)菌落特征：乳白、不透明、隆起、边缘不规则。

(2)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)。菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的16S rDNA序列具体可见序列表。

(3)石油降解性能特征：经过30天的降解实验后，柴油降解率可达52％。

本发明还提供交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)DC-2在低温条件下降解石油中的应用，优选地，该菌降解石油中的石油烃。所述低温条件是指0℃～15℃，尤其是指0℃～4℃，最好为0℃。本发明的交替假单胞菌DC-2可应用于海洋石油污染的生物修复中，尤其可应用于低温环境中。

本发明的有益效果：

本发明的Pseudoalteromonas sp.DC-2是一株高效海洋低温石油降解菌，即使是在0℃的条件下还能保持较高的石油烃降解活力。

本发明的菌株培养方法简单，培养基原料易得，菌株对石油烃降解能力强，适用于我国北方海域溢油(包括冰期溢油)的生物修复工作。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。另外，下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。

下述实施例采用的培养基及其组成为如下：

MMC培养基为：NaCl 24g，NH₄NO₃>2PO₄>2HPO₄3.0g，MgSO₄·7H₂O>2>3·6H₂O>40.005mg/L，MnCl₂·4H₂O>4·7H₂O>

2216E液体培养基为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，加去离子水至1000mL，pH值7.4～7.8；

2216E琼脂培养基为：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，琼脂15g，加去离子水至1000mL，pH值7.4～7.8。

实施例1菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的分离与鉴定

1.菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的分离

(1)样品采集：大连港大港区客滚码头附近的表层海水；

(2)富集驯化：于250mL三角瓶中加入100mL MMC培养基，120℃下灭菌15min，加入采集回来的海水样品5mL和灭菌后的柴油1mL。将混合液置入生化培养箱，于150r/min、10℃下振荡培养30d；培养结束后取培养液5mL进行下一轮转接培养：将5mL培养液加入到已灭菌的含有1mL柴油的100mL MMC培养液中，于150r/min条件下培养30d。重复上述步骤，每轮的培养温度比上一轮低1℃，直至0℃，并在0℃条件下长期驯化；

(3)分离纯化：将经过富集驯化的微生物培养液进行梯度稀释，并在2216E固体培养基上进行平板划线，0℃培养直至长出清晰菌落。挑选生长良好的菌落，在已灭菌的2216E固体培养基上分3个区域进行划线，置入生化培养箱，于0℃下培养。挑取3区具有生长优势的单菌落，进行二次划线分离。如此反复多次划线，直到分离出菌落单一的菌株，命名为菌株DC-2。

2.菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的鉴定

(1)菌落特征：乳白、半透明、湿润、隆起、边缘不规则。

(2)遗传学特征：16S rDNA分析，表明其属于交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)，被分类为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.11633，保藏日期为2015年11月09日。16S rDNA序列如SEQ ID No.1。

实施例2菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2的发酵

用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角瓶锥形中，低温振荡培养7d(0℃，120r/min)，成为种子液；将种子液按10％体积比加入2216E液体培养基中，0℃下培养7天，获得发酵液。

实施例3在0℃条件下菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2石油烃降解率的测定

(1)降解菌种子液

用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角瓶锥形中，低温振荡培养7d(0℃，120r/min)。

(2)降解培养

将1mL柴油加入装有100mL已灭菌的MMC液体培养基的三角瓶锥形中，按照10％的接种量接种菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2种子液，低温振荡培养30d(0℃，120r/min)。以不接种降解菌的培养液作为空白组。

(3)萃取

降解培养结束后，在培养液中加入3mL 50％的硫酸溶液进行酸化。将酸化后的培养液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充分振荡后静置。液体明显分层后把下层液体转至三角瓶中，上层液离心后通过铺满无水硫酸钠的砂芯漏斗过滤除水后收集，进行下一步分析。萃取2～3次，然后合并上层液。

(4)柴油标准曲线绘制

称取0.1g油样品溶于正己烷中，移至100ml的容量瓶中，定容得到浓度为1.00mg/ml的油标准储备溶液。移取5ml油标准储备溶液于50ml容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为0.1mg/ml油标准使用液。分别移取一定量的0.1mg/ml油标准使用液于25ml容量瓶中，用正己烷定容，得到一系列已知浓度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm处测其吸光度。以油浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。

(5)测量

采用紫外分光光度计吸光度测量。在227nm的波长下，以正己烷的吸光度为参比，用10mm石英比色皿测萃取液吸光度。若吸光值超过标准曲线范围，则对萃取液按照1/10的比例逐级稀释。根据标准曲线，算出其相应的浓度。

(6)结果

降解率的计算：降解率D＝(C₀－C₁)/C₀×100％

式中C₀：空白瓶(不加菌)中柴油的浓度；C₁：实验瓶(加菌)中柴油的浓度。

计算结果为降解率为52％，说明在0℃条件下本发明的菌株对柴油中石油烃具有高效的降解能力。

实施例4在15℃条件下菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2石油烃降解率的测定

(1)降解菌种子液

用无菌接种环挑取纯化后的菌苔至装有100mL已灭菌的2216E液体培养基的三角瓶锥形中，低温振荡培养5d(15℃，120r/min)。

(2)降解培养

将1mL柴油加入装有100mL已灭菌的MMC液体培养基的三角瓶锥形中，按照10％的接种量接种菌株Pseudoalteromonas sp.DC-2种子液，低温振荡培养30d(15℃，120r/min)。以不接种降解菌的培养液作为空白组。

(3)萃取

降解培养结束后，在培养液中加入3mL 50％的硫酸溶液进行酸化。将酸化后的培养液移入250mL的分液漏斗中。用20mL的正己烷清洗空三角瓶后把正己烷倒入分液漏斗，充分振荡后静置。液体明显分层后把下层液体转至三角瓶中，上层液离心后通过铺满无水硫酸钠的砂芯漏斗过滤除水后收集，进行下一步分析。萃取2～3次，然后合并上层液。

(4)柴油标准曲线绘制

称取0.1g柴油样品溶于正己烷中，移至100ml的容量瓶中，定容得到浓度为1.00mg/ml的油标准储备溶液。移取5ml油标准储备溶液于50ml容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为0.1mg/ml油标准使用液。分别移取一定量的0.1mg/ml油标准使用液于25ml容量瓶中，用正己烷定容，得到一系列已知浓度的油溶液。采用紫外分光光度法，在227nm处测其吸光度。以油浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线。

(5)测量

采用紫外分光光度计吸光度测量。在227nm的波长下，以正己烷的吸光度为参比，用10mm石英比色皿测萃取液吸光度。若吸光值超过标准曲线范围，则对萃取液按照1/10的比例逐级稀释。根据标准曲线，算出其相应的浓度。

(6)结果

降解率的计算：降解率D＝(C₀－C₁)/C₀×100％

式中C₀：空白瓶(不加菌)中柴油的浓度；C₁：实验瓶(加菌)中柴油的浓度。

计算结果为降解率为61％，说明在15℃条件下本发明的菌株对柴油具有高效的降解能力。