金银花提取物及相关产品的原料是否掺杂忍冬藤的检测方法

摘要

本发明公开了一种金银花提取物及相关产品的原料是否掺杂忍冬藤的检测方法，能够判断金银花提取物及相关产品生产时是否掺杂忍冬藤投料。该检查方法包括以下步骤：待测样品混匀、提取；HPLC色谱分析，包括HPLC色谱图的测定、目标成分色谱峰的定位、峰面积比值的计算。本发明方法操作简便，步骤简单；供试品溶液和对照品溶液的制备过程中未用到有机试剂，分析成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及中药提取物质量控制技术领域,特别涉及一种金银花提取物及相关产品的原料是否掺杂忍冬藤的检测方法。

背景技术

忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的花和茎枝均可入药，干燥花蕾或带初开的花即金银花(夏初开放前采收)，干燥茎枝即忍冬藤(秋、冬二季采割)。通过赴药材市场、药店调研，发现两者价格差异巨大，金银花的价格约为忍冬藤的10倍左右。金银花提取物及相关产品应以金银花进行投料，但为了节约成本，某些不法分子可能以忍冬藤代替投料，或掺入部分忍冬藤进行投料。

从外观性状上，金银花和忍冬藤原药材易于区分，但由于来源于同一植物，两者提取物的成分接近，即使金银花提取物及相关产品以忍冬藤投料，现有技术也很难加以辨别。多数金银花提取物及相关产品仅以绿原酸作为指标成分，评判产品的真伪优劣，但是忍冬藤中也含有大量绿原酸，上述方法并不能防止以忍冬藤违规投料的行为，而现有技术中也没有对这种行为进行监督和检验的方案的记载。

发明内容

为了解决以上现有技术中无金银花提取物及相关产品在投料时是否掺杂忍冬藤的检验方法，本申请提供了一种金银花提取物及相关产品的原料是否掺杂忍冬藤的检测方法。

经过长期研究，从忍冬藤中分离得到一种咖啡酰奎宁酸糖苷：5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，经HR-ESI-MS、2D NMR技术确定该化合物结构式如下：

该成分是忍冬藤的主要成分之一，但金银花中该成分含量很低。研究发现，通过HPLC色谱图中绿原酸与5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸峰面积的比例，可以判断金银花提取物及相关产品中是否掺杂忍冬藤投料。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种金银花提取物及相关产品的原料是否掺杂忍冬藤的检测方法，包括以下步骤：

(1)取供试品金银花提取物及相关产品，混匀，取适量，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声功率500W，频率40kHz处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，收集续滤液；

(2)精密吸取续滤液，注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积分数比0.1％～1％的冰醋酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→20min：乙腈8％→15％，体积份数比0.1％～1％的冰醋酸溶液92％→85％，检测波长为327nm，以对照品进行定位，测定样品中绿原酸和5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸峰面积的比值X；

步骤(2)中比值X小于69，判断为投料金银花药材中掺入了超过总重量5％的忍冬藤药材。

步骤(2)中比值X小于42，判断为投料金银花药材中掺入了超过总重量10％的忍冬藤药材。

步骤(2)中比值X小于25，判断为投料金银花药材中掺入了超过总重量20％的忍冬藤药材。

上述步骤(1)中金银花提取物及相关产品，包括以水或低浓度的甲醇或乙醇溶液(甲醇或乙醇体积百分比小于50％)作为提取溶剂，得到的金银花药材单一提取物、金银花与其它中药共同提取得到复方提取物，以及添加了上述提取物的药品、食品、保健食品和化妆品。当应用于复方提取物及其相关产品时，本方法适用于其中的绿原酸与5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸仅来源于投料金银花或忍冬藤药材的情况，也就是说其它中药中不含有绿原酸和5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸。

上述步骤(2)中定位用对照品溶液的制备，优选分别取绿原酸和5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品适量，精密称定，加水制成质量浓度分别为20μg/mL和30μg/mL的溶液。

所述的方法，优选定位用5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品通过以下步骤得到：

(1)取忍冬藤药材500g，粉碎成粗粉，加8倍量体积分数为50％的甲醇溶液，超声功率500W，频率40kHz提取2次，每次0.5小时，合并提取液并滤过，以旋转蒸发仪回收提取溶剂至干，得干浸膏a；

(2)干浸膏a加等量水使溶解，以D101大孔吸附树脂柱进行纯化，柱填料用量为干浸膏重量的2倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，收集洗脱液并合并，以旋转蒸发仪回收溶剂至干得干浸膏b；

(3)干浸膏b加等量水使溶解，以Sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，柱体积为样品水溶液体积的15倍，以水为洗脱溶剂，洗脱3个柱体积，以40分之一柱体积作为一份收集洗脱液，以HPLC进行检测，合并含有目标成分的洗脱液，以旋转蒸发仪回收溶剂至干，以Sephadex LH-20凝胶柱反复纯化2次，得到干浸膏c；

(4)干浸膏c加水使溶解，0.45μm微孔滤膜滤过，经半制备HPLC纯化，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为乙腈-0.4％冰醋酸溶液，体积比4:96，327nm检测，收集含有目标成分的洗脱液，收集液经浓缩干燥后可得5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸，按照峰面积归一化法计算，纯度大于98％。

步骤(1)中待检金银花提取物及相关产品加水溶解后，每100mL相当于含有金银花原药材0.5～5g。

所述的金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。

所述的忍冬藤为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝。

所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。

有益效果：

1)本发明方法顺利解决了现有技术中无金银花提取物及相关产品中是否违规以忍冬藤投料的检测方法；

2)方法操作简便，步骤简单；供试品溶液和对照品溶液的制备过程中未用到有机试剂，降低了分析成本。

附图说明

图1为实施例1中2.3项下5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品溶液HPLC色谱图；

图2为实施例1中2.3项下绿原酸对照品溶液HPLC色谱图；

图3为实施例1中2.3项下金银花提取物供试品溶液的HPLC色谱图；

图4为实施例1中3.1项下8号金银花药材自制金银花提取物供试品溶液的HPLC色谱图；

图5为实施例1中3.2项下2号忍冬藤药材自制忍冬藤提取物供试品溶液的HPLC色谱图；

图6为实施例1中3.3项下自制5％忍冬藤投料的金银花提取物供试品溶液的HPLC色谱图；

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。

实施例1

1仪器与试药

仪器：Sartorius CP225D电子天平；Agilent 1200高效液相色谱仪。

对照品及来源：5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸(成分A)，自制，以峰面积归一化法测定，含量大于98％；绿原酸(成分B)，中国食品药品检定研究院提供，批号：110753-201314，含量：96.6％。

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，水为Millipore制备的纯化水，其他试剂均为分析纯。

2色谱条件

2.1对照品溶液的制备

5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品溶液：精密称取5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸对照品15.36mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液A(0.1536mg/mL)。精密量取上述对照品贮备液A 10mL，置50mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为30.72μg/mL的对照品溶液A。

绿原酸对照品溶液：精密称取绿原酸对照品11.00mg，置100mL量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液B(0.1063mg/mL)。精密量取上述对照品贮备液B 5mL，置25mL量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到浓度为21.25μg/mL的对照品溶液B。

2.2金银花提取物供试品溶液的制备取待检查金银花提取物(市场购买)，粉碎，混匀，取约0.1g(按提取率20％计算，相当于金银花原药材0.5g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声功率500W，频率40kHz处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件

Dikma Technologies PLATISIL^TM>

分别精密吸取2.1项下对照品溶液A和对照品溶液B、2.2项下金银花提取物供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，进行测定。结果对照品和供试品中5-O-[4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)咖啡酰基]奎宁酸和绿原酸色谱峰的峰型较好，理论板数、分离度、对称因子均符合相关要求，证明该色谱条件可行。色谱图分别见图1～3。

3方法学考察

3.1金银花提取物中两种成分的比例

方案：收集多批金银花药材，自制标准金银花提取物，考察其中成分B和成分A的比例关系。金银花提取物一般以水为溶剂进行回流提取，故制备标准金银花提取物时模拟上述提取过程。

自制金银花提取物供试品溶液的制备：取金银花药材，粉碎，混匀，取约1g，精密称定，精密加水100mL，称重，回流提取1h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液A和对照品溶液B、3.1项下自制金银花提取物供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表1。

表1自制金银花提取物考察结果

3.2忍冬藤提取物中两种成分的比例

方案：收集多批忍冬藤药材，以3.1项下金银花提取物的提取工艺，自制忍冬藤提取物，考察其中成分B和成分A的比例关系。

自制忍冬藤提取物供试品溶液的制备：取忍冬藤药材，粉碎，混匀，取约1g，精密称定，精密加水100mL，称重，回流提取1h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液A和对照品溶液B、3.2项下自制忍冬藤提取物供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表2。

表2自制忍冬藤提取物考察结果

根据表1测定结果，金银花提取物中成分B和成分A峰面积比值的最大值为236.70，最小值为118.98，平均值为186.76；根据表2测定结果，忍冬藤提取物两种成分峰面积比值最大值仅为1.41，最小值为0.53，平均值为1.05。金银花提取物与忍冬藤提取物相比较，上述峰面积比值差异巨大(平均值相差177.87倍)，因而可以通过测定该比值反映金银花提取物是否以忍冬藤投料。

3.3以不同比例忍冬藤投料的金银花提取物中两种成分的比例

方案：取金银花药材，加入不同比例的忍冬藤药材，制备提取物，考察其中成分B和成分A的比例关系。

表1中8号金银花药材提取物中成分A和成分B各自峰面积、二者比值均处于平均值水平(8号金银花药材提取物HPLC色谱图见图4)，因而选择该批药材进行考察能够反映金银花药材的平均水平。同理，选择表2中2号忍冬藤药材(2号忍冬藤药材提取物HPLC色谱图见图5)进行试验。

自制1％忍冬藤投料的金银花提取物供试品溶液的制备：取忍冬藤(忍冬藤药材2号)和 金银花(金银花药材8号)药材粉末混匀，使忍冬藤占药材总重量的1％，取约1g，精密称定，精密加水100mL，称重，回流提取1h，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按照上述方法，分别制备5％、10％、20％忍冬藤投料的金银花提取物供试品溶液。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液A和对照品溶液B、3.3项下自制以不同比例忍冬藤投料的金银花提取物供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表3。

表3自制不同比例忍冬藤投料的金银花提取物考察结果

根据表3测定结果，投料药材中忍冬藤比例越大，成分B和成分A峰面积比值越小。以5％忍冬藤进行投料(HPLC色谱图见图6)，该比值为69.97，已经显著低于表1中测定的金银花提取物最小比值(118.98)。

综上，当金银花提取物中成分B和成分A峰面积比值小于69时，金银花提取物原料药材金银花中可能掺入了超过5％的忍冬藤；当金银花提取物中成分B和成分A峰面积比值小于42时，金银花提取物原料药材金银花中可能掺入了超过10％的忍冬藤；当金银花提取物中成分B和成分A峰面积比值小于25时，金银花提取物原料药材金银花中可能掺入了超过20％的忍冬藤。

4样品测定

以含有不同比例忍冬藤的金银花药材进行提取，自制验证用金银花提取物，对建立的方法进行验证。从不同生产企业购买多批金银花提取物(见表4)，以建立的方法检查是否存在掺入忍冬藤进行投料的情况。

供试品溶液的制备：取待测金银花提取物粉碎，混匀，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加水50mL，密塞，称定重量，超声功率500W，频率40kHz处理30分钟，取出，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

分别精密吸取2.1项下对照品溶液A和对照品溶液B、上述供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表4。

表4市售金银花提取物测定结果

根据上表测定结果，以8％忍冬藤投料的自制验证用①号提取物，B与A峰面积比(54.17)落在3.3项下测定的5％和10％忍冬藤投料的比值之间，以15％忍冬藤投料的自制验证用②号提取物，B与A峰面积比(32.05)落在3.3项下测定的10％和20％忍冬藤投料的比值之间，证明建立的方法准确、可靠。

共收集到11家生产企业的18批金银花提取物样品，其中涉及5家企业的9批样品成分B与A峰面积比值小于69，可能掺入了超过5％的忍冬藤，占总批次的50％；其中8批峰面积比值甚至小于25，以忍冬藤投料的情况比较严重。根据上述结果，金银花提取物生产企业 掺入忍冬藤投料的情况比较普遍，本发明公开的检查方法在规范金银花提取物市场方面将发挥巨大的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。