基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品预处理方法

摘要

本发明公开了一种基于GC‑MS的植物非靶向代谢组学样品预处理方法，其包括步骤：1)将植物样本、内标物和预冷至‑20～4℃的亲水性有机溶剂混匀并降温至‑80～‑10℃，然后研磨粉碎，并冰水浴超声提取；2)再分别加入亲脂性有机溶剂和水，混匀，并冰水浴超声提取；于0～16℃高速离心，取水相并挥干；3)加入肟化试剂，于30～45℃进行肟化反应；4)最后加入衍生化试剂和正己烷，于60～80℃进行衍生化反应。本发明的预处理方法不仅可充分提取植物样本的初级代谢物，获得丰富的代谢物质谱数据信息，而且可尽量避免提取过程中代谢物的变化，以及脂溶性物质对气相色谱柱的污染，从而获得较好的样品重现性。

说明书

技术领域

本发明属于植物样本预处理方法领域，具体涉及一种基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品预处理方法。

背景技术

目前，植物代谢组学已由一个充满假想的概念演变成发展迅速、研究价值巨大的学术领域。与细菌和酵母仅包含数百种代谢物不同，已知的植物次生代谢物已达约10万种。但是，植物代谢组学研究目前仍处于起步阶段，在物种鉴定、转基因植物鉴别、代谢途径和基因功能研究等领域有广阔的应用前景。

通过对代谢组研究，不仅可了解植物在不同环境条件下的变化，还可研究同一植物不同部位或时期的代谢物成分及含量。代谢谱可作为物种鉴定尤其是转基因个体鉴别的重要依据，是基因型与表型研究的重要手段。

植物代谢组学的实验目的是同时对植物样本内尽可能多的代谢物进行定性、定量分析，但是由于植物样本中代谢物种类很多，含量差别很大，代谢物浓度的动态范围较宽，复杂程度较高，而且代谢物受热容易反应导致结构发生变化。另外，植物组织中含有很多脂溶性的次级代谢物，这些物质种类繁多，沸点高，而且难以通过衍生化的方法降低沸点，不适合使用GC-MS(气相色谱-质谱联用)检测。这些物质GC-MS数据库(Fiehn数据库、NIST数据库等)中的质谱信息少，难以定性，不是普筛的主要目的，容易对初级代谢物的分析产生干扰。另外，次级代谢物的通路分析复杂，在KEGG数据库中的次级代谢通路很少，缺少次级代谢通路的比对依据，故在前处理中尽可能多的提取植物样本中的初级代谢物，并排除脂溶性次级代谢物的干扰。但是现有的基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品预处理方法重现性不好，通用性不强，提取过程中没有尽可能的做到低温提取，没有严格控制操作过程中的温度，操作过程中的高温易导致代谢物的结构发生变化，而且代谢物的提取不够充分，很难实现高通量全范围检测，对于性质或含量相差大的物质难以同时检测到，另外提取选择性不高，脂溶性的次级代谢物未能剔除，不能避免干扰。

发明内容

因此，本发明针对现有的基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品预处理方法存在的诸多问题，提出了一种通用性强、提取充分、提取选择性高的重现性好的基于GC-MS植物非靶向代谢组学样品预处理方法。

本发明的基于GC-MS植物非靶向代谢组学样品预处理方法，其包括步骤：

1)将植物样本、内标物和预冷至-20～4℃的亲水性有机溶剂混匀并降温至-80～-10℃，然后研磨粉碎，并冰水浴超声提取；

2)再分别加入亲脂性有机溶剂和水，混匀，并冰水浴超声提取；于0～16℃高速离心，取水相并挥干；

3)加入肟化试剂，于30～45℃进行肟化反应；

4)最后加入衍生化试剂和正己烷，于60～80℃进行衍生化反应，得到基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品。

所述亲水性有机溶剂、所述亲脂性有机溶剂和水为提取液，所述亲水性有机溶剂和水用于提取植物样本中的极性物质(需要提取的初级代谢物)，所述亲脂性有机溶剂用于将非极性或弱极性物质(次级代谢物)分离出去。所述亲水性有机溶剂可选用与水混溶的甲醇、丙酮和/或乙醇。所述亲水性有机溶剂体积:所述植物样本重量为0.5～1mL:100mg优选0.6～0.75mL:100mg。所述亲脂性有机溶剂可选用氯仿、乙醚和/或乙酸乙酯。所述亲水性有机溶剂:所述亲脂性有机溶剂:水的体积比为1:0.4～0.6:0.8～1.2，优选1:0.5:1。

所述内标物应满足以下条件：不是植物样本中的成分且不与植物样本中的代谢物反应，能溶解于所述亲水性有机溶剂，带有活泼氢能被衍生化。所述内标物可选用氯苯丙氨酸，氯苯丙氨酸为L-2-氯-苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、L-4-氯苯丙氨酸、D-4-氯苯丙氨酸或D-2-氯苯丙氨酸，当然不排除其他类型的可被衍生化的化合物。所述内标物重量:所述植物样本重量为10～30μg:100mg优选20μg:100mg。因所述内标物用量很少，很难直接称取，因此在某些实施例中，所述内标物预先用所述亲水性有机溶剂稀释为溶度为0.2～0.4mg/mL的内标物溶液，然后再准确量取并与所述植物样本、所述亲水性有机溶剂混合，量取混合用的所述亲水性有机溶剂时扣除所述内标物溶液体积，以此维持所述亲水性有机溶剂总的体积。

所述肟化试剂为甲氧胺盐酸盐，所述甲氧胺盐酸盐重量:所述植物样本 重量为15～30:100优选20:100。实际处理过程中可通过添加10～20mg/mL优选15mg/mL的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液来加入所述肟化试剂。

所述衍生化试剂为N,O-二(三甲基硅烷)乙酰胺、二甲基二氧硅烷、二甲基二氧硅烷、六甲基二硅胺、N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺、含1％三甲基氯硅烷的双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺或含1％三甲基氯硅烷的N-甲基双(三氟乙酰胺)。所述衍生化试剂体积:所述植物样本重量为1～2uL:1mg，优选1.3uL:1mg。

步骤4)中的正己烷的功能是增加烷基化物质的溶剂性，正己烷的用量与衍生化试剂的用量有关，所述衍生化试剂体积:正己烷体积为2～8:1优选4:1。

本发明的一较佳实施例中，步骤1)具体操作为，将所述内标物溶液、所述植物样本和预冷至-20～4℃优选-10～0℃的亲水性有机溶剂混合并降温至-80～-10℃优选-60～-40℃，放入研磨机中以40～80Hz优选60Hz频率研磨粉碎1～4min优选2min，并用冰水浴超声提取20～40min优选30min。

进一步的，步骤2)具体操作为，加入所述亲脂性有机溶剂后于研磨机中以15～30Hz优选20Hz频率涡旋1～4min优选2min进行混匀，再加入水于研磨机中以15～30Hz优选20Hz频率涡旋1～4min优选2min进行混匀，然后用冰水浴超声提取20～40min优选30min；然后于0～4℃条件下，12000～15000rpm优选14000rpm转速下离心5～15min优选10min。

再进一步的，步骤3)具体操作为，在湿度控制在25～35％优选30％下，加入10～20mg/mL优选15mg/mL的甲氧胺盐酸盐的吡啶溶液，然后于震荡速度为100～300rpm优选200rpm的35～40℃优选37℃震荡培养箱中进行肟化反应60～120min优选90min。

步骤4)具体操作为，在湿度控制在25～35％优选30％下，加入所述衍生化试剂和正己烷并涡旋震荡混匀，然后于68～72℃优选70℃衍生化反应45～75min优选60min，冷却至室温，得到基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品。

方法步骤可用于大多数植物叶片、茎部和或根部等的新鲜组织的预处理。对于除含糖量极高如香蕉果肉、甘蔗等以外的含糖量≤15％植物新鲜组织，尤其是含糖量≤5％植物新鲜组织，可充分提取植物组织中的初级代谢物，GC-MS分析可达到较高的重现性。

本发明的关键点包括以下三点：

1、提取液的选择及其用量配比的选择。为减少对后续分析的干扰，需 要将数据库中基本上没有的脂溶性的次级代谢物去除，比如黄酮类等亲脂性物质。所述亲水性有机溶剂和水可混溶，而所述亲脂性有机溶剂与一定比例混溶的所述亲水性有机溶剂-水的混合相不互溶，所述亲水性有机溶剂-水和所述亲脂性有机溶剂混合后可分为亲水的水相和亲脂的有机相两层，水相为溶解有极性物质(需要提取的代谢物)的所述亲水性有机溶剂-水，有机相为溶解有亲脂性物质的所述亲脂性有机溶剂。提取液以甲醇、水、氯仿组合为例，体积比为1:1的甲醇-水极性较大，能够更多地提取极性物质，而氯仿能够溶解非极性或弱极性的亲脂性物质；甲醇、水、氯仿的体积比为2:2:1时，甲醇-水与氯仿不互溶，溶液分层，上层水相为溶解有极性物质的甲醇-水，下层有机相为溶解有非极性或弱极性物质的氯仿，取上层清液即可用于后续处理再进行GC-MS代谢组学分析。具体操作时先加甲醇，能提取到绝大部分的代谢物，再加不能或不容易提出亲水性物质而易提取亲脂性的物质的氯仿，最后加水使水相和有机相分层，可达到较佳的提取分离的效果。

2、操作过程中保证低温。研磨机研磨过程中会产生大量热量，故研磨前可将植物样本放置低温(-20～-80℃)环境中2min左右。水浴超声过程中，温度会升高，可将超声清洗仪温度设至最低(0℃)，并且加入冰袋，保证整个超声过程温度在冰水浴的温度。高速离心可保证植物的组织残渣沉淀完全，同时高速离心也会产生大量热量，离心温度可设为0～4℃。上述各控制温度的操作可有效避免植物样本温度过高而导致代谢物的结构发生变化。

3、衍生化过程中的湿度要求严格。衍生化试剂遇水立即分解，故加入肟化试剂、衍生化试剂、正己烷的过程中，实验室湿度控制在30％左右，且不能超过35％，否则将导致衍生化不充分，最终导致检测到的代谢物数量较少。

另外，采用加有小钢珠的离心管作为植物样本处理容器，放到研磨机里研磨，可使植物组织破坏充分，再经超声提取，能够充分提取代谢物。

本发明的积极进步效果在于：所述基于GC-MS的植物非靶向代谢组学样品预处理方法是在低温条件下对植物样本的代谢物进行充分提取，可降低高温对代谢物的结构影响；并且有效去除的脂溶性的次级代谢物，可避免脂溶性的次级代谢物对气相色谱柱的污染而干扰后续分析；另外严格控制衍生化过程实验室湿度以保证充分衍生化。采用本发明的预处理方法处理的样品进行GC-MS植物代谢组学分析可获得较大的代谢物峰数据，而且样品重现性较好，可普遍适用于各种植物组织样品的提取，提高代谢组学中大样品量的研究效率。另外本发明的预处理方法操作简单快捷，所用试剂毒性较小。 上述积极进步效果对促进植物代谢组学研究、建立统一的提取方法标准、加强相关研究者之间进行数据交流具有重要意义。

附图说明

图1A～1F为实例1的茶树叶片的总粒子流色谱图。

图2A～2F为实例2的西瓜茎的总粒子流色谱图。

图3A～3F为实例3的花椒根的总粒子流色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的基于GC-MS植物非靶向代谢组学样品预处理方法作进一步的说明。

实施例1 茶树叶片的预处理(含糖量1～5％)

采用以下步骤对新鲜茶树叶片进行预处理并作GC-MS检测，重复6次(1A～1F)平行实验。

预处理具体步骤为：

1)精确称取茶树叶片60mg，放入1.5mL的离心管中；依次加入两颗小钢珠、360μL 4℃的甲醇和40μL内标物甲醇溶液(L-2-氯-苯丙氨酸，0.3mg/mL)，在-80℃冰箱中放置2min；放入研磨机中研磨(60Hz，2min)，从研磨机中取出，超声提取30min；

2)加入200μL氯仿，放入研磨机中涡旋(20Hz，2min)，加入400μL水，放入研磨机中涡旋(20Hz，2min)，超声提取30min；

3)低温离心10min(14000rpm，4℃)，取200～700μL上清液，装入玻璃衍生瓶中，用快速离心浓缩仪挥干；

4)在湿度控制在30％下，向玻璃衍生瓶中加入80μL甲氧胺盐酸吡啶溶液(15mg/mL)，涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37℃肟化反应90min；

5)在湿度控制在30％下，取出后再加入80μL双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(含1％三甲基氯硅烷)和20μL正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃衍生化反应60min后取出，室温放置30min，进行GC-MS代谢组学分析。

检测结果分析：

本实施例的预处理步骤中，提取液甲醇、水、氯仿体积比为2：2：1，通过甲醇和水有效地提取极性的初级代谢物，并通过氯仿将脂溶性的次级代谢物去除，从而避免对气相色谱柱的污染和对后续分析的干扰。操作过程中保证低温，有效避免高温导致代谢物的结构发生变化。而且衍生化过程中的 湿度严格控制在30％左右，保证充分衍生化。

6次平行预处理后测得的茶树叶片代谢物的总粒子流色谱图(TotalParticles Chromatogram,TIC)如图1A～1F所示；茶树叶片代谢物种类数量的检测结果如表1所示。检测结果显示内标峰以及已知的假阳性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化试剂峰)均从数据矩阵中去除，并进行去冗余和峰合并后，6次平行实验均能定性出270种左右的代谢物，其中有206种代谢物在6次平行实验中均有检测到，具有较高重现性。

表1茶树叶片的代谢物种类数量检测结果

所以使得检测结果中代谢物数量较多且稳定，样品重现性好。

实施例二 西瓜茎的预处理(含糖量2％左右)

采用以下步骤对新鲜西瓜茎进行预处理并作GC-MS检测，重复6次(2A～2F)平行实验。

预处理具体步骤为：

1)精确称取西瓜茎60mg，放入1.5mL的离心管中；依次加入两颗小钢珠、360μL-20℃的乙醇和40μL内标物乙醇溶液(L-4-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL)，在-20℃冰箱中放置2min；放入研磨机中研磨(60Hz，2min)，从研磨机中取出，超声提取30min；

2)加入200μL乙醚，放入研磨机中涡旋(20Hz，2min)，加入400μL水，放入研磨机中涡旋(20Hz，2min)，超声提取30min；

3)低温离心10min(14000rpm，16℃)，取200～700μL下层清液，装入玻璃衍生瓶中，用快速离心浓缩仪挥干；

4)在湿度控制在30％下，向玻璃衍生瓶中加入80μL甲氧胺盐酸吡啶溶液(15mg/mL)，涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37℃肟化反应90min；

5)在湿度控制在30％下，取出后再加入80μL N-甲基双(三氟乙酰胺)(含1％三甲基氯硅烷)和20μL正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃衍生化反应60min后取出，室温放置30min，进行GC-MS代谢组学分析。

检测结果分析：

本实施例的预处理步骤中，提取液乙醇、水、乙醚体积比为2：2：1，通过乙醇和水充分地提取极性的初级代谢物，并通过乙醚将脂溶性的次级代谢物去除，从而避免对气相色谱柱的污染和对后续分析的干扰。操作过程中保证低温，有效避免高温导致代谢物的结构发生变化。而且衍生化过程中的 湿度严格控制在30％左右，保证充分衍生化。

6次平行预处理后测得的西瓜茎代谢物的总粒子流色谱图(TotalParticles Chromatogram,TIC)如图2A～2F所示；西瓜茎代谢物种类数量的检测结果如表1所示。检测结果显示内标峰以及已知的假阳性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化试剂峰)均从数据矩阵中去除，并进行去冗余和峰合并后，6次平行实验均能定性出200种左右的代谢物，其中有160种代谢物在6次平行实验中均有检测到，具有较高重现性。

表2西瓜茎代谢物种类数量检测结果

实施例三 花椒根的预处理(含糖量1％左右)

采用以下步骤对新鲜花椒根进行预处理并作GC-MS检测，重复6次平行实验(3A～3F)。

预处理具体步骤为：

1)精确称取花椒根60mg，放入1.5mL的离心管中；依次加入两颗小钢珠、360μL-10℃的丙酮和40μL内标物丙酮溶液(3,4-二氯苯丙氨酸，0.3mg/mL)，在-10℃冰箱中放置2min；放入研磨机中研磨(60Hz，2min)，从研磨机中取出，超声提取30min；

2)加入200μL乙酸乙酯，放入研磨机中涡旋(20Hz，2min)，加入400μL水，放入研磨机中涡旋(20Hz，2min)，超声提取30min；

3)低温离心10min(14000rpm，10℃)，取200～700μ下层清液，装入玻璃衍生瓶中，用快速离心浓缩仪挥干；

4)在湿度控制在30％下，向玻璃衍生瓶中加入80μL甲氧胺盐酸吡啶溶液(15mg/mL)，涡旋震荡2min后，于震荡培养箱中37℃肟化反应90min；

5)在湿度控制在30％下，取出后再加入80μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺和20μL正己烷，涡旋震荡2min后，于70℃衍生化反应60min后取出，室温放置30min，进行GC-MS代谢组学分析。

检测结果分析：

本实施例的预处理步骤中，提取液丙酮、水、乙酸乙酯体积比为2：2：1，通过丙酮和水充分地提取极性的初级代谢物，并通过乙酸乙酯将脂溶性的次级代谢物去除，从而避免对气相色谱柱的污染和对后续分析的干扰。操作过程中保证低温，有效避免高温导致代谢物的结构发生变化。而且衍生化过程中的湿度严格控制在30％左右，保证充分衍生化。

6次平行预处理后测得的花椒根代谢物的总粒子流色谱图(TotalParticles Chromatogram,TIC)如图3A～3F所示；花椒根代谢物种类数量的检测结果如表1所示。检测结果显示内标峰以及已知的假阳性峰(包括噪音、柱流失和衍生物化试剂峰)均从数据矩阵中去除，并进行去冗余和峰合并后，6次平行实验均能定性出270种左右的代谢物，其中有211种代谢物在6次平行实验中均有检测到，具有较高重现性。

表3花椒根代谢物种类数量检测结果

由上述三个实施例的检测结果可知，本发明的预处理方法可充分提取新鲜植物组织(包括叶片、茎部和根部)中的代谢物，可检测到较多种类的代谢物，代谢物种类和相对含量均具有较高的重现性，可适用于除含糖量极高的果肉(如梨果肉、西瓜果肉、甜瓜果肉等)以外的植物鲜样的GC-MS植物非靶向代谢组学样品的处理。