一种利用甘蔗条纹花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒

摘要

本发明涉及一种利用甘蔗条纹花叶病毒P3N‑PIPO构建的植物亚细胞定位试剂盒，包括4个分别标记绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白的胞间连丝定位载体：SCSMV‑P3N‑PIPO‑GFP、pSCSMV‑P3N‑PIPO‑RFP、pSCSMV‑P3N‑PIPO‑YFP和pSCSMV‑P3N‑PIPO‑CFP；4个无特异亚细胞定位的对照载体：pSAT6‑EGFP‑C1、pSAT6‑ERFP‑C1、pSAT6‑EYFP‑C1和pSAT6‑ECFP‑C1；限制性内切酶Xho I、Hind III、无RNase水和侵染液。使用本试剂盒可以快速明确目的基因表达产物是否具有胞间连丝定位的特性。

说明书

技术领域本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种利用甘蔗条纹花叶病毒P3N-PIPO构建 的亚细胞定位试剂盒。本发明利用分别带有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标 记、红色荧光蛋白(redfluorescentprotein,RFP)标记、黄色荧光蛋白(yellowfluorescentprotein, YFP)标记和青色荧光蛋白(cyanfluorescentprotein,CFP)标记的具有特异胞间连丝 (Plasmodesma,PD)定位功能的蛋白SCSMV-P3N-PIPO，指示待验证基因表达蛋白是否具有 胞间连丝定位的特性，属于生物技术领域。

背景技术随着生物技术的发展，尤其是基因组学的发展和测序技术的进步，越来越多的 新基因被发现，已经形成了海量数据。明确未知基因的功能，探讨其潜在的应用价值，是基 因组学研究的终极目标。蛋白质是基因的表达产物，蛋白质的亚细胞定位与蛋白质的结构和 功能关系密切，蛋白质必须处于合适的位置才能发挥其功能。对于一个新基因，明确其表达 产物即蛋白质的亚细胞定位，可以为研究该基因的功能提供重要线索。目前，确定蛋白质亚 细胞定位的方法主要有三种：细胞分馏法，电子显微镜分析，激光共聚焦法，其中激光共聚 焦法应用最为广泛。激光共聚焦法利用标记荧光蛋白受激发产生的荧光信号，可以直观的观 察到目标蛋白所在的亚细胞位置。在对目标蛋白的亚细胞定位进行研究时，需要阳性对照， 即具有特异亚细胞地位的带有可检测标记的蛋白，佐证未知蛋白的定位。

胞间连丝(Plasmodesma,PD)是植物体内穿过细胞壁连接相邻细胞的细胞质和内质网的 连丝微管，是细胞间物质运输与信息传递的重要通道。PD的结构极其复杂，至今依然没有完 全清楚，其结构模型一直处于补充更新状态。PD的通透性受多种因素调节，小分子物质可以 通过胞间连丝自由扩散，但是蛋白质、核酸等大分子或者大分子复合体如病毒粒子、核糖体 蛋白复合体等的胞间移动受PD的调控。对于植物胞间信号传导和物质运输等方面的研究而 言，尽管可以利用生物信息学手段对分离到的基因的编码蛋白亚细胞定位进行预测，但是必 须对该基因编码蛋白做亚细胞定位进行生物学实验，明确其能否定位于PD，进而判定该蛋白 是否参与胞间信号转导和物质运输，为研究其功能提供直观的实验证据。

2008年，Chung等利用生物信息学方法，对包括甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus, SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)和甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestreak mosaicvirus,SCSMV)等在内的48个马铃薯Y病毒科的病毒分析表明，在P3基因内部存在 一个保守结构G_1-2A_6-7，核糖体在该保守结构通过+2移码可以翻译出一个大约6-7kDa的蛋白 (PIPO)，该蛋白与P3蛋白的N端结合，形成一个大约25kDa的融合蛋白，即P3N-PIPO。 Chung等克隆了芜菁花叶病毒(Turnipmosaicvirus,TuMV)的P3N-PIPO编码序列，并通过 实验证实了TuMV-P3N-PIPO定位于胞间连丝。研究表明，P3N-PIPO很可能是马铃薯Y病毒 的移动蛋白，该蛋白通过与寄主因子互作，使病毒通过胞间连丝实现胞间移动，进而对寄主 建立系统性侵染(Choi等,2005；Chung等,2008；Wen等,2010；Wei等,2010；Vijayapalani等, 2012)。但是有关SCMV-P3N-PIPO，SrMV-P3N-PIPO和SCSMV-P3N-PIPO的亚细胞定位研 究还未见报道。

发明内容本发明的目的是提供一种利用甘蔗条纹花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞 定位试剂盒，为检测目的基因表达产物是否定位于植物胞间连丝提供指示。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下。

利用融合PCR技术，以SCSMV的P3基因编码序列为模板，克隆了P3N-PIPO的编码 序列，构建到携带不同荧光标记蛋白基因植物表达载体上，转化农杆菌，注射本氏烟叶片， 在激光共聚焦显微镜下使用相应的激光激发并采集发射光信号，即可在本氏烟上皮细胞的胞 间连丝位置上观测到清晰明亮的点状图像，证明了P3N-PIPO定位于胞间连丝。据此，我们 利用SCSMV的P3N-PIPO构建了植物亚细胞定位试剂盒。

本发明的一种利用甘蔗条纹花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒，其特征在于 该试剂盒由下列试剂组成：

(1)绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP，作为阳性对照，1管， 100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(2)红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-RFP，作为阳性对照，1管， 100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(3)黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-YFP，作为阳性对照，1管， 100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(4)青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-CFP，作为阳性对照，1管， 100ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(5)载体pSAT6-EGFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(6)载体pSAT6-ERFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(7)载体pSAT6-EYFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(8)载体pSAT6-ECFP-C1，1管，500ng/μL，50μL/管，-20℃冷冻保存备用；

(9)限制性内切酶XhoI：1管，500units，100μL/管；

(10)限制性内切酶HindIII：1管，500units，100μL/管；

(11)无RNase水：2瓶，100mL/瓶；

(12)侵染液：1管，50mL/管，-20℃冷冻保存备用；所述侵染液，包括D-葡萄糖，250 mg；MES，5mL；Na₃PO₄·12H₂O，5mL；乙酰丁香酮，5μL；加入ddH₂O至总体积50mL。

所述绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP的构建方法：使用XhoI 和HindIII对载体pSAT6-EGFP-C1(GenBank:AY818374)进行双酶切，然后用T4DNA连 接酶将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中， 挑取阳性克隆验证；

所述红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-RFP的构建方法：使用XhoI 和HindIII对载体pSAT6-ERFP-C1(GenBank:DQ005474)进行双酶切，然后用T4DNA连接 酶将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑 取阳性克隆验证；

所述黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-YFP的构建方法：使用XhoI 和HindIII对载体pSAT6-EYFP-C1(GenBank：AY818380)进行双酶切，然后用T4DNA连 接酶将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中， 挑取阳性克隆验证；

所述青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-CFP的构建方法：使用XhoI 和HindIII对载体pSAT6-ECFP-C1(GenBank：AY818374)进行双酶切，然后用T4DNA连 接酶将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中， 挑取阳性克隆验证；

所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：11所示的核苷酸序列。

本发明的优点和有益效果：使用本试剂盒可以快速将目的基因构建到带有荧光标记的载 体中，明确其表达产物是否具有胞间连丝定位的特性。本试剂盒提供了4种荧光标记载体， 为使用者提供了更多的选择，满足了研究不同基因表达产物是否共定位于胞间连丝的需求。 使用本试剂盒可以快速完成目的基因表达产物的亚细胞定位。

附图说明：

图1为绿色荧光蛋白标记载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP的图谱；

图2为红色荧光蛋白标记载体pSCSMV-P3N-PIPO-RFP的图谱；

图3为黄色荧光蛋白标记载体pSCSMV-P3N-PIPO-YFP的图谱；

图4为青色荧光蛋白标记载体pSCSMV-P3N-PIPO-CFP的图谱；

图5为红色荧光标记的拟南芥AtREM1.3亚细胞定位载体pAtREM1.3-RFP的图谱；

图6为pAtREM1.3-RFP和pSCSMV-P3N-PIPO-GFP亚细胞定位图的合并图；

图7为GFP载体pSAT6-EGFP-C1的亚细胞定位图；

图8为RFP载体pSAT6-ERFP-C1的亚细胞定位图。

具体实施方式为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实施例加以说明。下 述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如无特殊说 明均可从商业途径获得。

实施例一：SCSMV-P3N-PIPO编码序列的克隆

本发明利用PCR技术，克隆了甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV) 的P3蛋白编码序列；以P3基因为模板，利用融合PCR技术，克隆了SCSMV的P3N-PIPO 的编码序列，并将该序列连接到带有不同荧光蛋白标记的表达载体中，获得了4个能够特异 定位于胞间联丝的亚细胞表达载体，即绿色荧光蛋白标记的PD定位载体 pSCSMV-P3NPIPO-GFP，红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3NPIPO-RFP，黄色荧 光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3NPIPO-YFP和青色荧光蛋白标记的PD定位载体 pSCSMV-P3NPIPO-CFP。载体构建方法如下：

(1)SCSMV-P3编码序列的获得：针对SCSMV-P3的编码序列设计特异PCR引物， SCSMV-P3-F(上游引物)和SCSMV-P3-R(下游引物)，以SCSMV的cDNA为模板，进行 PCR扩增，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得SCSMV-P3的编码序列。 所述上游引物SCSMV-P3-F的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；下 游引物SCSMV-P3-R的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；SCSMV-P3 编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：3所示的核苷酸序列；

(2)SCSMV-P3N编码序列的获得：设计特异PCR引物，SCSMV-P3N-F(上游引物) 和SCSMV-P3N-R(下游引物)，在上游引物SCSMV-P3N-F中引入酶切位点XhoI。以 SCSMV-P3编码序列为模板，使用引物SCSMV-P3N-F和SCSMV-P3N-R进行PCR扩增，反 应体系为25μL：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs2.0μL，上游引物SCSMV-P3N-F(10μmol/L) 1.0μL，下游引物SCSMV-P3N-R(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH₂O17.375 μL，模板(cDNA)1.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35 个循环，94℃30s，50℃30s，72℃1min；最后72℃10min。PCR反应结束后，将PCR产 物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并浓缩至400ng/μL，获得SCSMV-P3N的编码序列。 所述上游引物SCSMV-P3N-F的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：4所示的核苷酸序列； 下游引物SCSMV-P3N-R的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：5所示的核苷酸序列； SCSMV-P3N编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：6所示的核苷酸序列；

(3)SCSMV-PIPO编码序列的获得：设计特异PCR引物，SCSMV-PIPO-F(上游引物) 和SCSMV-PIPO-R(下游引物)，在下游引物SCSMV-P3N-R中引入酶切位点HindIII。以 SCSMV-P3编码序列为模板，使用引物SCSMV-PIPO-F和SCSMV-PIPO-R进行PCR扩增， 反应体系为25μL：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs2.0μL，上游引物SCSMV-PIPO-F(10μmol/L) 1.0μL，下游引物SCSMV-PIPO-R(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH₂O17.375 μL，模板(cDNA)1.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35 个循环，94℃30s，50℃30s，72℃1min；最后72℃10min。PCR反应结束后，将PCR产 物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并浓缩至400ng/μL，获得SCSMV-PIPO的编码序列。 所述上游引物SCSMV-PIPO-F的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：7所示的核苷酸序列； 下游引物SCSMV-PIPO-R的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：8所示的核苷酸序列； SCSMV-PIPO编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：9所示的核苷酸序列；

(4)SCSMV-P3N-PIPO编码序列的获得：将浓度均为400ng/μL的P3N和PIPO的PCR 产物按照1：1混合作为模板，使用引物SCSMV-P3N-F和SCSMV-PIPO-R，利用融合PCR 方法克隆SCSMV-P3NPIPO编码序列。PCR反应体系为25μL：10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs 2.0μL，上游引物SCSMV-P3N-F(10μmol/L)1.0μL，下游引物SCSMV-PIPO-R(10μmol/L) 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH₂O12.375μL，模板(cDNA)6.0μL，总体积25μL。 PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35个循环，94℃30s，55℃30s，72℃1min； 最后72℃10min。PCR反应结束后，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获 得SCSMV-P3N-PIPO的编码序列。所述SCSMV-P3N-PIPO编码序列的核苷酸序列为序列表 中SEQIDNO：10所示的核苷酸序列；

(5)插入片段S的获得：使用XhoI和HindIII对SCSMV-P3N-PIPO编码序列进行双酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得插入片段S；所述插入片段S的 核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：11所示的核苷酸序列；

(6)绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP的构建：使用XhoI和 HindIII对载体pSAT6-EGFP-C1(GenBank:AY818374)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接 产物转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到绿色荧光 蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP，其图谱如图1所示；

(7)红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-RFP的构建：使用XhoI和 HindIII对载体pSAT6-ERFP-C1(GenBank:DQ005474)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接 产物转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到红色荧光 蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-RFP，其图谱如图2所示；

(8)黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-YFP的构建：使用XhoI和 HindIII对载体pSAT6-EYFP-C1(GenBank：AY818380)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂 糖凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连 接产物转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到黄色荧 光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-YFP，其图谱如图3所示；

(9)青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-CFP的构建：使用XhoI和 HindIII对载体pSAT6-ECFP-C1(GenBank：AY818374)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂 糖凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连 接产物转化至感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验证，得到青色荧 光蛋白标记的PD定位载体pSCSMV-P3N-PIPO-CFP，其图谱如图4所示；

实施例二：拟南芥AtREM1.3的亚细胞定位

1、拟南芥AtREM1.3基因的克隆

从拟南芥中克隆了一个Remorin基因，将其克隆到克隆载体pMD19-T中。进化树分析表 明该基因属于Remorin基因家族的第1亚群的第3种类型，命名为AtREM1.3。文献表明Remorin 可以定位于质膜和胞间连丝，但是生物信息学分析表明，Remorin没有跨膜结构域和信号肽。 为验证AtREM1.3是可以定位于胞间连丝，使用本试剂盒对其进行亚细胞定位研究。所述 AtREM1.3编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：12所示的核苷酸序列；

2、亚细胞定位载体pAtREM1.3-RFP的构建

(1)设计特异PCR引物，AtREM1.3-F(上游引物)和AtREM1.3-R(下游引物)，在上 游引物AtREM1.3-F中引入酶切位点XhoI，在下游引物AtREM1.3-R中引入酶切位点HindIII。 使用该对引物，以AtREM1.3基因的克隆载体为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL： 10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs2.0μL，上游引物SCSMV-PIPO-F(10μmol/L)1.0μL，下游 引物SCSMV-PIPO-R(10μmol/L)1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.125μL，ddH₂O17.375μL，模 板(cDNA)1.0μL，总体积25μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；然后运行35个循环， 94℃30s，50℃30s，72℃1min；最后72℃10min。PCR反应结束后，使用XhoI和HindIII 对PCR产物进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得插入片段 InsTarget；所述上游引物AtREM1.3-F的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：13所示的核苷 酸序列；下游引物AtREM1.3-R的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：14所示的核苷酸序列； 插入片段InsTarget的核苷酸序列为序列表中SEQIDNO：15所示的核苷酸序列；

(2)取RFP对照载体，使用XhoI和HindIII对载体pSAT6-ERFP-C1进行双酶切，将酶 切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段 InsTarget连接，并将连接产物转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α中，挑取阳性克隆验 证，得到红色荧光蛋白标记的PD定位载体pAtREM1.3-RFP，其图谱如图5所示；

3、亚细胞定位实验

(1)采用液氮冻融法，分别将亚细胞定位载体pAtREM1.3-RFP和GFP标记的PD定位 载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP转入感受态的农杆菌EHA105菌株中；在5mLLB培养基(含 Rif，34μg/mL；Kan，50μg/mL)中培养转化的农杆菌，28℃，200rpm培养过夜；

(2)常温下，5,000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL侵染液重悬菌液；

(3)重复步骤(2)，洗去培养基中含有的抗生素；

(4)加入1mL侵染液，测定菌液OD₆₀₀，并调节OD₆₀₀值至0.1；

(5)取750μL菌液于2mL无菌离心管中，混匀，放置3～5h；将含有亚细胞定位载体 pAtREM1.3-GFP的菌液和含有YFP标记载体的菌液等比混匀，进行侵染实验；

(6)取健康本氏烟植株(在侵染前，光照处理烟草1h)，选择两片大的叶片，在烟草叶 片背面(两个叶脉间)注射菌液并做好标记；

(7)把侵染过的烟草放在正常条件下培养。2天后取侵染叶片1-2cm²，背面朝上，用激 光共聚焦显微镜观察。在采集荧光信号时，对同一个细胞分别采集不同荧光信号。待检测的 pAtREM1.3-RFP标记的是红色荧光蛋白，采集红色荧光蛋白信号时，在箭头所示位置会出现 亮点，表明AtREM1.3在细胞膜上表达，但是无法确定其定位于PD；本试剂盒提供PD定位 载体pSCSMV-P3N-PIPO-GFP标记的是绿色荧光蛋白，采集绿色荧光信号时，也会出现亮点， 表明亮点所在位置即为胞间连丝；当把两张图片合并时，红色亮点和绿色亮点准确叠加后显 示为黄色的亮点，表明AtREM1.3定位于胞间连丝，如图6所示。

(8)按照上述程序和方法，将GFP载体pSAT6-EGFP-C1和RFP载体pSAT6-ERFP-C1 在本氏烟叶片表皮细胞中表达，激光共聚焦显微镜下检测荧光信号。绿色荧光信号为散布状 态(图7)，红色荧光信号为散布状态(图8)，表明绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白没有特异的 亚细胞定位，目标蛋白的亚细胞定位不是绿色或红色荧光蛋白引起的，由此，证明AtREM1.3 可以定位于胞间连丝。

所述琼脂糖凝胶电泳，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第六章第一节中琼脂糖凝胶 电泳的方法；所述将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α中，转化方法参照《分子克隆实 验指南》(第二版)第一章第五节中用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌的方法；所述含有阳 性克隆的菌落的挑取，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第一章第六节中含重组质粒的细 菌菌落的鉴定方法；所述提取质粒DNA的方法，参照质粒提取试剂盒说明书；所述酶切方 法，参照限制性内切酶的说明书；所述回收方法，参照胶回收试剂盒说明书；所述用T4-DNA 连接酶进行连接方法，参照T4-DNA连接酶操作说明书。