甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用

摘要

本发明涉及肿瘤药物领域，特别涉及甜甙及其类似物的制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用。一种甜甙及其类似物的制备方法，通过预处理、树脂分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度大于96％。甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物以STAT3信号通路为药物靶点；和/或以ERK信号通路为药物靶点。甜甙及其类似物是以STAT3和/或以ERK信号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌症具有非常好的抑制效果。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤药物领域，具体而言，涉及甜甙及其类似物的 制备及作为STAT3、ERK信号通路靶位点药物在抗肿瘤中的应用。

背景技术

STAT3是信号转导和转录活化因子(STAT)家族重要的成员， 在很多恶性的组织类型肿瘤中均呈现高表达，并在肿瘤发生进程中 起促进作用。STAT3在接受非受体酪氨酸激酶、细胞因子以及生长 因子等细胞外信号刺激后被磷酸化激活，形成磷酸化的STAT3 (phosphorylatedSTAT3，P-STAT3)。P-STAT3会迅速移至细胞核内， 与靶基因的启动子相结合，激活基因的转录，进而影响细胞的生长、 增殖与凋亡。STAT3续激活可以导致细胞异常增殖与恶性转化，因 而STAT3信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关。

目前所研究的STAT3与多种人类肿瘤有关系，如结肠癌、胰腺 癌、肺癌、淋巴癌等等。BuettnerR综述了STAT在癌肿中的干预 作用以及细胞调控中的影响，探讨了STAT信号转导途径对的调控， 王俊阁探讨STAT3信号传导通路对喉癌细胞G1～S期调控的可能 机制，发现STAT3信号传导通路可能通过调节CDK/Cyclin复合物 与细胞周期素依赖性激酶抑制因子(CKI)成员之间的平衡而调节喉 癌细胞G1～S期转换。随着对STAT3信号通路的深入研究，STAT3 在肿瘤发生发展过程中所起的作用越来越受到重视，以STAT3为靶 点的治疗方法，抑制STAT3活化有望为某些恶性肿瘤的治疗开辟新 的途径。

STAT3的活化通过磷酸化实现，细胞中STAT3的持续磷酸化会 引起一系列的生物学效应，比如细胞的恶性增殖、抗凋亡，因此利 用药物来抑制STAT3磷酸化是治疗癌症的重要的突破口。

ERK1/2是有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的成员之 一，参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞 凋亡和细胞的恶变等多种生物学反应，而p-ERK1/2是ERK1/2的磷 酸化形式，ERK1/2磷酸化后，进入细胞核作用于c-myc、c-fos、c-jun、 NF-κB等转录因子，调节相关基因的转录，进而参与细胞生长、增 殖、凋亡，该信号转导通路的活化与肿瘤的发生发展密切相关。

因此，靶向调控STAT3、ERK信号通路可以作为治疗肿瘤的重 要途径。自然界是一个巨大的药物宝库，天然化合物具有结构新颖、 多样的特点，是当前开发抗肿瘤药物以及药物先导分子的重要来源。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种甜甙及其类似物的制备方法， 通过预处理、树脂分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的 目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度大于96％。

本发明的第二目的在于提供甜甙及其类似物作为STAT3和 ERK信号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，所述的甜甙及其类似 物通过选择性抑制STAT3、ERK信号通路，诱导癌细胞周期阻滞以 及促进癌细胞凋亡以实现抑制癌细胞增殖功效。

甜甙是以罗汉果醇为前体，在糖基转移酶作用下发生糖基化而 生成的三萜化合物。为了说明甜甙及其类似物的靶向抑癌效果，本 发明以甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2单体举例来说明甜甙的信号通 路靶向抑癌效果，以罗汉果醇举例来说明甜甙及其类似物的靶向抑 癌效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

罗汉果甜甙的制备方法，包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水， 在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；

2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性 蛋白，得到澄清的水溶液；

3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇 进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；

4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中 加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；

5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收 集下柱液，得到富集液；

6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得 到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，按照 20％-75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得到不同糖 基化程度的白色结晶罗汉果甜甙。

甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉 果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。本发明 提供了罗汉果甜甙单体的制备方法，该制备方法通过预处理、特定 树脂的分离、浓缩、特定树脂的分离、浓缩、色谱纯化等步骤，制 备出高纯度的目标产物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯 度在98％以上。

罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水， 在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；

2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性 蛋白，得到澄清的水溶液；

3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇 进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；

4)将所述混合溶液减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至浸膏状，向 浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水 溶液；

5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收 集下柱液，得到富集液；

6)向所述富集液中加入糖苷酶反应，反应温度为45～55℃， 反应时间为6～8h，所述糖苷酶的重量为富集液重量的4％-6％；

7)离心，得到的沉淀即为罗汉果醇粗品，将所述罗汉果醇粗品 水洗3-5次除去水溶杂质，进行冷冻干燥，得到罗汉果醇。

本发明提供的罗汉果醇的制备方法，该制备方法通过预处理、 特定树脂的分离、水解、色谱纯化等步骤，制备出高纯度的目标产 物，工艺具有简单、操作性强的特点，产物纯度在96％以上。

甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐类衍生物、罗汉 果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物或盐类。罗汉果 甜甙上的糖基水解后，可得到罗汉果醇，罗汉果醇是甜甙生物合成 的前体，甜甙是罗汉果醇糖基化的衍生物。罗汉果醇骨架上C3和 C24位置上连接的葡萄糖基数目不同，形成不同种类甜甙化合。罗 汉果甜甙ⅠE1为罗汉果醇C3位加入1个糖基后的衍生物；罗汉果 甜甙ⅡA2为罗汉果醇C3位，加入2个糖基后的衍生物；罗汉果醇 上加入三个或多个糖基后会依次生成甜甙Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜 甙Ⅵ等。

本发明还提供了甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路 靶点药物在治疗肿瘤中的应用，所述甜甙及其类似物以STAT3信号 通路为药物靶点；

和/或

以ERK信号通路为药物靶点。

本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号通路靶 点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物是以STAT3和/或以 ERK信号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌 细胞凋亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌 症具有非常好的抑制效果。

经验证，甜甙及其类似物具有选择性抑制转录因子STAT3 激活的药理活性，抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，抑制肿瘤 生长和转移等抗肿瘤的药理活性。经蛋白免疫印迹检测，该化 合物对STAT3(Tyr705)磷酸化水平具有明显的抑制作用，并 且其抑制作用呈浓度依赖性。进一步地，所述甜甙及其类似物以 STAT3信号通路为药物靶点，所述甜甙及其类似物抑制转录因子 STAT3的磷酸化。

经验证，甜甙及其类似物具有选择性抑制转录因子STAT3 激活的药理活性，调控下游周期蛋白和凋亡基因的表达，即甜 甙及其类似物通过上调控细胞周期蛋白P21阻滞细胞周期，并 下调促凋亡蛋白Bcl-2，从而实现促进肿瘤细胞凋亡的作用。

进一步地，所述甜甙及其类似物上调周期蛋白P21。

更进一步地，所述甜甙及其类似物下调抗凋亡蛋白Bcl-2。

进一步地，所述甜甙及其类似物以ERK信号通路为药物靶点， 抑制ERK磷酸化。本发明提供的甜甙及其类似物具有选择性抑制 ERK磷酸化的药理活性，可通过抑制ERK磷酸化，实现促进肿瘤 细胞凋亡的作用。

甜甙及其类似物是p-STAT3、p-ERK1/2的靶向干预剂，本发明 分别选取了多种肿瘤细胞进行了验证，如组织细胞淋巴瘤细胞 U937(淋巴癌细胞)、人黑色素瘤A875细胞(实体瘤癌细胞)、人白 血病K562细胞(白血病细胞K562)进行STAT3、ERK信号通路干 预实验。结果显示，甜甙及其类似物能够抑制STAT3、ERK信号通 路并可以应用于抑制肿瘤细胞的增殖。

具体地，所述肿瘤包括实体瘤和非实体瘤；

所述实体瘤包括恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状 细胞癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌以及其他 由STAT3和/或ERk信号通路异常表达而引起的肿瘤；

所述非实体瘤包括淋巴瘤、白血病。

进一步地，所述白血病包括大颗粒淋巴细胞白血病、慢性淋巴 细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病。

进一步地，所述药物包括以甜甙及其类似物为主要活性成分， 或者以甜甙及其类似物为配料制成的药物。

进一步地，所述药物由所述甜甙及其类似物与药学上可接受的 载体制成包合物、脂质体、微球、纳米粒或乳剂。

具体地，所述药物的剂型包括注射剂、针剂、片剂、冲剂、颗 粒剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、乳剂中的任一种；

所述丸剂包括滴丸剂和软胶丸剂。

此外，本发明提供的甜甙及其类似物除了制备成药物外，还 可以制备成保健品或食品，如饼干、口香糖、饮料、茶、奶糖、奶 制品等。

优选地，所述药物还包括含有所述甜甙及其类似物的保健品和 食品。

进一步地，所述甜甙及其类似物包括甜甙、以甜甙为母核的盐 类衍生物、罗汉果醇以及罗汉果醇C3或C24位上的糖基化衍生物 或盐类。

其中，所述甜甙可以罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2、甜甙 Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜甙Ⅵ等。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信号 通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，是以STAT3和/或以ERK信 号通路为药物靶点，有效的诱导癌细胞周期阻滞以及促进癌细胞凋 亡，实现了抑制癌细胞增殖和促进癌细胞凋亡的目的，对癌症具有 非常好的抑制效果；

(2)本发明所提供的化合物甜甙及其类似物具有选择性抑 制转录因子STAT3激活的药理活性，调控下游周期蛋白和凋亡 基因的表达，甜甙及其类似物通过上调控细胞周期蛋白P21阻 滞细胞周期，同时下调促凋亡蛋白Bcl-2，从而实现促进肿瘤细 胞凋亡的作用；

(3)本发明提供的甜甙及其类似物还以ERK信号通路为 药物靶点，抑制ERK磷酸化，可通过抑制ERK磷酸化，实现 促进肿瘤细胞凋亡的作用；

(4)本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3、ERK信 号通路靶位点药物在抗肿瘤药物中的应用，肿瘤包括恶性黑色 素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌、淋巴瘤、白血病；

(5)本发明提供的甜甙及其类似物作为STAT3和ERK信 号通路靶点药物在治疗肿瘤中的应用，甜甙及其类似物可制成 各种剂型，并且可以制成保健品和食品，以达到治疗肿瘤的效 果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以 下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1提取的罗汉果甜甙ⅠE1的HPLC图谱；

图2为本发明实施例1提取的罗汉果甜甙ⅡA2的HPLC图谱；

图3为本发明实施例2提取的罗汉果醇的HPLC图谱；

图4为本发明实施例3罗汉果甜甙ⅠE1作用于淋巴瘤U937细 胞后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3 (P-STAT3)表达量变化图；

图5为本发明实施例3罗汉果甜甙ⅡA2作用于黑色素瘤A875 细胞后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3 (P-STAT3)表达量变化图；

图6为本发明实施例3罗汉果甜甙ⅡA2作用于白血病细胞 K562后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3 (P-STAT3)表达量变化图；

图7为本发明实施例3罗汉果醇作用于黑色素瘤A875细胞淋 巴瘤U937细胞后，磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量变化图；

图8为本发明实施例3罗汉果醇作用于黑色素瘤A875细胞淋 巴瘤U937细胞后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)表达量变化图；

图9为本发明实施例4罗汉果甜甙ⅠE1作用于淋巴瘤U937细 胞后，周期调控蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化图；

图10为本发明实施例4罗汉果甜甙ⅡA2作用于黑色素瘤A875 细胞后，周期调控蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化图；

图11为本发明实施例4罗汉果醇作用于白血病细胞K562后， 周期调控蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量变化图；

图12为本发明实施例5不同浓度的罗汉果醇作用于黑色素瘤 A875细胞后，细胞周期变化图；

图13为本发明实施例6罗汉果醇作用于淋巴瘤U937细胞后， 细胞凋亡变化图；

图14为本发明实施例6罗汉果甜甙ⅠE1作用于人黑色素瘤 A875细胞后，细胞凋亡变化图；

图15为本发明实施例6罗汉果甜甙ⅡA2作用于白血病细胞 K562后，细胞凋亡变化图；

图16为本发明实施例6不同浓度的罗汉果甜甙ⅡA2作用于人 黑色素瘤A875细胞后，细胞凋亡变化图；

图17为本发明实施例7不同浓度的罗汉果甜甙ⅡA2作用于人 黑色素瘤A875细胞后，荧光显微镜观察细胞形态变化图；

图18为本发明实施例8不同浓度的罗汉果甜甙ⅠE1作用于淋 巴瘤U937细胞后，细胞生长抑制率柱形图；

图19为本发明实施例8不同浓度的罗汉果醇作用于人黑色素瘤 A875细胞后，细胞生长抑制率柱形图；

图20为本发明实施例8不同浓度的罗汉果甜甙ⅡA2作用于白 血病细胞K562后，细胞生长抑制率柱形图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本 领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视 为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件 或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均 为可以通过市售获得的常规产品。

为了说明甜甙及其类似物的信号通路靶向抑癌效果，以甜甙Ⅰ E1，甜甙ⅡA2为例来说明甜甙的信号通路靶向抑癌效果，以罗汉 果醇为例来说明甜甙类似物靶向抑癌效果。

实施例1

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2的制备

1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水， 在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；

2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性 蛋白，得到澄清的水溶液；

3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇 进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；

4)将所述混合溶液减压浓缩至浸膏状，并回收乙醇，向浸膏中 加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水溶液；

5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收 集下柱液，得到富集液；

6)将所述富集液于60℃减压浓缩至干，并加入乙醇溶解，得 到的混合物用C18反相高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水，按照 20％-75％的梯度洗脱，收集目标物质，挥发溶剂后分别得白色结晶 罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2。

得到的罗汉果甜甙ⅠE1的化学式为C₃₆H₆₂O₉，分子量：638.9， CAS:88901-39-7,甜甙ⅠE1的结构式为：

得到的罗汉果甜甙ⅡA2，CAS88901-45-5，分子式C₄₂H₇₂O₁₄， 分子量801.01。结构式为：

对得到的罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2进行HPLC分析， 得到的图谱如图1和图2所示。从图1和图2可以看出，本发明提 供的甜甙及其类似物的制备方法，得到的罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果 甜甙ⅡA2的纯度均达96％以上。

实施例2

罗汉果醇的制备方法，包括以下步骤：

1)将罗汉果粉碎，按罗汉果与水重量比为1:6-8的比例加入水， 在80～95℃条件下提取2-4次，每次1～2小时，合并提取液；

2)向提取液中加入壳聚糖絮凝，除去提取液中的鞣质和可溶性 蛋白，得到澄清的水溶液；

3)将所述水溶液采用XAD-16树脂进行吸附，用30～50％乙醇 进行洗脱，得到富集罗汉果甜甙的水-乙醇混合溶液；

4)将所述混合溶液减压浓缩，并回收乙醇，浓缩至浸膏状，向 浸膏中加入4-5倍质量的去离子水，稀释浸膏，得到粗品甜甙的水 溶液；

5)将粗品甜甙的水溶液采用DiaionPA树脂进行脱色处理，收 集下柱液，得到富集液；

6)向所述富集液中加入糖苷酶反应，反应温度为45～55℃， 反应时间为6～8h，所述糖苷酶的重量为富集液重量的4％-6％；

7)离心，得到的沉淀即为罗汉果醇粗品，将所述罗汉果醇粗品 水洗3-5次除去水溶杂质，进行冷冻干燥，得到罗汉果醇。

得到的罗汉果醇的分子量为476.7,CAS:88930-15-8，分子式为 C₃₀H₅₂O₄，结构式为

对得到的罗汉果醇进行HPLC分析，得到的图谱如图3所示。 从图3可以看出，本发明提供的罗汉果醇的制备方法，得到的罗汉 果醇的纯度达98％以上。

实施例3

分别将罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对 STAT3、ERK靶位点蛋白的调控通过免疫印迹法进行检测，具体为：

组1：将组织细胞淋巴瘤U937细胞(1x10⁶个/孔)接种于6孔培 养板中过夜，分别加入0和10μmol/L的罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜 甙ⅡA2和罗汉果醇继续培养24h；

组2：将人黑色素瘤A875细胞(1x10⁶个/孔)接种于6孔培养板 中过夜，分别加入0和10μmol/L的罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙Ⅱ A2和罗汉果醇继续培养24h；

组3：将白血病细胞K562(1x10⁶个/孔)接种于6孔培养板中过 夜，分别加入0和10μmol/L的罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2 和罗汉果醇继续培养24h；

终止细胞培养后，吸除培养液，PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗 涤，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液50μl/孔，置冰浴裂解30min， 4℃，14000r/min离心10min，取上清获得总蛋白；

以牛血清白蛋白(BSA)做标准品，测蛋白浓度。取50μg总蛋白， 经12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜(聚偏 二氟乙烯膜)，5％脱脂牛奶(含0.1％Tween20)封闭1h，加抗体 p-STAT3(Tyr705)和p-Erk1/2以及β-actin，一抗4℃孵育过夜(β -actin作为上样量对照)；TBS-T洗膜3次，每次5min；加辣根过氧 化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，用漂洗液(TBS-T)洗 膜3次，每次10min，加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显 影，扫描分析，免疫印迹试验检测的结果如图4-6所示。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对U937细胞处 理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅠE1对U937细胞的作用为例， 具体如图4所示。可以看出甜甙及其类似物作用于U937细胞24h 后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3) 表达量明显下降。此外，还用0、10、150、250μmol/L的甜甙及其 类似物分别对U937细胞处理24h，得知磷酸化的ERK1/2 (P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达量下降的程度 随甜甙及其类似物处理浓度的增加而增加。表明甜甙及其类似物具 有抑制STAT3与ERK蛋白的活化、阻断STAT3、ERK信号通路的 作用。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对黑色素瘤 A875细胞处理后得到的结果一致。罗汉果甜甙ⅡA2对黑色素瘤 A875细胞的作用如图5所示；此外，罗汉果醇对黑色素瘤A875细 胞的作用如图7和图8所示。可以看出甜甙及其类似物作用于黑色 素瘤A875细胞24h后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化 的STAT3(P-STAT3)表达量明显下降。此外，经试验验证，磷酸 化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3)表达 量下降的程度随甜甙及其类似物处理浓度的增加而增加，与U937 细胞结果一致。表明甜甙及其类似物具有抑制STAT3与ERK蛋白 的活化、阻断STAT3、ERK信号通路的作用。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对白血病细胞 K562处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅡA2对白血病细胞 K562的作用为例，具体如图6所示。可以看出甜甙及其类似物作用 于白血病细胞K56224h后，磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷 酸化的STAT3(P-STAT3)表达量明显下降。并且，经试验验证， 磷酸化的ERK1/2(P-ERK1/2)和磷酸化的STAT3(P-STAT3) 表达量下降的程度随甜甙及其类似物处理浓度的增加而增加，与 U937细胞结果一致。表明甜甙及其类似物具有抑制STAT3与ERK 蛋白的活化、阻断STAT3、ERK信号通路的作用。

实施例4

STAT3、ERK信号通路可以调控周期蛋白与凋亡基因，为了验 证罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇的作用，对STAT3、 ERK下游的基因表达情况进行了检测，分别测定了罗汉果甜甙Ⅰ E1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇三种甜甙及其类似物对组织细胞 淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、白血病细胞K562中 Bcl-2和P21蛋白的影响。

甜甙及其类似物对Bcl-2和P21蛋白的调控通过免疫印迹法进 行检测，具体为：分别将组织细胞淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤 A875细胞、白血病细胞K562(1x10⁶个/孔)接种于6孔培养板中过 夜，分别加入0和10μmol/L的甜甙及其类似物继续培养24h。终止 细胞培养后，吸除培养液，PBS(0.01mol/L,pH7.4)洗涤，加入含 蛋白酶抑制剂的细胞裂解液50μL/孔，置冰浴裂解30min，4℃，14 000r/min离心10min，取上清获得总蛋白。

以牛血清白蛋白(BSA)做标准品，测蛋白浓度。取50μg总蛋白， 经12％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜(聚偏 二氟乙烯膜)，5％脱脂牛奶(含0.1％Tween20)封闭1h，加抗体P21、 Bcl-2以及β-actin，一抗4℃孵育过夜(β-actin作为上样量对照)； TBS-T洗膜3次，每次5min；加辣根过氧化物酶(HRP)标记的 二抗，室温孵育1h，用漂洗液(TBS-T)洗膜3次，每次10min， 加入ECL避光孵育5min，荧光影像分析仪显影，扫描分析。免疫 印迹试验检测的结果如图9-11所示。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对U937细胞处 理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅠE1对U937细胞的作用为例， 具体如图9所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于U937细胞24h 后，STAT3信号关联的下游周期调控蛋白P21明显上调，抗凋亡蛋 白Bcl-2明显下调。此外，还用0、10、150、250μmol/L的不同甜甙 及其类似物分别对U937细胞处理24h，得到不同浓度的甜甙及其类 似物作用于U937细胞24h后，甜甙及其类似物均可以剂量依赖性 抑制STAT3的激活，同时上调周期调控基因P21，并抑制抗凋亡蛋 白Bcl-2的表达。P21、Bcl-2蛋白的表达量呈现药物浓度依赖性， 说明甜甙及其类似物通过阻断STAT3、ERK位点，进而调控信号通 路下游周期蛋白和凋亡基因的表达，从而达到抑制癌细胞生长、促 进癌细胞凋亡的作用。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对黑色素瘤 A875细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅡA2对黑色素瘤 A875细胞的作用为例，具体如图10所示。可以看出，甜甙及其类 似物作用于人黑色素瘤A875细胞24h后，STAT3信号关联的下游 周期调控蛋白P21明显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调。此外， 试验证明，不同浓度的甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细 胞24h后，甜甙及其类似物可以剂量依赖性抑制STAT3的激活， 同时上调周期调控基因P21，并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，结果 与U937细胞一致。P21、Bcl-2蛋白的表达量呈现药物浓度依赖性， 说明甜甙及其类似物通过阻断STAT3、ERK位点，进而调控信号通 路下游周期蛋白和凋亡基因的表达，从而达到抑制癌细胞生长、促 进癌细胞凋亡的作用。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对白血病细胞 K562处理后得到的结果一致。以罗汉果醇对白血病细胞K562的作 用为例，具体如图11所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于白血 病细胞K56224h后，STAT3信号关联的下游周期调控蛋白P21明 显上调，抗凋亡蛋白Bcl-2明显下调；并且，试验证明，不同浓度 的甜甙及其类似物作用于白血病细胞K56224h后，甜甙及其类似物 可以剂量依赖性抑制STAT3的激活，同时上调周期调控基因P21， 并抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，结果与U937细胞一致。P21、Bcl-2 蛋白的表达量呈现药物浓度依赖性，说明甜甙及其类似物通过阻断 STAT3、ERK位点，进而调控信号通路下游周期蛋白和凋亡基因的 表达，从而达到抑制癌细胞生长、促进癌细胞凋亡的作用。

Bcl-2为抗凋亡蛋白，能够抑制细胞的程序性凋亡，Bcl-2的过 量表达是导致细胞恶性增殖的重要原因，而Bcl-2又是受STAT3调 控的下游蛋白。经过甜甙及其类似物(罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜 甙ⅡA2和罗汉果醇)处理的U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、 白血病细胞K562的STAT3蛋白磷酸化受到抑制的同时，Bcl-2蛋 白的表达明显下降，Bcl-2蛋白的表达量与STAT3受到的抑制呈现 正相关，这也是促进癌细胞凋亡的重要原因。

实施例5

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对组织细胞淋 巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞、白血病细胞K562的细胞 周期分布的影响

药物对细胞周期阻滞是抑制癌细胞增殖的重要途径。选取对数 生长期的组织细胞淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和白血 病细胞K562，分别用0和10μmol/L的甜甙及其类似物-罗汉果甜甙 ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇培养24h后，用0.25％胰酶消 化，收集用药组和对照组细胞，用PBS洗涤细胞，离心2500rpm， 5min收集细胞，70％冷乙醇固定，4℃过夜，离心去乙醇，加入含 RNaseA的PBS，再加入碘化丙啶(PI)染色混匀(RNaseA，终浓 度为50mg/L，PI终浓度为25mg/L)，37℃避光孵育30min，用流式 细胞仪检测。

STAT3信号通路涉及到细胞周期基因的表达，从而影响细胞周 期进程。罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对U937细 胞处理后得到的结果一致。从流式细胞仪检测结果可以得出，经甜 甙及其类似物处理后，淋巴瘤U937细胞的G0/G1期细胞所占比例 逐渐升高，说明甜甙及其类似物能导致U937细胞发生G0/G1阻滞。

此外，还分别用0、1、10、150、250μmol/L的三种甜甙及其类 似物对U937细胞处理24h，罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和 罗汉果醇对U937细胞处理后得到的结果一致。得到随着甜甙及其 类似物浓度的增加，处于G0/G1期细胞的比例逐渐升高，细胞周期 分布发生明显变化，说明甜甙及其类似物能导致U937细胞发生 G0/G1阻滞，甜甙及其类似物对癌细胞的周期阻滞作用呈现剂量依 赖性。说明甜甙及其类似物可通过抑制STAT3信号通路、调控周期 蛋白，从而诱导肿瘤细胞的细胞周期阻滞来抑制肿瘤生长。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对黑色素瘤 A875细胞处理后得到的结果一致。从流式细胞仪检测结果可以得 出，经甜甙及其类似物处理后，人黑色素瘤A875细胞的G0/G1期 细胞所占比例逐渐升高，说明甜甙及其类似物能导致人黑色素瘤 A875细胞发生G0/G1阻滞。此外，以罗汉果醇对黑色素瘤A875 细胞的作用为例，具体如图12所示。可以看出，随着甜甙及其类似 物浓度的增加，处于G0/G1期细胞的比例逐渐升高，细胞周期分布 发生明显变化，说明甜甙及其类似物能导致人黑色素瘤A875细胞 发生G0/G1阻滞，甜甙及其类似物对癌细胞的周期阻滞作用呈现剂 量依赖性，结果与U937细胞一致。说明甜甙及其类似物可通过抑 制STAT3信号通路、调控周期蛋白，从而诱导肿瘤细胞的细胞周期 阻滞来抑制肿瘤生长。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对白血病细胞 K562处理后得到的结果一致。经甜甙及其类似物处理后，白血病细 胞K562的细胞周期发生阻滞。此外，随着甜甙及其类似物浓度的 增加，细胞阻滞的比例逐渐升高，细胞周期分布发生明显变化，说 明甜甙及其类似物能导致白血病细胞K562发生细胞周期阻滞，甜 甙及其类似物对癌细胞的周期阻滞作用呈现剂量依赖性。说明甜甙 及其类似物可通过抑制STAT3信号通路、调控周期蛋白，从而诱导 肿瘤细胞的细胞周期阻滞来抑制肿瘤生长。

实施例6

选取对数生长期的淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和 白血病细胞K562，分别用0和10μmol/L的甜甙及其类似物-罗汉果 甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇培养24h后，收集细胞， 用冷200μlPBS洗涤细胞两次，收集细胞；加入100μl的结合液 (BindingBuffer)重悬细胞，加入2μl的AnnexinⅤ-FITC混匀 后，避光、室温作用10min，再加入5μl的碘化丙啶(PI)混匀； 避光、室温作用10min，进行流式细胞仪检测，结果如图13-15所 示。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对U937细胞处 理后得到的结果一致。以罗汉果醇为例，结果如图13所示。可以看 出，甜甙及其类似物作用于组织细胞淋巴瘤U937细胞24h，葫芦二 烯醇可诱导组织细胞淋巴瘤U937细胞凋亡。此外，还用0、10、150、 250μmol/L的甜甙及其类似物对U937细胞处理24h，得到随着甜甙 及其类似物浓度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对 淋巴瘤U937细胞的作用呈剂量依赖性。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对人黑色素瘤 A875细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅠE1为例，结果 如图14所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875 细胞24h，甜甙及其类似物可诱导人黑色素瘤A875细胞凋亡。并且 采用不同浓度的甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞，以 罗汉果甜甙ⅡA2为例，结果如图16所示。可以看出，随着甜甙及 其类似物浓度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对人 黑色素瘤A875细胞的作用呈剂量依赖性，结果与淋巴瘤U937细胞 一致。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对白血病细胞 K562处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅡA2为例，结果如图 15所示。可以看出，甜甙及其类似物作用于白血病细胞K56224h， 甜甙及其类似物可诱导白血病细胞K562凋亡。并且采用不同浓度 的甜甙及其类似物作用于白血病细胞K562，随着甜甙及其类似物浓 度的升高，细胞凋亡数目增加，即甜甙及其类似物对白血病细胞 K562的作用呈剂量依赖性，结果与淋巴瘤U937细胞一致。

实施例7

选取对数生长期的淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和 白血病细胞K562，将细胞调至浓度1×10⁴个/ml，转移至六孔板 培养，培养24h后加入药物，使终浓度分别为0、10、100和250 μmol/L，阴性对照组仅加入全培养基，阳性对照组加入罗汉果甜甙 ⅡA2，培养24h后，吸出废液，每孔加入固定液，固定25min，PBS 洗2次，每次洗3min，加入Hoechst33258染液，室温避光染色 30min，使用荧光显微镜观察细胞形态变化。

其中，罗汉果甜甙ⅡA2对A875黑色素瘤细胞荧光显微镜下观 察图如图17所示。图17中，图A为培养液处理组，荧光显微镜下 细胞核完整,着色均匀,荧光成弥散状,比较黯淡；图B、C、D 分别为10、100、250μmo/L处理组细胞,随药物浓度的升高,其染 色质呈浓染的块状或颗粒状荧光，细胞核染色质凝聚,细胞核裂解, 着色不规则,呈现出细胞凋亡的典型变化。

此外，罗汉果甜甙ⅡA2对淋巴瘤U937细胞和白血病细胞K562 的作用效果与对人黑色素瘤A875细胞结果一致。另外，用罗汉果 甜甙ⅠE1和罗汉果醇采用相同的方法分别对人黑色素瘤A875细 胞、淋巴瘤U937细胞和白血病细胞K562处理后，得到的结果与罗 汉果甜甙ⅡA2结果一致。

可以得出，甜甙及其类似物作用于人黑色素瘤A875细胞、淋 巴瘤U937细胞和白血病细胞K56224h后，甜甙及其类似物可诱导 各癌细胞凋亡，并且随着甜甙及其类似物浓度的升高，细胞凋亡数 目增加，即甜甙及其类似物对癌细胞的作用呈剂量依赖性。

实施例8

取对数生长期的淋巴瘤U937细胞、人黑色素瘤A875细胞和白 血病细胞K562，分别调整细胞浓度至2×10⁷/L，以每孔100μl接种 于96孔培养板中，预培养24h后，加入100μl不同浓度培养液配 制的，使每组甜甙及其类似物终浓度分别为0.1、1、10、100、200、 250μmol/L6个剂量，设DMSO培养的细胞作对照组。

分别于24h进行MTT比色实验:每次实验结束前每孔加入浓 度为5mg/mlMTT液15μl，37℃避光培养继续培养4h后，每孔加 DMSO150μl，摇床震荡10min，置于酶标仪490nm检测光密度值 (OD)，按以下公式计算抑制率:细胞生长抑制率＝(对照组OD490- 试验组OD490)/对照组OD490×100％。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对U937细胞处 理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅠE1为例，结果如图18所示。 可以看出，MTT实验结果显示甜甙及其类似物对组织细胞淋巴瘤 U937细胞的增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加或作用时间的 延长，其抑制率也随之增加，表明甜甙及其类似物对U937细胞的 增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方 差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差 异均有显著性意义。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对黑色素瘤 A875细胞处理后得到的结果一致。以罗汉果醇为例，结果如图19 所示。可以看出，MTT实验结果显示甜甙及其类似物对黑色素瘤 A875细胞的增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加或作用时间的 延长，其抑制率也随之增加，表明甜甙及其类似物对黑色素瘤A875 细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经 ANOVA方差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照 组之间的差异均有显著性意义。

罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2和罗汉果醇对白血病细胞 K562处理后得到的结果一致。以罗汉果甜甙ⅡA2为例，结果如图 20所示。可以看出，MTT实验结果显示甜甙及其类似物对白血病 细胞K562的增殖具有抑制作用，随着药物浓度的增加或作用时间 的延长，其抑制率也随之增加，表明甜甙及其类似物对白血病细胞 K562的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经 ANOVA方差分析，不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照 组之间的差异均有显著性意义。

此外，还分别对前列腺癌细胞、肾癌细胞、头颈部鳞状细胞癌 细胞、肺癌细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细 胞、结肠癌细胞进行了实施例3-8的试验，结果均与淋巴瘤U937 细胞的结果一致。

另外，还对甜甙Ⅲ、甜甙Ⅳ、甜甙Ⅴ、甜甙Ⅵ等进行了实施例 2-8的试验，结果均与罗汉果甜甙ⅠE1、罗汉果甜甙ⅡA2一致；此 外分别对前列腺癌细胞、肾癌细胞、头颈部鳞状细胞癌细胞、肺癌 细胞、卵巢癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、结肠癌 细胞进行了实施例3-8的试验，结果均与淋巴瘤U937细胞的结果 一致。

本申请提供的甜甙及其类似物制成保健品和食品，如饼干、口 香糖、饮料、茶、奶糖、奶制品等；对恶性黑色素瘤、前列腺癌、 肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、 结肠癌、淋巴瘤和白血病也具有非常好的抑制效果。

以上实施例说明甜甙及其类似物具有选择性抑制核转录因子 STAT3、ERK信号通路并具有抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，抑 制肿瘤增殖的功效。涉及STAT3信号通路的肿瘤包括实体瘤如：恶 性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、卵巢癌、 乳腺癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌等；非实体瘤如淋巴瘤，白血病如： 大颗粒淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性 白血病等。由于甜甙及其类似物具有抑制STAT3、ERK信号通路的 药用价值，故可以推知对其他涉及STAT3、ERK信号的癌症均具有 抑制作用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到， 在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和 修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的 所有这些变化和修改。