基于花器官发育的铁皮石斛制种法及相应的获得方法

摘要

本发明公开了一种基于花器官发育的铁皮石斛制种法：取开花第8～14d的花药授粉到开花第8～21d的柱头上。本发明还提供了一种获得上述铁皮石斛制种法的方法，包括如下步骤：1)、待铁皮石斛枝条初现花苞时，挂牌；2)、摘取同一总状花序内整个花期不同开花天数的小花；3)、采用TTC染色法测定整个花期不同开花天数的小花花药的活力；4)、采用联苯胺‑过氧化氢法测定整个花期不同开花天数的小花柱头的可授性；5)、在同一总状花序内，选择花药活力强的花药授粉到可授性强的柱头。依照上述方法，150天左右，可获得遗传背景一致、高坐果率的蒴果。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于花器官发育的铁皮石斛制种方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是我国传统名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热等独特的功效。早在秦汉时期，《神农本草经》就记载铁皮石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳羸瘦、强阴、久服厚肠胃”；1000多年前的《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首；李时珍在《本草纲目》中评价铁皮石斛“强阴益精，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年”；民间称其为救命仙草，国际药用植物界称为“药界大熊猫”。现代药理研究证明，铁皮石斛具有增强免疫力、抑制癌症等作用。为此，2010版《中华人民共和国药典》特将铁皮石斛单独收载。20世纪90年代以前，铁皮石斛主要依靠野生资源，由于自然条件下种子萌发困难、生长发育缓慢，加上人们长期以来对之进行毁灭性采挖与生存环境的破坏，使其野生资源处于濒临灭绝，国际社会将其列入《濒危野生植物国际贸易公约CITES》，我国也将铁皮石斛列为国家二级保护濒危植物。

近年来，随着种植、加工技术的突破，铁皮石斛种植面积出现了“井喷式”的增长，2015年，全国药用石斛种植面积高达50000余亩，而且种植面积持续增加，每亩需种苗8万株左右，种苗的需求量大，目前铁皮石斛的种苗繁育绝大多数采用人工授粉、依赖于组织培养的实生种苗繁育生产工艺。但当前我国对铁皮石斛等兰科植物的育种研究理论基础薄弱，制种不规范(遗传背景不同的材料间进行授粉制种)造成了品种混杂、种性不稳，品质不一，这些原植物品种上的药用成分差异最终导致药材药效不稳，严重阻碍了铁皮石斛的进一步开发利用，成为产业发展的瓶颈。而铁皮石斛总状花序的特质，即每朵小花都有一个花柄与花轴有规律地相连，在整个花轴上有不同发育程度的花朵，有效保障了遗传背景一致的亲本材料。为此开展基于铁皮石斛花器官发育的制种模式，可以得到大量遗传背景一致的蒴果，有效解决种源的遗传稳定性问题，将有助于提供遗传背景一致、药用成分相同、药效稳定的优质种苗。

当前我国对铁皮石斛的育种研究理论基础薄弱，制种不规范。许多企业直接在不同品种、株系和来源等遗传背景不同的铁皮石斛间进行授粉制种，造成了品种混杂、种性不连心稳，品质不一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于花器官发育的铁皮石斛制种方法，采用该方法能获得大量遗传背景一致的蒴果，有效解决种源的遗传稳定性问题，将有助于提供遗传背景一致、药用成分相同、药效稳定的优质种苗。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于花器官发育的铁皮石斛制种法：取开花第8～14d的花药授粉到开花第8～21d的柱头上。

本发明还同时提供了获得上述铁皮石斛制种法的方法，包括如下步骤：

1)、待铁皮石斛枝条初现花苞时，挂牌(即，作标记)；

2)、摘取同一总状花序内整个花期不同开花天数的小花；

3)、采用TTC(2,3,5－氯化三苯基四氮唑，2,3,5,Triphenyl-2H-Tetrazolium Chloride)染色法测定整个花期不同开花天数的小花花药的活力；

4)、采用联苯胺-过氧化氢法测定整个花期不同开花天数的小花柱头的可授性；

5)、在同一总状花序内，选择花药活力强的花药授粉到可授性强的柱头。

依照上述方法，150天左右，可获得遗传背景一致、高坐果率的蒴果。

备注说明：在本发明中，根据染色结果，建立花药和柱头的发育时间表，取花药活力强的花药授粉到可授性强的柱头上。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的改进：

在步骤1)之后，

选取一个枝条上的总状花序进行如下操作：记载该总状花序内，每一朵小花从花苞形成开始到花朵凋谢结束时的整个花期；

同时，选取另一个枝条上的总状花序进行上述步骤2)～步骤5)。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：

所述步骤3)中的TTC染色法测定为：取出铁皮石斛小花药帽里的花药，置于离心管内，加TTC染液没过花药，37℃避光孵育15～30min后，弃染液，用无菌水漂洗花药，吸水纸吸干表面水分；将染色后的花药置于体视变焦显微镜下观察拍照；花药染成红色越深表明活力越强。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：

所述TTC染液的制备方法为：将0.5g的TTC用0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液(PBS)溶解并定容至100ml，从而配制成浓度为0.5％的TTC染色液。

备注说明：TTC染液需避光保存，若发红则不能再用。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：

所述步骤4)的联苯胺-过氧化氢法测定为：将小花朵连花柄采下，去掉所有花瓣(去除花药)；用解剖刀沿隔膜切开合蕊柱，去掉雄蕊露出柱头窝；将柱头窝置于载玻片上，滴加2～3滴联苯胺-过氧化氢反应液于柱头窝上；将载玻片迅速置于体视变焦显微镜下观察拍照；柱头四周的反应液呈现蓝色越深、气泡量越多表明柱头的可授性越强。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：

联苯胺-过氧化氢反应液的制备方法为：将质量浓度为1％联苯胺溶液、体积浓度为3％过氧化氢溶液、蒸馏水按照4:11:22的体积比配制而得。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：所述步骤5)中，每个总状花序授粉3～5朵花。即，每一个枝条做3-5朵花的授粉。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：所述步骤1)的挂牌为：在初现花苞的枝条基部挂上标签。

作为本发明的获得铁皮石斛制种法的方法的进一步改进：将挂牌的枝条，每天拍照跟踪或者图示文字记录整个总状花序内每一朵小花从花苞形成开始到花朵凋谢结束时的整个花期。

本发明的基于花器官发育的铁皮石斛制种方法，是依据铁皮石斛总状花序的特质，即每朵小花都有一个花柄与花轴有规律地相连，在整个花轴上有不同发育程度的花朵，这为铁皮石斛同一小花内花药和柱头发育不同步提供了有效的物质基础，有效保障了遗传背景一致的亲本材料。为此开展基于铁皮石斛花器官发育的制种模式，可以得到大量遗传背景一致的蒴果，有效解决种源的遗传稳定性问题，将有助于提供遗传背景一致、药用成分相同、药效稳定的优质种苗。

本发明的技术优势在于：

1、本发明利用TTC染色花药活力和联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性，建立了总状花序内每一朵小花从花苞展开到花朵凋谢的整个花期的花药和柱头的发育时间表，这样我们可以根据柱头和花药的发育成熟度，挑选活力强的花药和可授性好的柱头进行授粉组合的配比，大大提高了授粉后蒴果的座果率，有效解决了实际生产中授粉量大而座果率低的生产瓶颈。

2、本发明提出了在同一个总状花序内进行授粉制种，这样可以有效保障亲本材料的遗传背景一致，得到大量的蒴果遗传背景一致，有效解决种源的遗传稳定性问题，将有助于提供遗传背景一致、药用成分相同、药效稳定的优质种苗。

本发明使用的TTC染色法测定铁皮石斛花药的活力，有如下优点：1)TTC染色直接取 材于新鲜组织，方便易行；2)染色的全过程约15～30min，节省时间；3)染色过程中不需要特殊的实验器材，所需仪器设备简单；4)在3天时间内，10mL的TTC染液可重复使用2-3次，大约能染18张切片。

本发明采用TTC染色法和联苯胺-过氧化氢法测定遗传背景一致的铁皮石斛的花药活力和柱头可授性，揭示花药和柱头的不同步发育现象。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为TTC染色法测定花药活力，即，TTC染色后的不同花期的花药示意图；1d～30d分别代表开花1-30天的花药。

图2为联苯胺-过氧化氢染色法测定柱头可授性；即，联苯胺-过氧化氢染色后的不同花期的柱头示意图；1d～30d分别代表开花1-30天的柱头。

图3为各授粉组合的座果率；

据花药活力和柱头可授性把花药分为3组：开花1-7d(A)，开花8-14d(B)，开花14d以后(C)；柱头也分为3组：开花1-7d(a)，开花8-21d(b)，开花21d以后(c)。

Aa代表：开花1-7d(A)的花药与开花1-7d(a)的柱头进行组合授粉；

Ab代表：开花1-7d(A)的花药与开花8-21d(b)的柱头进行组合授粉；

Ac代表：开花1-7d(A)的花药与开花21d以后(c)的柱头进行组合授粉；

Ba代表：开花8-14d(B)的花药与开花1-7d(a)的柱头进行组合授粉；

Bb代表：开花8-14d(B)的花药与开花8-21d(b)的柱头进行组合授粉；

Bc代表：开花8-14d(B)的花药与开花21d以后(c)的柱头进行组合授粉；

Ca代表：开花14d以后(C)的花药与开花1-7d(a)的柱头进行组合授粉；

Cb代表：开花14d以后(C)的花药与开花8-21d(b)的柱头进行组合授粉；

Cc代表：开花14d以后(C)的花药与开花21d以后(c)的柱头进行组合授粉；

注：P≤0.05。

具体实施方式

实施例1、一种获得基于花器官发育的铁皮石斛制种法的方法，依次进行以下步骤：

1)、在初现花苞的枝条的基部挂上标签(即，作标记)；

将挂牌的2个枝条分别进行如下操作，即，其中一个枝条进行下述步骤2)，同时，另一个枝条进行下述步骤3)；

2)、该枝条每天拍照跟踪或者图示文字记录整个总状花序内每一朵小花从花苞形成开始 到花朵凋谢结束时的整个花期的变化，并在标签上注明开花日期；

3)、该枝条摘取同一总状花序内，整个花期不同开花天数的小花；小心取出铁皮石斛小花药帽里的2块花粉块，置于离心管内，加0.3ml TTC染液没过花药，37℃避光水浴锅孵育15min后，弃染液，用无菌水漂洗花药，吸水纸吸干表面水分；将染色后的花药置于体视变焦显微镜下观察拍照；

TTC染液的具体制备方法如下：

称取0.5g的TTC粉末，用0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液(PBS)溶解并定容至100ml，配制成浓度为0.5％的TTC染色液。溶液避光保存，若发红则不能再用。

将上述已取出花药的小花，用解剖刀紧贴隔膜下沿切开合蕊柱，切掉雄蕊露出柱头窝；将柱头窝置于载玻片上，滴加2～3滴(约0.1ml)滴联苯胺-过氧化氢反应液于柱头窝上；迅速将载玻片置于体视变焦显微镜下观察拍照；

联苯胺-过氧化氢反应液的制备方法具体如下：1％联苯胺溶液、3％过氧化氢溶液、蒸馏水按照体积比4:11:22配制。

在同一总状花序内，选择花药活力最强的花药授粉到可授性最强的柱头。花药经TTC染色，花药染成红色越深表明活力越强，而不着色的花药不具活力；联苯胺-过氧化氢染色柱头，柱头四周的反应液呈现蓝色越深、气泡量越多表明柱头的可授性越强；反之越差。根据染色结果，建立花药和柱头的发育时间表，取花药活力最强的花药授粉到可授性最强的柱头上。

备注说明，花药的发育时间表中对应内容为：不同开花天数的花药，经TTC染色后红色深浅度的变化，代表整个花期中花药活力的变化；柱头的发育时间表中对应内容为：不同开花天数的柱头，经联苯胺过氧化氢染色后的蓝色深浅度和气泡量的变化，代表整个花期中柱头的可授性的变化。

所得结果具体如下：根据染色结果，建立花药和柱头的发育时间表。根据花药活力和柱头可授性把花药分为3组：开花1-7d(A)，开花8-14d(B)，开花14d以后(C)；柱头也分为3组：开花1-7d(a)，开花8-21d(b)，开花21d以后(c)。

经观察：上述3组花药中，开花第8～14d的花药红色最深，即，该组花药的活力最强。上述3组柱头中，开花第8～21d的柱头四周的反应液呈现的蓝色最深、气泡量最多，即，该组柱头的可授性越强。

实验1、取开花第10d的花药授粉到开花第15d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合的座果率为96.67％，如图3所述。

依照上述方法，150天左右，可获得遗传背景一致、高坐果率的蒴果。

备注说明：取开花第8～14d任一天的花药授粉到开花第8-21d任一天的的柱头上，重复上述实验1，座果率均为约96～97％。

对比例1、取开花4d的花药授粉到开花4d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Aa)的座果率为1.67％，如图3所述。

对比例2、取开花4d的花药授粉到开花15d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Ab)的座果率为5.42％，如图3所述。

对比例3、取开花4d的花药授粉到开花25d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Ac)的座果率为1.67％，如图3所述。

对比例4、取开花10d的花药授粉到开花4d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Ba)的座果率为2.92％，如图3所述。

对比例5、取开花10d的花药授粉到开花25d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Bc)的座果率为1.25％，如图3所述。

对比例6、取开花20d的花药授粉到开花4d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Ca)的座果率为2.08％，如图3所述。

对比例7、取开花20d的花药授粉到开花15d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Cb)的座果率为2.92％，如图3所述。

对比例8、取开花20d的花药授粉到开花25d的柱头上。授粉16个枝条，每一个枝条做5朵花的授粉，共计授粉80朵，重复3次。结果发现，该授粉组合(Cc)的座果率为2.92％，如图3所述。

由图3可知，开花8-14d的花药和开花8-21d的柱头组合的授粉组合(Bb)，座果率达到96.67％左右，显著高于其他组合，实验表明要获得高座果率，强活力的花药和强可授性的柱头缺一不可。

上述案例的对比结果具体如下表1所示：

表1

方案座果率实施例196.67％对比例11.67％对比例25.42％对比例31.67％对比例42.92％对比例51.25％对比例62.08％对比例72.92％对比例82.92％

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。