可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂及制备方法

摘要

可高效降解氯氰菊酯和3‑苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂及制备方法，原料为：复合菌液、硅藻土、木质素磺酸钠、吐温80、份脱脂奶粉和海藻糖，所述复合菌液由地衣芽孢杆菌B‑1菌液和鞘氨醇单胞菌SC‑1菌液组成；工艺步骤：(1)将硅藻土加入复合菌液中得到载体‑菌液混合料；将吐温80、木质素磺酸钠、脱脂乳粉和海藻糖加入与复合菌液等体积的无菌水得到助剂溶液；将助剂溶液和载体‑菌液混合料混合均匀，得到菌剂混合液；(2)将步骤(1)得到的菌剂混合液按照如下工艺参数依次进行干燥：‑46～‑48℃保持1.0～3.0h，‑36～‑40℃保持1.0～3.0h，‑26～‑30℃保持1.0～3.0h，‑15～‑20℃保持1.0～3.0h，0～4℃保持10～14h，8～12℃保持1.0～3.0h，30～40℃保持2.0～6.0h，15～25℃保持20～24h，得到可湿性菌粉剂。

说明书

技术领域

本发明属于农药氯氰菊酯降解领域，特别涉及可降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂及其制备方法。

背景技术

近年来，随着有机氯和有机磷杀虫剂的部分或全部禁用，拟除虫菊酯类农药的使用量已经占据世界杀虫剂市场的30％。氯氰菊酯是一种使用最为广泛的拟除虫菊酯类农药。但是随着其使用量和使用范围的不断增加，茶叶、果蔬和土壤中均有其残留超标的报道。残留的氯氰菊酯会通过食物链进入人体，对神经、免疫和生殖系统造成毒害。由于微生物降解氯氰菊酯具有环保、安全和高效的特点，因此其广泛被用于消除茶叶、果蔬和土壤中残留的氯氰菊酯。然而，微生物降解拟除虫菊酯类农药往往导致3-苯氧基苯甲酸的积累。3-苯氧基苯甲酸在环境中的毒性和迁移性比拟除虫菊酯类农药还要强，其会干扰人体性激素正常分泌、导致男性精子DNA断裂和精子浓度降低。

目前，国内对微生物降解拟除虫菊酯类农药的报道较多，已公开的发明专利主要包括降解氯氰菊酯菌粉的制备及其应用(如ZL 201510016653.3、ZL 200510022548.7)、降解氯氰菊酯菌液的制备及其应用(如ZL 201210013359.3、ZL 201210013350.2、ZL 200810224883.9、ZL 200810119983.5、ZL 200810010695.6)。然而，这些菌粉或菌液难以降解3-苯氧基苯甲酸，会造成新的安全性问题。此外，菌液普遍存在贮存期短、对环境不良因素抵抗力差等问题；菌粉也存在润湿性差、喷施不方便等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂及制备方法，所述可湿性菌粉剂不仅能减少农作物和土壤中氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的残留量，而且润湿时间短，贮藏期较长。

本发明所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂的制备方法，所用原料及各原料的质量份为：35份～55份复合菌液、33份～42份硅藻土、4份～10份木质素磺酸钠、2份～7份吐温80、1.5份～3.0份脱脂奶粉和1.5份～3.0份海藻糖，所述复合菌液由地衣芽孢杆菌B-1(Bacillus licheniformis，CCTCC M 2016258)菌液和鞘氨醇单胞菌SC-1(Sphingomonas sp.，CCTCC M 2016270)菌液组成；

工艺步骤如下：

(1)菌剂混合液的制备

将硅藻土加入复合菌液中搅拌均匀，得到载体-菌液混合料；将吐温80、木质素磺酸钠、脱脂乳粉和海藻糖加入与复合菌液等体积的无菌水中并搅拌至它们完全溶解且混合均匀，得到助剂溶液；将助剂溶液和载体-菌液混合料混合均匀，得到菌剂混合液；

(2)菌剂混合液的干燥

将步骤(1)得到的菌剂混合液按照如下工艺参数依次进行干燥：-46℃～-48℃保持1.0h～3.0h，-36℃～-40℃保持1.0h～3.0h，-26℃～-30℃保持1.0h～3.0h，-15℃～-20℃保持1.0h～3.0h，0℃～4℃保持10h～14h，8℃～12℃保持1.0h～3.0h，30℃～40℃保持2.0h～6.0h，15℃～25℃保持20h～24h，得到可湿性菌粉剂。

本发明所述方法将得到的可湿性菌粉剂在无菌条件下分装后于2℃～8℃下冷藏。

上述方法中，复合菌液由地衣芽孢杆菌B-1菌液与鞘氨醇单胞菌SC-1菌液以1:(2～2.5)的体积比配料并混合均匀后形成。地衣芽孢杆菌B-1菌液中菌体的浓度为5.0×10⁷cfu/mL～5.0×10⁸cfu/mL，鞘氨醇单胞菌SC-1菌液中菌体的浓度为5.0×10⁸cfu/mL～5.0×10⁹cfu/mL。

所述地衣芽孢杆菌B-1和鞘氨醇单胞菌SC-1分别是由茶园土壤和农药厂污泥中分离得到。于2016年5月11日和2016年5月18日已分别将地衣芽孢杆菌B-1、鞘氨醇单胞菌SC-1送交中国典型培养物保藏中心(武汉，珞珈山)保藏；地衣芽孢杆菌B-1的分类：Bacillus licheniformis，保藏号：CCTCC M 2016258；鞘氨醇单胞菌SC-1的分类：Sphingomonas sp.，保藏号：CCTCC M 2016270。

本发明所述高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂由上述方法制备得到。

与现有的技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所述可湿性菌粉剂特别适合消除茶叶和果蔬中残留的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸及修复被氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸污染的土壤，试验表明，对小白菜和栽培土壤中的氯氰菊酯残留的降解率分别达到73.47％和91.47％，与未喷施本发明所述可湿性菌粉剂的对照品相比，小白菜和栽培土壤中3-苯氧基苯甲酸残留量分别降低53.50％和54.84％(见实施例4)。

2、本发明所述可湿性菌粉剂中的硅藻土能够吸附和保护微生物免受环境不良因素的影响；木质素磺酸钠能够提高菌粉剂在水中的分散率，有利于喷施；吐温80能够缩短菌粉剂的润湿时间，有利于菌粉剂与水的快速混合；脱脂奶粉和海藻糖能够在冻干工艺中保护微生物菌株免受低温的影响，有利于保持菌株的降解活性。

3、本发明所述可湿性菌粉剂不仅润湿时间短(10.84s)、分散性能好(分散率高达83.99％)和活菌数高(菌株B-1活菌数为4.50×10¹¹，菌株SC-1活菌数为4.80×10¹²)，而且使用方便，贮藏期长(≥180d)。

4、本发明所述方法工艺简单，原料易于获取，便于工业化生产。

附图说明

图1是实施例4中喷施可湿性菌粉剂液、复合菌液后土壤和小白菜中氯氰菊酯的降解率与时间的关系曲线；

图2是实施例4中喷施可湿性菌粉剂液、复合菌液后土壤和小白菜中3-苯氧基苯甲酸含量与时间的关系曲线。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明所述可高效降解氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸的可湿性菌粉剂的制备方法及所制备的可湿性菌粉剂作进一步。

下述实施例中，地衣芽孢杆菌B-1菌液和鞘氨醇单胞菌SC-1菌液是将地衣芽孢杆菌B-1菌、鞘氨醇单胞菌SC-1菌分别接种于氯氰菊酯浓度为100mg/L的LB培养基和3-苯氧基苯甲酸浓度为100mg/L的MS培养基中，培养至对数生长期后于8000rpm下离心10min，收集菌体后用生理盐水复溶，调节菌体浓度后得到。所述LB培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，加蒸馏水至1L，调节pH为7.0～7.5，121℃杀菌20min；MS培养基：硫酸铵1.5g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠0.5g，硫酸镁0.2g，加蒸馏水至1L，调节pH为7.0～7.5，121℃杀菌20min。

下述实施例中，无菌水是将蒸馏水于121℃杀菌20min，冷却至室温后制得。

实施例1

本实施例中，所用原料及各原料的质量份为：55kg复合菌液、33kg硅藻土、4kg木质素磺酸钠、2kg吐温80、1.5kg脱脂奶粉和1.5kg海藻糖；

所述复合菌液由菌体浓度为5.0×10⁷cfu/mL的地衣芽孢杆菌B-1菌液与菌体浓度为5.0×10⁸cfu/mL的鞘氨醇单胞菌SC-1菌液以1:2.5的体积比配料并混合均匀后形成；

工艺步骤如下：

(1)菌剂混合液的制备

将硅藻土加入复合菌液中搅拌均匀，得到载体-菌液混合料；将吐温80、木质素磺酸钠、脱脂乳粉和海藻糖加入与混合菌液等体积的无菌水中并搅拌至它们完全溶解且混合均匀，得到助剂溶液；将助剂溶液和载体-菌液混合料混合均匀，得到菌剂混合液；

(2)菌剂混合液的干燥

将步骤(1)中得到的菌剂混合液按照如下工艺参数依次进行干燥：-46℃保持3.0h，-36℃保持3.0h，-26℃保持3.0h，-15℃保持3.0h，0℃保持14h，8℃保持3.0h，30℃保持6h， 15℃保持24h，得到可湿性菌粉剂；

(3)分装

将步骤(2)中得到的可湿性菌粉剂在无菌条件下分装后于2℃下冷藏。

将本实施例制备的可湿性菌粉剂参照GB/T 19567.3-2004(苏云金芽胞杆菌可湿性菌剂)、GB 20287-2006(农药微生物菌剂)、GB/T 19136-2003(农药热贮藏稳定性测定方法)进行质量指标和贮藏稳定性检测，检测结果见表1和表2。

表1可湿性菌粉剂的质量指标

表2可湿性粉剂的贮藏稳定性

检测结果表明，本实施例所制备的可湿性菌粉剂各项质量指标和贮藏稳定性均符合或优于相关的国家标准，其品质符合可湿性菌粉剂商业生产和应用的要求。

实施例2

本实施例中，所用原料及各原料的质量份为：47kg复合菌液、38kg硅藻土、7kg木质素磺酸钠、4kg吐温80、2.0kg脱脂奶粉和2.0kg海藻糖；

所述复合菌液由菌体浓度为5.0×10⁸cfu/mL的地衣芽孢杆菌B-1菌液与菌体浓度为5.0×10⁹cfu/mL的鞘氨醇单胞菌SC-1菌液以1:2.3的体积比配料并混合均匀后形成；

工艺步骤如下：

(1)菌剂混合液的制备

将硅藻土加入复合菌液中搅拌均匀，得到载体-菌液混合料；将吐温80、木质素磺酸钠、脱脂乳粉和海藻糖加入与混合菌液等体积的无菌水中并搅拌至它们完全溶解且混合均匀，得到助剂溶液；将助剂溶液和载体-菌液混合料混合均匀，得到菌剂混合液；

(2)菌剂混合液的干燥

将步骤(1)中得到的菌剂混合液按照如下工艺参数依次进行干燥：-47℃保持2.0h，-38℃保持2.0h，-28℃保持2.0h，-18℃保持2.0h，2℃保持12h，10℃保持2.0h，35℃保持4h，20℃保持22h，得到可湿性菌粉剂；

(3)分装

将步骤(2)中得到的可湿性菌粉剂在无菌条件下分装后于5℃下冷藏。

参照实施例1中的方法，对本实施例所制备的可湿性菌粉剂依据上述标准进行质量指标和贮藏稳定性检测，结果与实施例1一致。

实施例3

本实施例中，所用原料及各原料的质量份为：35kg复合菌液、42kg硅藻土、10kg木质素磺酸钠、7kg吐温80、3.0kg脱脂奶粉和3.0kg海藻糖；

所述复合菌液由菌体浓度为5.0×10⁷cfu/mL的地衣芽孢杆菌B-1菌液与菌体浓度为5.0×10⁹cfu/mL的鞘氨醇单胞菌SC-1菌液以1:2的体积比配料并混合均匀后形成；

工艺步骤如下：

(1)菌剂混合液的制备

将硅藻土加入复合菌液中搅拌均匀，得到载体-菌液混合料；将吐温80、木质素磺酸钠、脱脂乳粉和海藻糖加入与混合菌液等体积的无菌水中并搅拌至它们完全溶解且混合均匀，得到助剂溶液；将助剂溶液和载体-菌液混合料混合均匀，得到菌剂混合液；

(2)菌剂混合液的干燥

将步骤(1)中得到的菌剂混合液按照如下工艺参数依次进行干燥：-48℃保持1.0h，-40℃保持1.0h，-30℃保持1.0h，-20℃保持1.0h，4℃保持10h，12℃保持1.0h，40℃保持2.0h，25℃保持20h，得到可湿性菌粉剂；

(3)分装

将步骤(2)中得到的可湿性菌粉剂在无菌条件下分装后于8℃下冷藏。

参照实施例1中的方法，对本实施例所制备的可湿性菌粉剂依据上述标准进行质量指标和贮藏稳定性检测，结果与实施例1一致。

实施例4

本实施例将实施例2制备的可湿性菌粉剂进行氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸降解试验。

从菜园中采集未受氯氰菊酯污染的表层(0～20cm)土壤，过20目筛，过夜风干。将风干的土壤分别装于标有A和B的两个菜盆(45×32×23cm)中，栽植3叶期的小白菜秧苗。参照中国国家标准农药合理使用准则GB/T 8321.1-2000，向A菜盆和B菜盆中的土壤和小白菜按0.045mL/m²的喷施量喷施浓度10％(w/v)的氯氰菊酯乳油(中国天津美邦化工科技有限公司)。喷施氯氰菊酯乳油24h后取样，测定A菜盆和B菜盆的土壤和小白菜中的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸含量。取样后将1g实施例2制备的可湿性菌粉剂复溶于1kg无菌水中，均匀喷施于A菜盆中的土壤和小白菜表面，将1kg实施例2所述复合菌液均匀喷施于B盆中的土壤和小白菜表面(做为对照)。继后每天向A菜盆和B菜盆中补充适量的水，以保证小白菜的正常生长。分别于喷施可湿性菌粉剂溶液和复合菌液后的1d、2d、3d、4d、5d取样，测定A菜盆和B菜盆的土壤和小白菜中的氯氰菊酯和3-苯氧基苯甲酸含量。测定结果见图1和图2所示。

从图1可以看出，本发明所述可湿性菌粉剂喷施5d后，对小白菜中氯氰菊酯残留的降解率达到73.47％，栽培土壤中氯氰菊酯残留的降解率达到91.47％，与复合菌液相比，对小白菜和栽培土壤中氯氰菊酯残留的降解率大幅度提高。

从图2可以看出，喷施可湿性菌粉剂溶液和复合菌液5d后，与喷施复合菌液的对照品相比，喷施本发明所述可湿性菌粉剂液的小白菜和栽培土壤中3-苯氧基苯甲酸的残留量分别降低53.50％和54.84％，表明本发明所述可湿性菌粉剂对3-苯氧基苯甲酸的降解效果优于复合菌液。

注：氯氰菊酯的降解率(％)＝(1-样品中氯氰菊酯的残留量/样品中氯氰菊酯的初始含量)×100 。