肼腈类组织蛋白酶K抑制剂及其在制备治疗骨关节炎药物中的应用

摘要

肼腈类组织蛋白酶K抑制剂及其在治疗骨关节炎方面的应用，属于组织蛋白酶抑制剂技术领域。该抑制剂具有新型的、不同取向的P3基团，在细胞外其对组织蛋白酶K的抑制效应皆在纳摩尔浓度水平，对K和S，B的选择性皆在数百倍甚至以上。即使对同源性很高的组织蛋白酶K和L的选择性也都在数百倍以上。以原代软骨细胞为模型，采用两种培养条件：(1)细胞传代、(2)抗坏血酸和β‑甘油磷酸刺激培养。分别采用明胶酶谱法和定量荧光法测试，发现其组织蛋白酶K的表达量在两种条件下都有增加；然后加入该新型抑制剂后，组织蛋白酶K的活性降低。说明在细胞内该抑制剂也能很好地发挥作用，对组织蛋白酶K显示很好的抑制效果。

说明书

技术领域

本发明属于组织蛋白酶抑制剂技术领域，具体涉及一类新型高效的肼腈类组织蛋白酶抑制剂，其对组织蛋白酶K和B、L、S的选择性有极大地提高，且在制备治疗骨关节炎的相关药物方面有潜在的应用性，从而在临床上对于治疗骨关节炎及相关疾病有重要的意义。

背景技术

骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是由机械性损伤和生物因素相互作用而导致的一系列病变。作为一种退行性关节紊乱的疾病，骨关节炎的主要特征表现为关节软骨破坏、软骨下骨改变、以及滑膜炎等，严重影响着患者的日常生活^[1]；在未来几年内，骨关节疾病将会越发引起人们的关注^[2]。OA的发病机制非常复杂，至今还没有统一定论^[3]。目前治疗OA的药物包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、以及其它一些生物药物(如氨基葡萄糖、硫酸软骨素和透明质酸等)，但是它们也仅限于表象治疗，而且治疗效果不明显，重现性差^[4]。

有证据表明，在骨关节炎症处由于蛋白水解酶的过量表达而导致软骨的分解代谢能力增强，包括蛋白聚糖的损耗和II型胶原蛋白的降解^[3,5]。目前已被确认的致使软骨降解的关键酶有：基质金属蛋白酶(尤其是MMP-3，MMP-9和MMP-13)，蛋白聚糖酶(ADAMTS-4和ADAMTS-5)和半胱氨酸蛋白酶^[5-8]。其中木瓜类半胱氨酸蛋白酶家族的一员——组织蛋白酶K(Cathepsin>[9]。当Cat>[10]和硬化疾病^[11]；相反地，当Cat>[9,12]，因此组织蛋白酶K的正常表达在生命活动中至关重要。已有研究表明，Cat>[13]，因而成为治疗骨关节炎类疾病的药物靶标酶；而其抑制剂则在治疗骨关节炎方面显示了极佳地保护软骨的能力^[14-16]，从而在骨生物学研究中意义重大。

为了提供更多的治疗骨关节炎的潜在药物小分子的结构，也为了进一步优化其抑制效应和生物学性能，本发明以商业化的组织蛋白酶K抑制剂—— Odanacatib(ODNA)为参照，比较研究几个新合成的新型小分子抑制剂。

发明内容

本发明的目的是：一、提供两个新型的组织蛋白酶K抑制剂——(±)CKI-E和(±)CKI-F，它们不但对组织蛋白酶K显示了很好的抑制性能(较低的IC₅₀和K_i值)，且对组织蛋白酶K和B、L和S的选择性有极大提高。二、MTT比色法测试的结果表明,在高浓度存在的条件下两种抑制剂在细胞水平上均未显示任何毒性。三、在小鼠原代软骨细胞内利用明胶酶谱法和定量荧光法所测试的两种抑制剂对组织蛋白酶K的活性影响。结果表明：这两种抑制剂都是很好的药物潜体。

本发明所述的抑制剂的合成及表征

我们将新抑制剂结构中的P3位基团改变为对位/间位二联苯的甲基砜，使抑制剂分子的大小、取向、亲疏水性能与组织蛋白酶K的S3口袋在结构上更匹配，从而提高其对组织蛋白酶K的抑制效应以及它们对组织蛋白酶K和其它组织蛋白酶的抑制选择性。

本发明中所述的组织蛋白酶K的高选择性新抑制剂的结构式如下所示：

具体地，包括如下两种结构：

它们可通过以下的合成路线得到：

以上路线分别是针对合成P3位是(±)4-甲基砜苯的对位(para-)衍生物和间位(meta-)衍生物。在抑制剂小分子的合成过程中，先后采用了对位/间位溴苯乙酸和LDA参与的亲核反应、氯甲酸异丁酯和N-甲基吗啉参与的酰胺化反应、以及芳基硼酸和溴代芳烃参与的Suzuki反应。

该抑制剂具有新型的、不同取向的P3基团，在细胞外其对组织蛋白酶K的抑制效应皆在纳摩尔浓度水平，对K和S，B的选择性皆在数百倍甚至以上。即使对同源性很高的组织蛋白酶K和L的选择性也都在数百倍以上。当该新型抑制剂浓度达10^-6M时，其对成骨肉瘤细胞、成熟小鼠的平滑肌细胞、或软骨细胞均无任何毒副作用。以原代软骨细胞为模型，采用两种培养条件：(1)细胞传代、(2)抗坏血酸和β-甘油磷酸刺激培养。分别采用明胶酶谱法和定量荧光法测试，发现其组织蛋白酶K的表达量在两种条件下都有增加；然后加入该新型抑制剂后，组织蛋白酶K的活性降低。说明在细胞内该抑制剂也能很好地发挥作用，对组织蛋白酶K显示很好的抑制效果。

附图说明

图1：化合物CKI-E抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图2：化合物CKI-E抑制组织蛋白酶L的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图3：化合物CKI-E抑制组织蛋白酶S的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图4：化合物CKI-E抑制组织蛋白酶B的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图5：化合物CKI-F抑制组织蛋白酶K的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图6：化合物CKI-F抑制组织蛋白酶L的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图7：化合物CKI-F抑制组织蛋白酶S的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图8：化合物CKI-F抑制组织蛋白酶B的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线。

图9：抑制剂(±)CKI-E和(±)CKI-F对成熟小鼠的平滑肌细胞、人成骨肉瘤细胞、小鼠原代软骨细胞的细胞存活率测试图。

图10：软骨细胞在传代过程中(原代P0、第一代P1、第二代P2、第三代P3)的变化图。

图11明胶酶谱法测试对照组DMSO(A)、化合物CKI-E(B)、CKI-F(C)、ODAN(D)对软骨细胞(P0、P1、P2、P3)中组织蛋白酶K的活性的影响图。

图12(A)荧光法测试软骨细胞(P0、P1、P2、P3)中组织蛋白酶K的活性表达图；(B)以DMSO为对照组，荧光法测定化合物CKI-E、CKI-F，ODAN对第2代软骨细胞中组织蛋白酶K活性的表达图。

图13(A)荧光法测试经抗坏血酸和β-甘油磷酸刺激过的原代软骨细胞和对照组未被刺激过的原代软骨细胞中组织蛋白酶K的活性表达图；(B)以刺激过的原代软骨细胞为对照组，分别加入化合物CKI-E、CKI-F，ODAN进行抑制后，各组软骨细胞中组织蛋白酶K的活性表达图。

抑制剂的抑制效应检测

1.抑制效应

抑制剂对酶的抑制效应主要通过IC₅₀和K_i值来表示，其中IC₅₀是半数抑制浓度，指在一定实验条件下将酶的活性降到原有活力一半时所需抑制剂的浓度；K_i是抑制剂与酶作用的解离常数，也被称作抑制剂的抑制常数。

2.体外酶活检测条件

组织蛋白酶K：配制40mL、pH值为5.5的MES-NaOH缓冲溶液待用，内 含2.5mM EDTA、2.5mM DTT和10％DMSO；以20μmol/L的Z-Phe-Arg-AMC为荧光底物(注：本专利所有缓冲溶液中所用百分比皆为体积百分比)。

组织蛋白酶L：检测条件、荧光底物均与组织蛋白酶K相同。

组织蛋白酶B：配制40mL、pH值为6.0的MES-NaOH缓冲溶液待用，内含2.5mM EDTA、2.5mM DTT、10％DMSO和0.001％Tween20；以20μmol/L的Z-Phe-Arg-AMC为荧光底物。

组织蛋白酶S：配制40mL、pH值为6.5的MES-NaOH缓冲溶液待用，内含2.5mM EDTA、2.5mM DTT、10％DMSO和0.001％BSA；以40μmol/L的Z-VVR-AMC为荧光底物。

3.抑制效应检测过程

首先配置酶、底物和抑制剂的贮备液；然后根据需要将抑制剂按一系列的浓度梯度稀释，采用酶标仪来监测酶的反应速率；根据酶的剩余活力和抑制剂浓度作图，算出酶的半数抑制浓度IC₅₀，进而计算出K_i；并对其进行构-效关系分析，最终选择出抑制效应高且选择性好的抑制剂。

设置仪器参数之后，进行酶活检测：

首先，在96孔板的前三个孔中平行做3个空白对照组实验，在后面9个孔中依次加入1μL不同浓度(1nM～7μM)的抑制剂(CKI-E或CKI-F)；再在这12个孔中分别加入10μL的同一种酶(组织蛋白酶K、L、B或S)；随后分别在前3个孔依次加入40μL相对应的缓冲溶液，后9个孔中依次加入39μL相对应的缓冲溶液，使每个孔中溶液的总体积达50μL。将96孔板放入37℃恒温培养箱中孵育30min之后，加入50μL相对应的底物；充分混匀后，利用酶标仪立即进行酶活性检测。将测得的数据输入Origin软件，利用Sigmoidal进行曲线拟合，在获得的曲线上，观察酶活力被抑制50％时所需抑制剂的浓度，即IC₅₀值。抑制剂(CKI-E或CKI-F)对组织蛋白酶K的半数抑制浓度(IC₅₀)测量曲线见附图1-8。

4.酶活性检测结果如表1所示：

表1：抑制剂对四种酶的IC₅₀数据

根据已报道的、在相同条件下测得的米氏常数(K_m)^[17]：组织蛋白酶K，K_m＝18.06±0.22μM；组织蛋白酶L，K_m＝3.525±0.405μM；组织蛋白酶B，K_m＝157.5±2.5μM；组织蛋白酶S，K_m＝102.19±1.51μM；以及公式K_i＝IC₅₀/(1+[S]/K_m)，将IC₅₀值转换成K_i值后的结果见表2；其中[S]为底物浓度，K_m为米氏常数。

表2：抑制剂对四种酶的K_i数据

由试验结果知，本发明所合成的两个新型抑制剂对组织蛋白酶K的抑制效果都达到了纳摩尔浓度级别，其中(±)CKI-E的抑制常数达到了1.14nM。而且(±)CKI-E和(±)CKI-F对于同源性内切酶K和L的选择性也很好，分别达到了195倍和406倍。两个抑制剂对组织蛋白酶K和S、B的选择性也都在数百倍或更高，尤其需要指出的是，(±)CKI-F对组织蛋白酶K和B的选择性达到了3345倍。

细胞存活率的测定

1.MTT比色法

本发明采用四唑盐(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromid,MTT)为基础的比色法(Colorimetric assay)来检测抑制剂小分子对细胞的毒性；其原理是：在具有代谢活性的活细胞内，黄色的MTT可被裂解成紫色的甲瓒(Formazan)晶体^[18,19]；此晶体可以溶解在DMSO中形成有色溶液，然后用多孔扫描分光光度计定量检测。

2.细胞模型和培养条件

本发明采用三种细胞模型，分别为：(a)成熟小鼠的平滑肌细胞(Mouse smooth muscle cell line MOVAS，从成熟小鼠的平滑肌获取)，(b)人成骨肉瘤细胞 (Human osteosarcoma MG-63cell line，从人类成骨肉瘤获取)，(c)小鼠原代软骨细胞(Primary chondrocytes，从刚出生5-6天的幼鼠的软骨处获取)。

细胞的培养条件：在12孔细胞培养板内培养这三种细胞(平滑肌细胞、骨肉瘤细胞或原代软骨细胞)，每板只培养一类细胞，且使用同一高糖型DMEM培养基(10％胎牛血清；100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素；1％谷氨酰胺；2％HEPES缓冲液)，其中每孔50000个细胞，1mL培养基；培养环境为含有5％CO₂和95％空气的37℃恒温培养箱。48小时之后更换一次培养基(注：本专利所有培养基及培养细胞条件中所用百分比皆为体积百分比)。

3.MTT比色法实验过程

当细胞数量生长至约100 000个/孔，利用MTT比色法进行细胞存活率的测试。首先设置两个对照组(含或不含DMSO)，以观察DMSO是否对细胞的活性有影响；其次将本发明制备的小分子抑制剂(±)CKI-E和(±)CKI-F用DMSO溶解，配制成10^-3mol/L储备液待用；然后将DMSO和抑制剂CKI-E、CKI-F的储备液加入DMEM培养基，每一列含3孔做为平行，共4列使之呈现浓度梯度：10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol/L；当细胞数量和状态达标后，移除上层培养基，在12孔细胞培养板的每孔中分别加入1mL含不同浓度梯度DMSO和抑制剂CKI-E、CKI-F的细胞培养基。每个浓度有三个平行样，所以共测试3次(n＝9)；之后放入培养箱孵育48h。每孔加入25μL>

4.实验结果与讨论

抑制剂(±)CKI-E和(±)CKI-F对成熟小鼠的平滑肌细胞、人成骨肉瘤细胞、小鼠原代软骨细胞的细胞存活率的测试结果见附图9。结果表明：当浓度在10^-9～10^-6mol/L范围内，DMSO对MTT比色法未产生干扰。然后将含有DMSO的对照组的细胞存活率设定为100％，加入抑制剂的实验组的吸收值与未加抑制剂的对照组的吸收值的比率即为细胞存活率。当浓度由1nM逐渐增加至1000nM时两种小分子抑制剂皆未对三种细胞的细胞存活率产生明显影响，这表明在此浓度范围内，两种抑制剂对所测试的三种细胞均无毒性。

细胞内组织蛋白酶K的活性测试

以小鼠原代软骨细胞为模型，本发明采用明胶酶谱法和定量荧光法测试抑制剂CKI-E和CKI-F在细胞水平上对组织蛋白酶K的活性的影响。

1.测试方法—明胶酶谱法和定量荧光法简介

明胶酶谱法^[20]是基于将蛋白质底物(明胶)与SDS-聚丙烯酰胺凝胶混合，使待测蛋白质样本在此凝胶中电泳的方法。蛋白质与凝胶中含阴离子的SDS结合生成蛋白质-SDS中间产物，致使待测蛋白质上携带大量负电荷以至于远远超过蛋白质本身的电荷量，从而使在电泳凝胶中的蛋白质迁移速率仅取决于其本身的分子量，从而忽略蛋白质本身因电荷不同而带来的迁移速率上的差异。凝胶电泳之后，用洗脱液除去SDS,待测蛋白质的活性恢复。孵育一段时间之后，待测蛋白质充分水解底物明胶，再用考马斯亮蓝染色，即可显示一条清晰的白色条带。根据此白色条带的密度和面积，便可测定酶的活性^[21]。

定量荧光法是一种新的方法，可以选择性检测原代软骨细胞内组织蛋白酶K的活性。其基本原理如下：在5-硝基水杨醛(5-Nitrosalicylaldehyde，简称NSA)存在的条件下，将细胞与待测组织蛋白酶K的底物—肽衍生物(4-methoxy-β-naphthylamine，简称4MβNA)共同孵育一段时间后用荧光光谱仪测定其荧光产物的吸光值，作为对照实验值。然后加入组织蛋白酶K的小分子抑制剂后，再测试荧光产物的吸收值。最后，通过加入抑制剂和未加抑制剂的吸收值比值计算(Enzyme activities:得到组织蛋白酶的活性。

2.细胞的培养条件

原代软骨细胞的培养采用DMEM培养基(内含4.5g/L葡萄糖，10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素，1％谷氨酸盐，1％HEPES缓冲液)，连续培养10天，作为对照组体系；然后采用同样的DMEM培养基，但同时含有50μg/mL抗坏血酸(Ascorbic acid,AA)和7.5mMβ-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)，连续培养10天，作为实验组体系，作用为刺激诱导细胞产生更多的组织蛋白酶。与此同时，本发明还对软骨细胞进行传代，采用DMEM培养基(内含4.5g/L Glucose，10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，1％谷氨酸盐，1％HEPES缓冲液；以下传代步骤皆用此培养基)培养约48h。后移除此培养基，用PBS 清洗后，加入2mL胰酶(Trypsin)后置于37℃培养箱中等待细胞悬浮，然后加入8mL高糖DMEM培养基吹打混匀。均分5mL混合液于15mL离心管中离心(400g,5min)，获取下层沉淀，并加入500μL提取缓冲液(20nM Tris-HCl,pH＝7.5,5mM EGTA,150mM NaCl,10mM NaF,20mMβ-glycerol phosphate,1mM sodium orthovanadate,1％Triton X-100,0.1％Tween 20)，保存为P0(Passage 0)以作备用。将剩余的5mL混合液置于新的培养皿中，再加入4～5mL高糖DMEM培养基置于培养箱中(标记为Passage 1,P1)，用于传代。(附：P1的保存，以及传代P2、P3的保存均同上述步骤)。软骨细胞Primary chondrocytes在传代过程中(原代、第一代、第二代、第三代)的变化见附图10。

3.结果与讨论

3.1采用被传代前后的软骨细胞(原代P0、第一代P1、第二代P2、第三代P3)，利用明胶酶谱法分别测试其中的组织蛋白酶K的活性。以DMSO作为不加抑制剂的对照组(A)，实验组分别加入1μM抑制剂(B:ODAN、C:CKI-E、D:CKI-F)，实验结果见附图11。

从图(A)可知，由原代P0至第二代P2代软骨细胞内组织蛋白酶K的活性随代数逐渐增强，且在第二代时表达量最高。当加入抑制剂ODAN(B),CKI-E(C),CKI-F(D)且浓度达到1μM时，组织蛋白酶的活性均明显被抑制。

3.2采用被传代前后的软骨细胞(原代P0、第一代P1、第二代P2、第三代P3)，利用定量荧光法测试其中的组织蛋白酶K的活性。以DMSO为不加抑制剂的对照组，而分别加入1μM和2μM抑制剂(ODAN、CKI-E、CKI-F)的样品作为实验组，测试结果见附图12。

从图(A)结果可知：从原代P0至第二代P2代软骨细胞内组织蛋白酶K的活性逐渐增强，且在第二代时表达量最高。然后当分别加入1μM、2μM抑制剂(ODAN,CKI-E，CKI-F)后,它们对细胞内的组织蛋白酶K的抑制效应随抑制剂浓度的升高而增强，见图(B)。

3.3采用50μg/mL抗坏血酸(Ascorbic acid,AA)和7.5mMβ-甘油磷酸(β-glycerophosphate,β-GP)连续刺激诱导10天的软骨细胞、和未经刺激诱导的软骨细胞作为实验对照组，利用定量荧光法检测细胞内组织蛋白酶K的表达量，测试结果见附图13。

结果(A)表明：当以未经刺激诱导的细胞作为对照试验组时，经刺激诱导 的细胞内的组织蛋白酶K的相对活力由100增至140，即组织蛋白酶K的表达量明显增加。然后，分别依次加入0.1μM或1μM的抑制剂(CKI-E，CKI-F，ODAN)，它们对细胞内的组织蛋白酶K的抑制效应均随抑制剂浓度的升高而增强，见图(B)。

3.4综合以上明胶酶谱法和定量荧光法的实验结果表明：在被传代的软骨细胞中，组织蛋白酶K的表达量在P2时达最大；当加入抑制剂ODAN,CKI-E或CKI-F后，它们均可抑制细胞内组织蛋白酶K的活性。且在软骨细胞受到诱导刺激后，细胞内的组织蛋白酶K的表达量被明显增加；同样，该条件下当加入ODAN,CKI-E或CKI-F后它们也均可抑制组织蛋白酶K的活性。

具体实施方式

在已有的(±)E4(para-/meta-)合成的前提下^[26]，取0.61g母体化合物(±)E4(para-)、以及其它的从商业渠道获得的化合物：0.43g对(±)甲基砜苯硼酸((4-(methylsulfonyl)phenyl)boronic>2)和0.5g碳酸钾粉末分别加入带有搅拌磁子的100mL圆底烧瓶中，然后将40mL的四氢呋喃加入圆底烧瓶中做为反应溶剂，再用移液枪注入2mL水。三次(氮气-真空)充抽反应体系之后，加热回流约6h^[27]。并用薄层色谱(TLC)监控反应进程，待反应完全，用旋转蒸发仪将烧瓶中的四氢呋喃蒸干。然后加入60mL乙酸乙酯和20mL水，用分液漏斗分出有机相，再用乙酸乙酯萃取3次水相，合并有机相。并依次用水、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤有机相。用无水硫酸钠干燥，待干燥完毕，过滤掉此干燥剂，蒸干乙酸乙酯溶剂，得到化合物(±)CKI-E的粗产物；最后用石油醚：乙酸乙酯＝1：1(体积：体积)的混合溶剂做为展开剂，进行硅胶柱层析提纯，得(±)CKI-E的白色粉末状固体0.23g。

同样的步骤，用(±)E4(meta-)代替(±)E4(para-)，其它实验条件相同，得(±)CKI-F的白色粉末状固体0.19g。

CKI-E表征结果如下：

¹H>3):δ8.03(d,J＝8.2Hz,2H),δ7.78(d,J＝8.3Hz,2H),δ7.61(d,J＝8.2Hz,2H),δ7.46(dd,J＝22.0,9.8Hz,2H),δ4.26(t,J＝7.2Hz,1H),δ3.21(s,4H),δ3.12(s,3H),δ2.62(s,3H),δ2.09-1.98(m,1H),δ1.66(dt,J>

¹³C>3):δ174.48(s),δ145.85(s),δ140.32(s),δ139.28(s),δ137.99(s),δ128.74(s),δ127.91(d,J＝18.6Hz),δ113.91(s),δ45.81(s),δ44.61(s),δ43.58(s),δ40.59(s),δ30.64(s),δ25.67(s),δ22.71(s),δ22.40(s).

MS(ESI)m/z:414.1841[M+H]⁺,827.3567[2M+H]⁺.

CKI-F表征结果如下：

¹H>3):δ8.04(d,J＝8.1Hz,2H),δ7.80(dd,J＝18.9,8.1Hz,1H),δ7.58-7.51(m,2H),δ7.47(dd,J＝15.1,7.4Hz,1H),δ4.30(dt,J＝14.8,7.2Hz,1H),δ3.20(s,3H),δ3.12(s,4H),δ2.59(s,2H),δ2.15-1.81(m,2H),δ1.50(ddd,J＝22.6,14.0,7.2Hz,1H),δ0.97(dd,J＝10.9,4.3Hz,6H).

¹³C>3):δ174.50(s),δ146.02(s),δ140.75(s),δ139.87(s),δ139.49(s),δ129.69(s),δ128.54–127.67(m),126.61(d,J＝8.7Hz),δ126.29(s),δ46.19(s),δ44.64(s),δ43.73(s),δ40.57(s),δ30.67(s),δ25.74(s),δ22.64(s),δ22.47(s).

MS(ESI)m/z:414.1839[M+H]⁺,827.3571[2M+H]⁺.

参考文献

1.Johnson,V.L.；Hunter,D.J.；Best Pract.Res.Cl.Rh.,2014,28,5.

2.Mueller,M.B.；Tuan,R.S.；Pm.R.,2011,3,S3.

3.Ishiguro,N.；Kojima,T.；Poole,A.R.；Nagoya J.Med.Sci.,2002,65,73.

4.Martel-Pelletier,J.；Lajeunesse,D.；Fahmi,H.；Tardif,G.；Pelletier,J.P.；Curr.Rheumatol.Rep.,2006,8,30.5.

5.Loeser,R.F.；J.Musculoskel.Neuron.,2008,8,303.6.

6.Miller,R.E.；Lu,Y.；Tortorella,M.D.；Malfait,A.M.；Curr.Rheumatol.Rep.,2013,15,350.

7.Zhou,S.；Thornhill,T.S.；Meng,F.；Xie,L.；Wright,J.；Glowacki,J.；J.Orthop.Res.,2016,34,454.

8.Kozawa,E.；Cheng,X.W.；Urakawa,H.；Arai,E.；Yamada,Y.；Kitamura,S.；Sato,K.；Kuzuya,M.；Ishiguro,N.；Nishida,Y.；J.Orthop.Res.,2016,34,127.

9.Yasuda,Y.；Kaleta,J.；D.；Adv.Drug Deliver.Rev.,2005,57,973.

10.Gelb,B.D.；Shi,G.P.；Chapman,H.A.；Desnick,R.J.；Science,1996,273,1236.

11.Gowen,M.；Lazner,F.；Dodds,R.；Kapadia,R.；Field,J.；Tavaria,M.；Bertoncello,I.；Drake,F.；Zavarselk,S.；Tellis,I.；Hertzog,P.；Debouck,C.；Kola, I.；J.Bone Miner.Res.,1999,14,1654.

12.Vasiljeva,O.；Reinheckel,T.；Peters,C.；Turk,D.；Turk,V.；Turk,B.；Curr Pharm Des.,2007,13,387.

13.Novinec,M.；B.；Biol.Chem.,2013,394,1163.

14.Hayami,T.；Zhuo,Y.；Wesolowski,G.A.；Pickarski,M.；Duong T.；Bone,2012,50,1250.

15.McDougall,J.J.；Schuelert,N.；Bowyer,J.；Osteoarthr.Cartilage,2010,18,1355.

16.Connor,J.R.；LePage,C.；Swift,B.A.；Yamashita,D.；Bendele,A.M.；Maul,D.；Kumar,S.；Osteoarthr.Cartilage,2009,17,1236.

17.Ren X.-F.；Li H.-W.；Fang X.；Wu Y.；Wang L.；Zou S.；Org.Biomol.Chem.,2013,11,1143.

18.Vistica,D.T.；Skehan,P.；Scudiero,D.；Monks,A.；Pittman,A.；Boyd,M.R.；Cancer Res.,1991,51,2515.

19.Slater,T.F.；Sawyer,B.；U.；Biochim.Biophys.Acta,1963,77,383.

20.Kleiner,D.E.；Stetler-stevenson,W.G.；Anal.Biochem.,1994,218,325.

21.陈秋凤；周防震；湖北民族学院学报，2012,29,70.

22.Rüttger,A.；Mollenhauer,J.；R.；Gütschow,M.；Wiederanders,B.；Biotechniques,2006,41,469.

23.Dolbeare,F.A.；Smith,R.E.；Clin.Chem.,1977,23,1485.

24.Schwartz,W.N.；Barrett,A.J.；Biochem.J.,1980,191,487.

25.Simon,J.；Duffy,M.J.；Biochem.Soc.Trans.,1986,14,460.

26.Yuan,X.-Y.；Fu,D.-Y.；Ren X.-F.；Fang X.；Wang L.；Zou S.；Wu Y.；Org.Biomol.Chem.,2013,11,5847.

27.Kaupp,G.；Naimi-Jamal,M.R.；Stepanenko,V.；Chem.Eur.J.,2003,9,1156。