使用反向法高效合成长RNA

摘要

本发明涉及已开发和公开的约100‑聚体至约200‑聚体范围内的RNA寡聚体的5’→3’反向合成的新方法。使用该方法显示高质量RNA合成的偶联效率接近99％。

说明书

交叉引用

该专利合作条约申请基于2013年9月14日提交的第61/877,980号美国临时专利申请并要求其权益，将其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及使用单体亚磷酰胺合成长RNA寡聚体，和适用于以5’→3’反向合成RNA寡核苷酸的相应的固体载体。具体地，本发明涉及使用适用于合成约100-聚体至约200-聚体的长RNA寡聚体的实验条件。

发明背景

现在，以3’→5’方向合成确定序列的RNA是十分明确的，并且目前用于合成和开发很多种治疗级RNA适配子、tRNA、siRNA和生物学活性RNA分子。该3’→5’合成法利用3’-亚酰胺和3’-载体来产生寡核苷酸。

然而，3’→5’合成法的主要缺点为O-TBDMS基从3’-位迁移到2’-位，反之亦然：

相比之下，5’→3’合成法，也被称为“反向”合成或“反合成”，已经成功地避免了O-TBDMS基团迁移的问题。5’→3’合成法利用5’-亚酰胺和5’-载体产生寡核苷酸，并且可以总结为：

用于RNA合成的5’→3’法记载在美国专利8,309,707和美国专利8,541,569中。通过5’→3’法，成功地得到了各种长度的RNA，如31-聚体、43-聚体、74-聚体和76-聚体。例如：

A.31-聚体富-G的RNA嵌合体的合成(包含16个鸟苷的寡核苷酸)(参见图1)。序列为：5’-ACG>

B.43-聚体RNA的合成(参见图2)。序列为：GGC>

“6”表示修饰的碱基2’-O-甲基腺苷；

“7”表示修饰的碱基2’-O-甲基胞苷；

“8”表示修饰的碱基2’-O-甲基鸟苷；和

“9”表示修饰的碱基2’-O-甲基尿苷。

C.74-聚体RNA的合成(参见图3)。序列为：UCC>

D.76-聚体RNA的合成(参见图4)。序列为：GCC>

然而，存在对实现更长的RNA的合成的需求，如100-聚体至200-聚体，尤其是在用于RNA合成的5’→3’法的应用中。

同时，若干情形使得对更长的RNA的研究非常关键。

(A)已知的是非编码RNA(ncRNA)调节哺乳动物X-染色体失活，并且还可以经加工以产生小RNA(http://genesdev.cshlp.org/content/23/13/1494.long)。

(B)RNA干扰(RNAi)机制在转录后调节基因表达的微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)的生成中具有明确表征的作用。被称为mrhl的2.4-kb的非剪接的聚腺苷酸化的核保留的ncRNA经Drosha加工产生80-nt的小RNA。

(C)虽然miRNA和piwi干扰RNA(piRNA)近来已受到最多的关注，但长RNA转录本在调节加工为具有可能的不同和独特功能的小RNA中具有重要作用。

(D)长ncRNA可以经加工以产生小RNA，但其还可以影响其他转录本被加工的方式；例如，通过调节其被切割为小RNA的能力或改变其前体mRNA剪接模式。

(E)ncRNA可以抑制由其他转录本产生小RNA。

(F)非编码RNA和激素调节是新兴领域。

发明概述

下式的RNA寡核苷酸的合成方法：

其中：

B为选自以下的成员：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、尿嘧啶、肌苷、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤和5-氟-胞嘧啶；

n为100至约200的整数；

L为核苷，选自以下的非核苷配体：具有连接体或间隔基团的胆固醇、生物素、乙二醇、甘油、聚乙二醇、六甘醇、氨基连接体、二硫化物连接体、肽连接体、多肽连接体、蛋白质、荧光团、淬灭剂染料、一个或多个2’,5’-连接的脱氧核苷单元、一个或多个2’,5’-连接的核糖核苷单元和一个或多个2’,5’-连接的脱氧核糖单元，

其中L通过插入的磷酸连接在RNA核苷酸的3’-端处；和

以RNA核苷酸的5’-端到3’-端的方向合成RNA的方法，并且所述方法包括以下步骤：

(a)取式2表示的核苷固体载体：

其中：

M为氢基团或连接体；

如果M为连接体，则其由式Y-C(O)表示，并任选地连接到适用于寡核苷酸合成的固体载体，

其中Y为长度为2个碳至20个碳的烃双基团部分，并且Y选自烷基、烯基、环烷基、芳基和芳烷基，所述烃双基团部分任选地包括插入的-O-、-S-、-S(O)₂-、-C(O)-和-NR₆-，其中R₆为氢基团，或取代的C₁至C₂₀烷基或取代的芳烷基；

W选自氧双基团、N-H双基团和氟基团，并且选择R以使：

如果W为氧双基团，则R为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)或三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基(TOM)；和

如果W为N-H双基团，则R为R₅^X的形式，其中x选自芴甲氧羰基(Fmoc)、三氟乙酰基、乙酰基、烷酰基和芳酰基；和

如果W为氟基团，则R不存在；

B选自核苷碱基基团，所述核苷碱基基团由9-(N⁶-苯甲酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-叔丁基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-异丙基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、1-(N⁴-苯甲酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)胞嘧啶基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、9-(N²-异丁基鸟嘌呤基)-、9-(N²-叔丁基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、9-(N²-异丙基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-和1-尿嘧啶基-组成；或

B为修饰的核苷碱基基团，其选自1-(N⁴-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(5-甲基-尿嘧啶基)-、1-(5-氟-尿嘧啶基)-、1-(N⁴-苯甲酰基-5-氟胞嘧啶基)-、9-(N⁶-苯甲酰基-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N²-异丁基-7-脱氮鸟嘌呤基)-和9-(N²-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮鸟嘌呤基)-；

Z为保护基，所述保护基由二甲氧基三苯基(DMT)、单甲氧基三苯基(MMT)和三甲氧基三苯基(TMT)组成；

(b)将式1表示的亚磷酰胺放置在寡核苷酸合成仪上；

其中

Y为氧原子或硫原子；

W选自氧双基团、N-H双基团和氟基团；以及选择R₄以使：

如果W为氧双基团，则R₄为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)或三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基(TOM)；和

如果W为N-H双基团，则R₄为R₅^X的形式，其中x选自芴甲氧羰基(Fmoc)、三氟乙酰基、乙酰基、烷酰基和芳酰基；和

如果W为氟基团，则R₄不存在；

B选自核苷碱基基团，所述核苷碱基基团由9-(N⁶-苯甲酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-叔丁基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-异丙基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、1-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)腺嘌呤基)-、1-(N⁴-苯甲酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)胞嘧啶基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、9-(N²-异丁基鸟嘌呤基)-、9-(N²-叔丁基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、9-(N²-异丙基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-和1-尿嘧啶基-组成；或

B为修饰的核苷碱基基团，其选自1-(N⁴-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(5-甲基-尿嘧啶基)-、1-(5-氟-尿嘧啶基)-、1-(N⁴-苯甲酰基-5-氟胞嘧啶基)-、9-(N⁶-苯甲酰基-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N²-异丁基-7-脱氮鸟嘌呤基)-和9-(N²-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮鸟嘌呤基)-；

Z为保护基，所述保护基由二甲氧基三苯基(DMT)、单甲氧基三苯基(MMT)和三甲氧基三苯基(TMT)组成；

R₁为烷基或芳基基团；

R₂为烷基或芳基基团；和

R₃为氰乙基、烷基或芳基基团。

B为氢或任选地在每个伯胺处被氨基保护基官能化的核碱基。

(c)从式2表示的核苷固体载体脱除保护基Z；

(d)通过使用辅助试剂的混合物在寡核苷酸合成仪中将式2的核苷和式1的亚磷酰胺偶联来进行RNA合成的方法，产生具有至少一种保护基的寡核苷酸；

(d)提供具有L基团的亚磷酰胺；

(e)在寡核苷酸末端添加具有L基团的亚磷酰胺，产生具有L基团的寡核苷酸；

(f)使具有L基团的寡核苷酸与固体载体分离；

(g)从寡核苷酸脱除至少一种保护基；

(h)脱除甲硅烷基保护基以得到寡核苷酸；

(i)沉淀寡核苷酸；和

(j)分析寡核苷酸，用于确定纯度，其中

辅助试剂包括CAP A(苯氧基乙酸酐/四氢呋喃/吡啶)、CAP B(10％N-甲基咪唑/四氢呋喃)、DMT脱除试剂(3％TCA的甲苯溶液)、氧化溶液(0.05M碘/吡啶/水/四氢呋喃)和活化试剂(0.35M的5-乙基硫代-1-H-四唑的乙腈溶液)

合成RNA寡核苷酸的方法，其中L为具有连接体或间隔基团的胆固醇，并且n为100至约200的整数。

合成RNA寡核苷酸的方法，其中L为聚乙二醇(PEG)，并且n为100至约200的整数。

一种RNA寡核苷酸，其中所述RNA寡核苷酸通过所述合成RNA寡核苷酸的方法合成。

一种100-聚体至约200-聚体长链RNA的RNA合成方法，其使用反向RNA合成法。

一种长链RNA嵌合体，其包括脱氧的主链修饰的碱基、修饰的DNA和修饰的RNA碱基。

一种在末端、在分支点或在链内具有一个或多个5',2'、2',3'键的长链RNA，其使用反向法得到。

一种长链RNA，其由天然和修饰核苷、无碱基位点、反向无碱基位点、发色团和配体组成，其使用反向合成法得到。

一种长链RNA，可以包括发色团、配体、单磷酸、二磷酸或三磷酸基团，其使用反向合成法得到。

一种长链RNA，其具有分支点，所述分支点具有一个或多个脱氧核糖核苷、修饰的脱氧核糖核苷或修饰的核糖核苷，其使用反向合成法得到。

一种纯化通过反向法合成的长链RNA的方法，其采用HPLC凝胶电泳或其他RNA纯化技术。

一种将通过反向法合成的长链RNA标记和连接到表面上的方法。

一种在分子生物学研究和开发中使用通过反向法合成的长链RNA的方法。

附图简述

图1涉及31-聚体RNA的合成。

图2涉及43-聚体RNA的合成。

图3涉及74-聚体RNA的合成。

图4涉及76-聚体RNA的合成。

图5是100-聚体合成的三苯甲基条形图。

图6是150-聚体合成的三苯甲基条形图。

图7是200-聚体合成的三苯甲基条形图。

图8是200-聚体合成的UV分析。

图9是聚-核糖腺苷100-聚体合成的IE HPLC、聚-核糖腺苷150-聚体合成的IEHPLC和聚-核糖腺苷200-聚体合成的IE HPLC。

图10是聚-核糖腺苷100-聚体和200-聚体寡核苷酸的凝胶。

本发明的详细描述

总的来说，本发明涉及“长RNA”，其通常被认为是至少约100-聚体，和可以是约200-聚体或甚至更长的RNA寡核苷酸。术语“长RNA”和“超长RNA”在整个发明中可互换使用。

为了实现约100-聚体至约200-聚体的长RNA的合成，高效率偶联和减少的偶联时间两者都是关键的。

在方法中使用的辅助试剂的新组合对实现约100-聚体至约200-聚体范围内的长RNA的合成是关键的。实验的细节描述如下。

表1.聚-核糖腺苷寡核苷酸100-聚体、150-聚体和200-聚体的合成

其中“5”表示5’-末端磷酸

根据本发明，以5’至3’方向合成RNA寡核苷酸的方法涉及下式的RNA寡核苷酸：

其中：

B为选自以下的成员：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、尿嘧啶、肌苷、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤和5-氟-胞嘧啶；

n为100至约200的整数；

L为核苷，选自以下的非核苷配体：具有连接体或间隔基团的胆固醇、生物素、乙二醇、甘油、聚乙二醇、六甘醇、氨基连接体、二硫化物连接体、肽连接体、多肽连接体、蛋白质、荧光团、淬灭剂染料、一个或多个2’,5’-连接的脱氧核苷单元、一个或多个2’,5’-连接的核糖核苷单元和一个或多个2’,5’-连接的脱氧核糖单元，

其中L通过插入的磷酸连接在RNA核苷酸的3’-端处。

以RNA核苷酸的5’-端到3’-端的方向合成RNA的方法，并且所述方法包括以下步骤：

(a)取式2表示的核苷固体载体：

其中：

M为氢基团或连接体；

如果M为连接体，则其由式Y-C(O)表示，并任选地连接到适用于寡核苷酸合成的固体载体，

其中Y为长度为2个碳至20个碳的烃双基团部分，并且Y选自烷基、烯基、环烷基、芳基和芳烷基，所述烃双基团部分任选地包括插入的–O-、-S-、-S(O)₂-、-C(O)-和-NR₆-，其中R₆为氢基团，或取代的C₁至C₂₀烷基或取代的芳烷基；

W选自氧双基团、N-H双基团和氟基团，并且选择R以使：

如果W为氧双基团，则R为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)或三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基(TOM)；和

如果W为N-H双基团，则R为R₅^X的形式，其中x选自芴甲氧羰基(Fmoc)、三氟乙酰基、乙酰基、烷酰基和芳酰基；和

如果W为氟基团，则R不存在；

B选自核苷碱基基团，所述核苷碱基基团由9-(N⁶-苯甲酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-叔丁基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-异丙基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、1-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)腺嘌呤基)1-(N⁴-苯甲酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)胞嘧啶基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、9-(N²-异丁基鸟嘌呤基)-、9-(N²-叔丁基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、9-(N²-异丙基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-和1-尿嘧啶基-组成；或

B为修饰的核苷碱基基团，其选自1-(N⁴-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(5-甲基-尿嘧啶基)-、1-(5-氟-尿嘧啶基)-、1-(N⁴-苯甲酰基-5-氟胞嘧啶基)-、9-(N⁶-苯甲酰基-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N²-异丁基-7-脱氮鸟嘌呤基)-和9-(N²-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮鸟嘌呤基)-；

Z为保护基，所述保护基由二甲氧基三苯基(DMT)、单甲氧基三苯基(MMT)和三甲氧基三苯基(TMT)组成；

(b)将式1表示的亚磷酰胺放置在寡核苷酸合成仪上；

其中

Y为氧原子或硫原子；

W选自氧双基团、N-H双基团和氟基团；以及选择R₄以使：

如果W为氧双基团，则R₄为叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)或三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基(TOM)；和

如果W为N-H双基团，则R₄为R₅^X的形式，其中x选自芴甲氧羰基(Fmoc)、三氟乙酰基、乙酰基、烷酰基和芳酰基；和

如果W为氟基团，则R₄不存在；

B选自核苷碱基基团，所述核苷碱基基团由9-(N⁶-苯甲酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-叔丁基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、9-(N⁶-异丙基苯氧基乙酰基腺嘌呤基)-、1-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)腺嘌呤基)1-(N⁴-苯甲酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)胞嘧啶基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、9-(N²-异丁基鸟嘌呤基)-、9-(N²-叔丁基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、9-(N²-异丙基苯氧基乙酰基鸟嘌呤基)-、1-(N⁴-苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-叔丁基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-异丙基苯氧基乙酰基胞嘧啶基)-和1-尿嘧啶基-组成；或

B为修饰的核苷碱基基团，其选自1-(N⁴-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-(N,N-二甲基甲脒基)-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(N⁴-乙酰基-5-甲基胞嘧啶基)-、1-(5-甲基-尿嘧啶基)-、1-(5-氟-尿嘧啶基)-、1-(N⁴-苯甲酰基-5-氟胞嘧啶基)-、9-(N⁶-苯甲酰基-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N⁶-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮腺嘌呤基)-、9-(N²-异丁基-7-脱氮鸟嘌呤基)-和9-(N²-(N,N-二甲基甲脒基)-7-脱氮鸟嘌呤基)-；

Z为保护基，所述保护基由二甲氧基三苯基(DMT)、单甲氧基三苯基(MMT)和三甲氧基三苯基(TMT)组成；

R₁为烷基或芳基基团；

R₂为烷基或芳基基团；和

R₃为氰乙基、烷基或芳基基团。

B为氢或任选地在每个伯胺处被氨基保护基官能化的核碱基；

(c)从式2表示的核苷固体载体脱除保护基Z；

(d)通过使用辅助试剂的混合物在寡核苷酸合成仪中将式2的核苷和式1的亚磷酰胺偶联来进行RNA合成的方法，产生具有至少一种保护基的寡核苷酸；

(d)提供具有L基团的亚磷酰胺；

(e)在寡核苷酸末端添加具有L基团的亚磷酰胺，产生具有L基团的寡核苷酸；

(f)使具有L基团的寡核苷酸与固体载体分离；

(g)从寡核苷酸脱除至少一种保护基；

(h)脱除甲硅烷基保护基以得到寡核苷酸；

(i)沉淀寡核苷酸；和

(j)分析寡核苷酸，用于确定纯度。

辅助试剂包括CAP A(苯氧基乙酸酐/四氢呋喃/吡啶)、CAP B(10％N-甲基咪唑/四氢呋喃)、DMT脱除试剂(3％TCA的甲苯溶液)、氧化溶液(0.05M碘/吡啶/水/四氢呋喃)和活化试剂(0.35M的5-乙基硫代-1-H-四唑的乙腈溶液)。

根据本发明，长RNA为具有100至200个单体的RNA寡聚体。为了实现该目标，辅助试剂对该方法是关键的。在RNA的反向合成中，即从5’-到3’-方向，辅助试剂通常是各种浓度的TCA/DCM、DCA/DCM、TCA/甲苯、DCA/甲苯、无水乙腈、CAP A、CAP B、碘/THF/吡啶/H2O、一种适合的硫化试剂、一种适合的作为乙腈溶液的活化试剂的组合。

因为其能够实现单体-5’-亚酰胺的高度偶联，在本发明中使用的辅助试剂是有帮助的。因此，在更短的偶联时间中，辅助试剂如0.3M BMT(5-苄基硫代四唑)或0.5M ETT(5-硫代乙基四唑)是特别相关的，并且与已经用于更短的RNA寡聚体的相同试剂相比，其使用不同的偶联时间并产生高偶联效率的独特结果。

根据本发明的实施方案，L为具有连接体或间隔基团的胆固醇，并且n为100至约200的整数。

在本发明的另一个实施方案中，L为聚乙二醇(PEG)，并且n为100至约200的整数。

本发明的另一个实施方案涉及通过以上方法合成的n＝100、150或约200的RNA寡核苷酸。由于RNA寡核苷酸是以5’到3’方向合成的，被称为“m+1”物质的杂质是不存在的。

如在我们公开的专利中，从我们的数据可以清楚地看出通过两种方法，即3’→5’方向和5’→3’方向合成的在3’-端具有3’-胆固醇偶联的寡核苷酸。

本发明的另一个实施方案涉及100-聚体至200-聚体的长链RNA的RNA合成方法，其使用反向RNA合成法。

本发明还包括长链RNA嵌合体，其包括脱氧的主链修饰的碱基、修饰的DNA和修饰的RNA碱基。在末端、在分支点或在链内具有一个或多个5',2'、2',3'键的长链RNA，其使用反向法得到。

根据本发明，另一个实施方案是包括天然和修饰的核苷、无碱基位点、反向无碱基位点、发色团和配体的长链RNA，其使用反向法得到。

本发明的另一个实施方案是长链RNA，其包括发色团、配体、单磷酸、二磷酸或三磷酸基团，其使用反向法得到。

本发明的又一个实施方案是长链RNA，其具有分支点，所述分支点具有一个或多个脱氧核糖核苷、修饰的脱氧核糖核苷或修饰的核糖核苷，其使用反向合成法得到。

此外，本发明包括通过HPLC凝胶电泳或其他RNA纯化技术纯化长链RNA的方法，所述长链RNA通过反向法合成。

本发明还包括将长链RNA通过合成的寡核苷酸的3’-端标记和连接到表面上的方法，所述长链RNA通过反向法合成，所述表面如各种芯片、聚乙二醇、载体。因此，向寡核苷酸引入官能团如胺官能团将实现连接到包含醛官能团的芯片或表面。

本发明还包括在分子生物学研究和开发中使用长链RNA的方法，所述长链RNA通过反向法合成。通过根据本发明的方法合成的RNA已显示具有生物化学特性，其与通过通常的3’→5’-方向方法合成的RNA有区别。

寡核苷酸合成：合成了寡核苷酸1号序列(SEQ ID No.1)(100-聚体)、2号序列(SEQ.ID No.2)(150-聚体)、3号序列SEQ.ID No.3。2号序列延长至多达200-聚体，其使用5’→3’导向的REV-RNA亚磷酰胺化学以1微摩尔规模合成，除了3号序列。3号序列以0.5微摩尔规模合成。使用标准RNA1微摩尔循环和6.0分钟的单体与固体载体的偶联时间，在Expedite8900合成仪上进行合成。在寡核苷酸合成中，5代表Universal UnyLinker载体3000A，ChemGenes目录号N-4000-30。

(1)使用的亚酰胺N⁶-tbpac-2’-O-TBDMS-3’-O-DMT-腺苷-5’-氰乙基-N,N-二异丙基-亚磷酰胺。批号AT>

(2)使用的CPG>

(3)使用的辅助试剂

无水乙腈RN-1447

CAP A(苯氧基乙酸酐/THF/吡啶)

CAP B(10％N-甲基咪唑/THF)

DMT脱除试剂(3％TCA的甲苯溶液)

氧化溶液(0.05M碘/吡啶/H₂O/THF)

活化试剂，5-乙基硫代-1-H-四唑(ETT)(0.35M的乙腈溶液)

首先将亚酰胺置于60ml加速瓶(expedite bottle)中并在干燥乙腈中溶解以制备溶液0.15M。之后，在端口A上将单体瓶连接到合成仪。

合成后，使用3.0ml二乙醚洗涤可控孔的玻璃(CPG)固体载体，并转移至2ml微量离心管。从CPG裂解寡核苷酸并通过在65℃下在1.2ml的33％甲胺的无水乙醇溶液(Aldrich目录号534102-250ML，批号SHBC2933V)中孵育45min对1号序列脱保护。

对于2号和3号序列，在65℃下在1.2ml的33％甲胺的无水乙醇溶液(Aldrich目录号534102-250ML，批号SHBC2933V)中90min。之后，在-20℃下冷却管30分钟。然后移除上清液并使用500微升水洗涤CPG；合并上清液并在真空离心浓缩仪(speed vac.)上干燥。通过使用1000微升三乙胺氢氟酸盐(Oakwood chemical，目录号003029，批号F29E)在45℃下在超声浴中处理4小时，从RNA残基脱除叔丁基二甲基甲硅烷基保护基。通过3.0ml正丁醇沉淀寡核苷酸；在-20℃下冷却样品1小时，然后在5,000g下离心10分钟。倾倒上清液，并使用正丁醇再洗涤球团一次。最后使用500微升乙腈洗涤，然后再次在5000rpm下离心5分钟，倾倒上清液。将球团溶于1000ul M.Q水中并检查OD(粗除盐)。

然后通过离子交换HPLC纯化寡核苷酸，使用高氯酸钠在pH 7.5＝缓冲液A中的线性梯度(5.0％，1.0M TRIS和10.0％甲醇)。缓冲液B＝0.5M在缓冲液A中的高氯酸钠。

将整个样品装载到Source15Q柱(1.0cm x 25cm)上并在40分钟内使用0％到85％的高氯酸钠线性梯度洗脱。在295nm下监测样品，并收集对应于希望的寡核苷酸种类的峰，通过添加5.0体积的(2％LiClO₄的丙酮溶液)沉淀，接着在5,000g下离心10分钟。倾倒上清液；使用乙醇洗涤球团。

100-聚体RNA合成的三苯甲基条形图显示在图5中。可以看出三苯甲基条形图表示寡核苷酸的每个步骤的偶联效率以一致的方式进行，并且当链长度增长时偶联未下降。

150-聚体RNA合成的三苯甲基条形图显示在图6中。可以从条形图中观察到，150-聚体的合成一致且平稳地进行，无任何显著的下降。

200-聚体RNA合成的三苯甲基条形图显示在图7中。可以观察到即使对这样长的长度的寡核苷酸，每个步骤的偶联效率也以一致的方式进行，并且当链长度增长时偶联未显著下降。

100-聚体合成、150-聚体合成和200-聚体合成的IE HPLC(图9)：以1.0微摩尔规模合成的100-聚体粗寡核苷酸如预期地在预期的洗脱时间内显示宽峰。150-聚体粗寡核苷酸的IE HPLC如预期地在预期的洗脱时间内仍然显示更宽的峰。200-聚体的IE HPLC是仍然更宽的峰并且在预期的洗脱时间内洗脱。

100-聚体和200-聚体RNA合成的凝胶(图10)显示100-聚体的带比80-聚体标记迁移稍慢。观察到200-聚体比100-聚体迁移更慢，并且比150-聚体进一步更慢。

在本发明中的反向的RNA单体亚磷酰胺在核糖核苷中携带3’-DMT基团，携带2’-tBD甲硅烷基(tBDSi)-5’-氰乙基亚磷酰胺(CED)(结构16)、3’-DMT-2’-tBD甲硅烷基-5’-琥珀酰基-Icaa CPG-n-保护的核苷(结构17)或3’-DMT-2’-三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)-5’-CED亚磷酰胺(结构18)。

结构(16)3’-DMT-2’-tBD甲硅烷基-5’-亚酰胺(反向的RNA-tBD甲硅烷基-亚酰胺)

结构(17)3’-DMT-2’-tBD甲硅烷基-5’-CPG(反向的RNA-tBD甲硅烷基-5’-IcaaCPG)

结构(18)3’-DMT-2’-TOM(三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基)-5’-亚酰胺(反向的RNA-TOM-5’-亚酰胺)

本发明还教导了用于制备公开的组合物的方法。起始的碱基受保护的核苷19提供了亚异丙基保护的核苷20。苯甲酰化接着亚异丙基脱除产生5’-苯甲酰化的核苷22。与TBDMS氯在吡啶中的连续的甲硅烷化反应分别得到2’-和3’-TBDMS保护的核苷(23和24)的混合物，比例为3：2。在柱色谱后，拆分并分离异构体，以产率％计。异构体23的进一步反应得到3’-DMT-2’-TBDMS保护的核苷26。

因此可想到的是在随后的3’-羟基的官能化过程中，将有2’-TBDMS基团的明显迁移。

在使用DMT-(4,4-二甲氧基三苯甲基)对3’-羟基官能化的过程中，未观察到显著的迁移发生。此外，3’-TBDMS保护的异构体24还涉及与异构体23相同的使用DMT氯在吡啶中的三苯甲基化反应，然而，在该反应中未观察到核苷25。因此，在2’-TBDMS保护的核苷23被其异构体24污染的情况下，不希望的异构体25不能在三苯甲基化条件下形成，并且可以以高纯度分离希望的核苷26。3’-TBDMS保护的核苷24可以用在希望产物的合成中，并由于方案1中概括的异构化方法而转化为23。

使用氢氧化钠在甲醇中脱除5’-苯甲酰基，接着使用CEDP和DIPA四唑进行磷酰化反应，得到最终的反亚磷酰胺16。

以5’→3’的方向进行使用反亚磷酰胺的寡核苷酸合成。

以下提供的实施例进一步描述本发明；这些仅是说明性的并且不应解释为以任何方式限定本发明的范围。特别地，以下实施例显示用于获得本发明的化合物的合成方法。用于制备本发明的化合物及其中间体的起始原料为市售的或可以使用已知的合成方法和试剂由市售材料制备。所有寡核苷酸序列从左侧的5’-末端写到右侧的3’-末端。3’-DMT-5’-CED亚磷酰胺的偶联效率显示每个步骤的偶联超过99％，产生高纯度RNA。已经使用这些单体亚磷酰胺合成了大量的均聚物和20-21-聚体寡核苷酸。

我们的数据显示在使用反向的RNA单体(5’→3’-方向)的寡核苷酸合成过程中，偶联效率与以3’→5’方向合成中的标准3’-CED亚磷酰胺相比无差异。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于合成具有寡核苷酸的3’-端修饰或标记的核糖核酸寡聚体的方法。需要亲脂性长链配体或发色团荧光素和淬灭剂的3’-端修饰的RNA的合成可以使用相应的亚磷酰胺进行。我们的数据显示5’→3’-方向的合成与常规方法相比具有非常明显的优点。

此外，在固体载体如HEG或PEG-2000上不可用的3’-修饰可以通过使用5’→3’-方向的合成而容易地引入，并通过反相HPLC纯化。寡核苷酸已经通过RP HPLC纯化，得到95-98％的纯产物。

实验实施例

以下说明总结了本发明的各种创新点、优点和可能性，以及一些产物和方法细节。该列表旨在充当便利和说明性的概述，并且不是完整的、穷举的或限制性的。

·通式1的衍生的核苷和亚磷酰胺：

其中

Y为氧或硫；

W为氧、氮、硫或氟；

当W不为硫时，R₄为甲硅烷基醚，如TBDMS、三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基、Fmoc、烷基、芳基或乙酰基；当在W为硫的情况下，R₄为苯甲酰基、乙酰基或二硫化物；

Z为DMT、MMT、TMT保护基；

R₁和R₂独立地选自烷基或芳基；

R₃为氰乙基、烷基或芳基。

·通式2的连接到固体载体的衍生的核苷：

其中

M为氢基团或Y-CO-；

Y为长度为2至20的原子链，基本上由以下组成：任选地被一个或多个杂原子取代的烃链，所述杂原子独立地选自氧、氮和硫；或适用于将固体载体连接到其的任何连接体，所述固体载体如CPG、聚苯乙烯或适用于寡核苷酸合成的任何其他固体载体；

W为氧、氮、硫或氟；

当W不为硫时，R为甲硅烷基醚，如TBDMS、三异丙基甲硅烷基氧基亚甲基、Fmoc、烷基、芳基、氨基或乙酰基；但是当W为硫的情况下，R为苯甲酰基、乙酰基或二硫化物；

Z为DMT、MMT、TMT保护基。

·用于在合成性RNA寡聚体中反向经由在式10中显示的寡核苷酸键形成的5’到3’方向的方法。RNA可以由以下组成：天然或修饰的核碱基、间隔基因(gapmer)、磷酸二酯、硫代磷酸酯、硒代磷酸酯。合成可以在自动化、半自动化DNA/RNA合成仪或其他合成仪上进行或手动进行。合成可以以从微克到千克级的各种规模进行。

·使用相应的亚磷酰胺(式11)将修饰连接到RNA分子的3’-末端的方法

其中L为修饰，如生物素或胆固醇，或选自荧光团、淬灭剂染料、聚乙二醇和肽。

·使用反向(5’→3’)RNA合成的自动化的高纯度RNA的合成，产生高纯度RNA。

·RNA与大分子如胆固醇、六甘醇(HEG)和聚乙二醇(PEG)的3’-偶联。

·反向(5’→3’)自动化RNA合成的应用，使得不存在M+1寡核苷酸杂质。

·通过上述方法掺入的修饰的核苷可以由一种或多种嘌呤或嘧啶修饰组成，例如但不限于：5-氟-U、5-氟dU、5-氟-dC、5-氟-rC、假尿苷、5-甲基-dU、5-甲基-rU、5-甲基-dC、5-甲基-rC、5-溴-dU、5-溴-rU、5-溴-dC、5-溴-rC、5-碘-dU、5-碘-rU、5-乙烯基-dU、5-乙烯基-rU、5-乙烯基胸苷、N-3甲基脱氧尿苷、N-3甲基-核糖尿苷、N-3甲基胸苷、4-硫代尿苷、4-硫代-2’-脱氧尿苷、2,6-二氨基嘌呤脱氧核糖核苷、N-3甲基核糖胸苷、2,6-二氨基嘌呤核糖核苷、8-溴2’-脱氧腺苷、8-溴-r-腺苷、8-氧代-脱氧腺苷、8-氧代-核糖腺苷、8-氧代-2’-脱氧-腺苷、8-氧代-核糖腺苷、8-氧代-脱氧肌苷、8-氧代-核糖肌苷、8-溴-脱氧肌苷、8-溴-核糖-肌苷、N-1甲基-核糖腺苷、N-1甲基-2’-脱氧腺苷、N-1甲基2’-脱氧肌苷、N-1甲基核糖腺苷、N-1甲基脱氧鸟苷、N-1-甲基-核糖鸟苷、亚乙烯基腺苷、亚乙烯基2’-脱氧腺苷、嘌呤2’-脱氧核糖核苷、嘌呤-核糖核苷、2-氨基嘌呤-2’-脱氧核糖核苷、2-氨基嘌呤-核糖核苷。

·通过该方法合成的RNA的内部位点的标记可以使用发色团来实现，所述发色团例如但不限于荧光素-C-5 dT、Dabcyl-C-5胸苷、内部羧基5-dU-甲基丙烯酸酯、生物素dT(通过间隔基团(spacer)连接到dU的C-5的生物素)、氨基-dT(通过C-6间隔基团连接到C-5dU的末端氨基)。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由2’-脱氧-2’-氟核糖核苷(2’-F-ANA)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-氟的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由2’-脱氧-2’-甲氧基核糖核苷(2’-OMe-)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-甲氧基的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由2’-脱氧-2’-氨基核糖核苷(2’-NH2)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-氨基的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由通过2-10个原子的间隔基团连接在核苷上的2’-脱氧-2’-末端氨基核糖核苷(2’-末端NH2)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-末端氨基的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由2’-脱氧-2’-甲氧基乙氧基核糖核苷(2’-MOE)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-MOE的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由其他2’-O-烷基，如2’-脱氧-2’-乙氧基、炔丙基、丁炔核糖核苷(2’-OEt、O-炔丙基、2’-O-丁炔)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-2’-OEt、O-炔丙基、2’-O-丁炔的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷(2’-F-ANA)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含2’-F-ANA的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·经修饰的核苷的糖修饰可以由2’-脱氧-2’-氟4’-硫代阿拉伯糖核苷(4’-S-FANA)组成，如在通过本发明的方法合成的RNA或DNA序列的一个或多个位点中包含4’-S-FANA的A、C、G、U、肌苷和修饰的核苷。

·RNA可以使用在一个或多个序列内、在序列的3’-端或在序列的5’-端的2’-5’-键实现。

·具有3’-端的RNA可以通过本发明的方法合成，其包含反向连接的脱氧核苷，如dT、dC、dG、胸苷，通过其3’-羟基官能团连接。

·具有3’-端的RNA可以通过本发明的方法合成，其包含反向连接的核糖核苷，如rA、rC、rG、rU，通过其2’或3’-羟基官能团连接。

·可以实现反向的RNA合成，其包括2’-三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)保护基。

·可以实现反向的RNA合成，其包括2’-叔丁基二硫代甲基(DTM)保护基。

·可以实现反向的RNA合成，其包括包含2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(FANA)的修饰的碱基。

·可以实现反向的RNA合成，其包括包含4’-硫代-2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(4’-硫代-FANA)的修饰的碱基。

·可以使用2’-O-甲基修饰实现反向的RNA合成，其包括修饰的糖。

·可以通过使用双环的锁核酸(LNA)实现反向的RNA合成。

·反向的RNA合成可以使用修饰的糖，其包括阿卓糖醇糖修饰的寡核苷酸(ANA)。

·反向的RNA合成可以包括以下步骤：通过在疏水性部分上的亚酰胺(amidite)官能团或通过在反向合成的具有末端氨基的寡核苷酸的3’-端处的氨基连接体在RNA的3’-端处偶联亲脂性或疏水性基团的步骤。后者合成涉及在寡核苷酸的3’-末端处的氨基和亲脂性部分上的羧基官能团之间的偶联步骤。亲脂性部分由各种二醇，如三甘醇、六甘醇、聚乙二醇、各种脂质组成。

·反向的RNA合成可以包括利用肽的任一游离胺官能团和反向合成的RNA上的3’-末端羧基官能团偶联肽的步骤，如细胞渗透性的肽(CPP)或者膜通透性的肽(MPP)。具有适合的羧基官能团的CPP和MPP可以偶联到反向合成的RNA的3’-端的游离的末端氨基官能团。

·反向的RNA合成包括在序列内、在序列的3’-端或在序列的5’-端的2’-5’-连接的DNA单元或2’-5’-RNA单元。

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等同方式。这样的等同方式被以下权利要求所涵盖。在从属权利要求中公开的实施方案的任意组合也将考虑在本发明的范围内。

本发明提供若干优点。首先，反向的RNA合成即从5’到3’方向，将产生不含M+1杂质的RNA寡核苷酸，所述杂质存在于在3’到5’方向的RNA合成中。当合成不在单体的预期数目(M)停止，而是进行到单体的非预期的数目(M+1)时，产生M+1物质。其次，粗RNA纯度范围为89％至93％，其意味着每个步骤约99.5％的偶联效率。第三，粗RNA的单次纯化产生95％-98％的纯的寡核苷酸。第四，本发明实现了用于生物医学研究的许多方面的长RNA的合成。