对不甜或微甜生面团有效的新的制面包酵母菌株

摘要

本发明涉及对不甜和/或微甜产品有效的新的制面包酵母菌株。它还涉及通过繁殖所述菌株获得的酵母及其用于制备焙烤面包产品的用途。与参考菌株相比，尤其在突变参考菌株后选择的本发明的菌株能够根据比参考菌株更慢的方法繁殖，同时显示改进性质，尤其是发酵能力。

说明书

技术领域

本发明涉及对不甜和/或微甜生面团有效的新的酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)制面包酵母菌株。它还涉及通过繁殖所述 菌株获得的酵母及其用于制备焙烤面包产品的用途。

背景技术

不甜和/或微甜的制面包产品的消耗持续增加。生产这些产品使 用干燥、压缩或液体形式的制面包酵母，称为面包师的酵母。

制面包酵母菌株适合各种类型生面团：不甜的、微甜的或很甜的。 因此，申请人提供意欲用于任何类型面包制作和任何焙烤面包产品的 门类齐全的酵母。

然而，酵母生产商一直在寻找新的酵母菌株，以能够生产更有效 的酵母，尤其是在发酵能力和储存方面。

他们还一直在寻找生产酵母的改进方法，例如改善生产节省，这 可以通过更高的生产力、降低生产成本、使生产酵母(无论是何种形 式：干燥、压缩或液体)的工艺易于实施来实现。

菌株的强壮性和规律性及其对干燥的耐性也是酵母生产商寻找 的性能。

在本领域申请人的参考菌株之一是以保藏号I-2970于2003年2 月12日保藏于CNCM(CollectionNationaledeCulturesde Microorganismes[法国国家微生物培养物保藏中心],26rueduDocteur Roux,75724Pariscedex15)的菌株。它作为干酵母、压缩酵母或液体 酵母是具有多种应用的重要菌株。因此，对该菌株的任何改进将影响 一些产品和质量。

对于给定的菌株并考虑到优化的环境条件，尤其是pH、温度、 发酵培养基、氮(N)和磷(P)源，最重要的参数是生长动力学， 其特征是每小时增殖率，更通常平均增殖率的演变。

平均增殖率定义为其中

·d＝发酵持续时间

·Xend是发酵结束时酵母的量

·X0是发酵开始时酵母的量。

已知提高平均增殖率的作用是增加酵母的发酵能力，对生产力损 失不利。

实际上，在生产面包酵母的工业发酵条件下，根据补料-分批发酵 技术并在有氧条件下，生长速度通过糖的进料流速度来控制，因此可 能优化生物质生产量和发酵生产力。

关于平均增殖率，工业工艺的局限在几个水平发生：

在发酵的前三分之一过程中，控制每小时的增殖率，使其保持在 关键增殖率以下，从而避免与乙醇生产有关的对用糖的酵母生物质产 量不利的呼吸发酵代谢。

在发酵剩余的过程中，随着发酵器中酵母生物质的增加，每小时 增殖率逐渐降低，使其不到工业发酵器的氧传递能力和冷却能力的极 限。

总之，每小时增殖率越高，代谢越能够获得富含蛋白质(包括酶) 的酵母，这赋予酵母发酵能力。

如果需要酵母具有非常高的发酵活性，则有必要应用较高的每小 时增殖率，从而较高的O₂消耗率和较高的热量生产率(快过程)。 因此，发酵器的氧传递和冷却能力保持不变，需要降低发酵器中的酵 母的量，从而损失生产力。

因此，本发明想解决的问题之一是提供至少一个与参考菌株 I-2970相比，具有改进的发酵活性，同时用低平均增殖率(慢动力学) 生产，且具有与工业和商业用途相容的生产力的新酵母菌株。

多次菌株筛选试验之后，申请人鉴定并选择了新菌株，其具有优 异的发酵活性同时通过慢生长动力学的发酵来生产，从而能够解决上 述问题。

发明简述

因此，本发明的一个主题是通过生长动力学慢于参考菌株I-2970 的发酵生产的新酵母菌株，其能够获得在不甜或微甜生面团中与参考 菌株至少相等的发酵活性的面包酵母。

特别地，本发明的主题是以保藏号I-4743于2013年4月25日保 藏于CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes[法国国家微生 物培养物保藏中心],26rueduDocteurRoux,75724Pariscedex15的菌 株。

本发明的主题还是通过繁殖I-4743菌株或繁殖任何衍生自I-4743 菌株或I-2970菌株的酵母菌株获得的干燥、压缩或液体形式的面包酵 母，其发酵活性比I-2970菌株更高或相等，同时通过更慢的生长动力 学活性的发酵来生产。

表述“衍生菌株”是指通过任何转化衍生的菌株，例如通过一次 或多次杂交和/或通过突变和/或通过遗传转化。

通过杂交衍生的菌株可以通过将根据本发明的菌株与相同菌株， 或与根据本发明的另一个菌株，或与任何其他菌株杂交来获得。

通过突变衍生的菌株可以是在基因组中经过至少一次自发突变 或至少一次诱发突变，例如通过诱变引发的菌株。衍生菌株的突变可 以是或不是沉默的。

术语“诱变”是指通过辐射如用UV或通过诱变化学剂获得的常 规突变，和通过移位或整合外源DNA片段的插入诱变。

通过辐射的诱变包括施用UV、X射线或γ辐射。

诱变化学剂是例如EMS(甲基磺酸乙酯)、EES(乙基磺酸乙酯)、 亚硝基胍、硝酸、黄曲霉毒素B1、羟胺、5-溴-尿嘧啶、2-氨基嘌呤、 原黄素和吖啶橙。

通过遗传转化衍生的菌株是其中引入外源DNA的菌株。该外源 DNA优选由质粒提供或直接整合入基因组。

本发明的主题还是通过包含发酵根据本发明的面包酵母的步骤 的方法获得的面包生面团，以及获得的焙烤面包产品。

发明详述

本发明的主题是至少一种面包酵母菌株，其在工业繁殖后提供在 不甜或微甜生面团中发酵活性比参考菌株I-2970获得的发酵活性更 高或相等，同时按照比参考菌株更慢的生长动力学的制面包酵母。

通过这种“慢”生产方法获得的酵母可以各种形式提供：干燥的、 压缩的或液体的。它们对生产条件尤其是干燥有耐性，并且在储存上 是稳定的。

术语“微甜生面团(SD)”意欲是指包含少于10％的添加糖的面 包生面团。

术语“在工业发酵的最后步骤应用的快生产过程”意欲是指平均 增殖率高于或等于1.17。

术语“在工业发酵的最后步骤应用的慢生产过程”意欲是指平均 增殖率低于或等于1.15。

对干燥的耐性导致干燥后的发酵活性至少等于干燥前发酵活性 的70％。

当通过培养所述菌株获得的酵母用作不甜或微甜生面团的发酵 剂时，本发明菌株的优势也使它们突显出来。

申请人将I-2970菌株作为与本发明相关的领域的参考菌株。在寻 找上述问题的解决方法时，申请人自然对作为起点的该菌株以及通过 突变它衍生的菌株产生兴趣。

首先，申请人将参考菌株进行突变，尤其是通过UV辐射，然后 在所得的几千个突变体中进行严格和合理的筛选。

因此，申请人筛选了I-4743菌株作为上述问题的最佳解决办法。

除其他事项外，申请人开发的筛选方法基于以下单独的或组合的 标准：

-菌株同化培养基中存在的氮的能力，

–产生的生物质的量，

–所得酵母的发酵能力，

–糖的生长收率损失。

应用于参考菌株I-2970d选择方法包含至少以下选择步骤：

步骤I

I.1)诱变参考菌株I-2970以获得10000个突变克隆，

I.2)筛选10000个克隆：两次筛选在微孔板上进行(通过分析液 体培养基中的乙醇来评估)，两次筛选在玻璃瓶中进行。该步骤中保 留的选择标准是：

·在模拟正常生面团的液体合成培养基中产生的乙醇的量必须高 于或等于参考菌株生产的乙醇的量。

·在培养基中产生的生物质的量必须高于或等于参考菌株I-2970产 生的生物质的量，

·在不甜生面团中的发酵能力必须比参考菌株I-2970的发酵能力高 至少10％。

特意为筛选该菌株开发的培养基是富含氮分子的培养基，其目的 是在第一次筛选中尽早除去所有不具有同化氮的优良能力的突变体。

步骤I.2使能够从40-50个克隆中选择。

步骤II

II.1)在1升发酵器中研究步骤I.2保留的克隆。选择标准是：

·糖的生长收率损失必须不能比参考菌株I-2970的生长收率高 10％，

·在ND中的发酵能力，必须比参考菌株的发酵能力高至少10％。 因此，选择满足上述标准的约10个克隆。

II.2)在7升发酵器中研究步骤II.1保留的克隆。选择标准是：

·糖的生长收率必须与参考菌株I-2970获得的收率至少相等，

·发酵能力必须比参考菌株的发酵能力高至少10％，和

·酵母的氮含量必须比参考菌株的氮含量高至少5％。

因此，选择满足上述标准的约1-2个克隆。

步骤III

III.1)在20升发酵器中研究步骤II.2选择的克隆。这包括亲本酵 母的两代繁殖，就像工厂中进行的一样。用亲本酵母接种“商业”最 终发酵，参考菌株I-2970在相同条件下生产。在商业发酵结束后，将 酵母分离并脱水。该步骤中的评估标准是：

·在常规研究的参数(动力学、营养要求、糖的生长收率)方面， 不存在发酵异常；

·发酵能力必须比参考菌株I-2970的发酵能力高至少10％；

·氮含量必须比参考菌株I-2970的氮含量高至少5％。

然后评估快速干酵母(通常称为SPI)形式的脱水并干燥的酵母。

评估标准是干燥时发酵能力的损失必须少于或等于30％。

还通过测量醒发时间(prooftime)来评估各种制面包配方中的干 酵母。选择标准是醒发时间必须比参考菌株的发酵时间高5％。

以上的选择方法能够选择以保藏号I-4743于2013年4月25日保 藏于CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes[法国国家微生 物培养物保藏中心],26rueduDocteurRoux,75724Pariscedex15的面 包酵母菌株，其构成本发明的第一个主题。

对衍生自I-4743菌株的菌株应用本发明的选择方法也能够选择对 应于本发明的主题的其他菌株，即：提供当以慢过程发酵生产菌株时， 其发酵能力比参考菌株I-2970提高或至少相同的新菌株。

因此，本发明的另一个主题是衍生自I-2970菌株或I-4743菌株的 菌株，其特征在于它满足上述步骤I、II和III的选择标准。

本发明的酵母菌株用于生产制面包酵母，如手册“Yeast Technology”,2ndedition,1991,G.ReedandT.W.Nagodawithana,由Van NostrandReinhold发表,ISBN0-442-31892-8所述。

面包酵母的生产包含以下步骤组的至少前两个步骤：

-繁殖若干阶段的纯的面包酵母菌株，首先在半厌氧条件下，然后 在有氧条件下，

-通过离心从其培养基中分离产生的面包酵母，获得包含约 14％-25％干物质的液体“酵母膏”，在真空下在旋转过滤器上通常通 过撒盐过滤所得的液体酵母膏，获得包含约26％-35％干物质的脱水鲜 酵母，

-混合所述脱水鲜酵母，旨在获得非常均匀的物质，

-以压缩鲜酵母条的形式或以约30％干物质出售的碎鲜酵母的形式 或以薄丝的形式(如果酵母意欲干燥的话)挤出所得酵母，

-如果干燥酵母，优选将干燥控制为在乳化剂(尤其是1.5％的单硬 脂酸山梨醇酐酯(SMS))存在下的快速干燥。干燥在热空气流中进 行，例如将通过挤出获得的酵母颗粒流化，

-将干酵母真空包装。

本发明的酵母可以酵母膏、压缩酵母和干酵母的形式提供。

通常，通过培养本发明的菌株获得的酵母具有：

a.制面包的醒发时间比来自I-2970菌株的面包酵母获得的醒发时 间短，和/或

b.对干燥的耐性比I-2970菌株更高或相等。

此外，它们在微甜生面团中的发酵能力比参考菌株I-2970获得的 发酵能力高2％-6％，优选高3％-5％。

本发明的另一个主题是实施发酵例如本发明的酵母的步骤来制备 不甜或微甜面包生面团的方法，以及获得的生面团和焙烤面包产品。

以下实施例说明本发明而不限制其范围。

具体实施方式

在发酵中评估所研究菌株的以平均增殖率为特征的生长，并评估 所产生酵母的氮含量、其发酵能力和发酵能力/氮含量比。

发酵能力对应于酵母在面粉团片的发酵过程中产生的CO₂体积 (以ml表示)。发酵能力用本领域技术人员已知的常规技术测量， 尤其通过Burrows和Harrison在“JournaloftheInstituteofBrewing”,Vol. 65,1959中所述的发酵计测量。特别地，发酵能力根据申请人名下的 EP0511108和US5741695所述的试验来测量。

在Burrows和Harrison型发酵计中测量由20g面粉和酵母悬浮液 组成的生面团片在2小时期间的发酵能力。

对于测量在富含氮分子的培养基中培养后的发酵能力，酵母悬浮 液由15ml含有27g/lNaCl和4g/lSO₄(NH₄)₂的水中的100mg酵母干物 质组成。

对于测量在补料-分批培养后的发酵能力，酵母悬浮液由15ml含 有27g/lNaCl和4g/lSO₄(NH₄)₂的水中的150mg酵母干物质组成。

为了制备生面团片，将面粉和酵母悬浮液的混合物在捏合机中混 合40秒，以获得生面团，然后将其置于30℃的水浴。混合13分钟后， 将含有生面团的容器密封。在2小时于30℃测量所产生气体的总量。

在各种生面团条件下测量发酵能力：

–不甜生面团，其组成如上所述(ND)，

–甜生面团，每20g面粉含有2g蔗糖，并且

根据以下公式计算测试菌株与参考菌株的发酵能力的差异(以百 分比计算)：

氮含量根据Kjeldahl方法测定。

实施例1

诱变和第一次筛选

特异为本次筛选开发的培养基是富含氮分子的培养基，其目的在 于验证所选择菌株同化大量氮的能力。

选择的标准是：

–在模拟普通生面团的液体合成培养基上的乙醇产量。将各突变 体产生的乙醇量与参考菌株产生的乙醇量相比较，

–在每20g面粉含有100mg酵母干物质的普通不甜生面团中的 CO₂产量，将各突变体产生的CO₂量与参考菌株产生的CO₂量相比较，

–在为筛选开发的培养基上产生的生物质的量，与参考菌株相 比。

该步骤能够选择40-50个具有至少与在相同条件下培养的参考菌 株相等的生物质产量和在普通生面团中比参考菌株高至少10％的发 酵能力的菌株。

在所选择的菌株中，I-4743菌株因为以下性质变得突出：生物质 产量比在相同条件下培养的I-2970参考菌株高40％，在普通生面团 (ND)中的发酵能力比参考菌株增加40％。

实施例2

在1升发酵器中的选择

然后在1升发酵器中的合成培养基上以补料-分批模式研究实施 例1中选自的菌株，以验证它们遵循面包酵母代表性的发酵动力学的 能力。

进行的方案包括在发酵期间的连续糖进料流，在容器根部引入营 养物。

在制备各菌株后，进行生物质平衡以只保留没有营养缺陷的菌 株。还测量发酵结束时酵母的氮含量。然后将所得结果与普通不甜生 面团中的发酵能力相交。

该步骤能够选择几个菌株，其中I-4743菌株因为以下性质变得突 出：

–糖的生产收率的损失比参考菌株的生长收率低10％。

–在ND中的发酵能力比参考菌株高15％。

在7升发酵器中的选择：

在7升发酵器中，根据补料-分批方案在糖浆培养基上生产按照1 升发酵器中的试验选择的平均增殖率为1.141的最佳菌株。

该步骤能够选择具有以下性质的几个菌株：

-生长收率至少与参考菌株获得的生长收率相等，

-氮含量相对于酵母干物质(YDM)高8.5％，

-在普通不甜生面团上的发酵能力相对于酵母的氮含量(ND/D) 比参考菌株高5％。

从这些试验中发现，用I-4743菌株生产的酵母的糖的生长收率基 本上与参考菌株相等，并因为其在ND和2g加甜生面团中的能力明 显比I-2970菌株高(在ND中+10％，在2g-SD中+3％)而变得突出。 并且，该菌株的氮含量比参考菌株高(～9％/YS)。这个观察结果强 化了该菌株具有改进的蛋白合成代谢这一观念。I-4743菌株还在普通 生面团上的发酵能力相对于氮含量ND/D(ND/D21.7与20.6相比， 例如+5％)这方面显示出比参考菌株明显的优势。

实施例3

然后根据以下模式在20升发酵器中测试I-4743菌株：

-两代繁殖亲本酵母。进行亲本酵母接种全部系列的商业酵母发酵， 以通过快方案或慢方案培养来获得具有各种蛋白含量的酵母，

-监测常规研究的发酵能力(生长、营养需求、酵母的最终组成、 糖的生长收率)，

-通过在单独的发酵器上测量ND发酵能力评估商业酵母的质量、 对膏进行撒盐、在旋转过滤器上脱水，

-用由12.5％SMS和6％油组成的乳剂将脱水酵母均质化，以获得最 终干酵母的SMS含量为1.3％。在0.6mm穿孔网格上挤出后，在Glatt 干燥器上用以下条件将酵母进行分批流化空气干燥：阶段1用干燥空 气的温度为55℃，2g水/kg干燥空气，空气流速为30m³/h，阶段2 的空气温度为48℃，空气流速为30m³/h。然后将干酵母真空包装，

-通过测量SC(干物质含量)和在ND和2g-SD发酵计试验中的发 酵能力评估干酵母的质量。通过在发酵计中监测ND发酵能力来评估 干酵母在14天43℃试验中的储存(在43℃储存14天)。

对照是在相同条件下具有相同生面团组成的生面团，除了它是用 相同条件下产生的酵母作为测试菌株来接种，而是用I-2970参考菌 株。

所得结果表明：

-如果应用慢平均增殖率(1.150)的方案，I-4743菌株的氮含量比 参考菌株高。因此，I-4743可以达到9％的氮含量，相比之下，对于 该类型的慢动力学，参考菌株难以达到8.3％的氮含量，导致发酵能力 提高；

-普通生面团中的发酵能力/氮含量(ND/N)的比例能够比较两个 菌株之间的发酵能力。I-4743菌株的比例比I-2970菌株高超过10％ (ND/N22与19.5相比)。

这表明，在量化方面，I-4743菌株的蛋白质合成高于I-2970菌株。

正常进行处理后操作以获得良好质量的干酵母：

-细胞尺寸不比参考菌株小，这既不对分离产量不利，也不对旋转 真空预涂过滤器上的脱水步骤不利，正常脱水酵母具有31-32％SC。

-添加油/SMS乳剂之后的酵母既不发粘也不油腻，因此不会对细丝 挤出步骤不利。

-获得正确的最终含量(％SC为95.5％)的干燥时间没有延长。

-在新鲜状态和储存后的干酵母上没有观察到异常颜色或气味。

-在慢发酵动力学下用I-4743菌株生产的干酵母具有与I-2970菌株 获得的相比，在ND上提高的发酵能力(平均+10％，最大+22％)。

-I-4743菌株的良好干燥能力，因为干燥的能力损失与I-2970菌株 在相同水平，即根据不加糖或加少量糖的试验从-19％至-15％。

储存后测量干酵母的发酵能力

比较两个菌株之间与储存(在43℃下14天)相关的能力损失：在 43℃的温度下储存14天后能力损失15％。

在制面包中评估菌株

根据以下实施条件，在制面包中评估用I-4743菌株和I-2970菌株 生产的干酵母。

所用配方以面包师的百分比表示，即以每100g面粉中组分的重量 (g)表示：

面粉 100％ 水 65％ 盐 2％ 干酵母 1.2％ 制面包改良剂 1％

试验在22℃的烘培坊中用已经调节至22℃的面粉进行。

所用的试验方案如下：

-将干组分置于Hobart捏合机的Mac碗中，并以第一 速度混合1分钟，所述捏合机的夹套预先恒温在21.5℃。

-将20℃的水倒入捏合机。

-然后以速度1混合7分钟，随后以速度2捏合1分钟30秒。

-然后立即从碗中取出生面团，测量它的温度，其必须在25℃ +/-0.5℃。

-将生面团直接分为320g的生面团片，然后卷成不是非常紧密的球， 将该球置于盖子下。

-捏合结束后35分钟，将生面团片机械成型并置于模具(尺寸：模 具基座为185×75mm；模具顶部为200×90mm；模具高度为75mm) 中，所述模具本身置于恒温箱中，调节恒温箱的设定值为 35℃和90％ERH。

-然后测量醒发时间，即将模具放入恒温箱的时刻和生面团在模具 中达到85mm的高度的时刻之间的时间。

-在恒温箱中醒发1小时后，将一些模具置于205℃通风的 Angoulvant旋转烤炉22分钟。

在性能水平上最有优势的指示之一是以分钟测量的醒发时间。下 表显示用两个菌株产生的干酵母获得的醒发时间，取决于增殖方案是 慢或快。示出了根据各种试验获得的值的范围。

在制面包中各种测试期间获得的醒发时间范围。

观察到用I-4743菌株在慢方案中获得的性能水平与用I-2970参考 菌株在快方案中获得的性能水平在相同水平。