基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法

摘要

本发明涉及一种基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法。首先将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别进行赖氨酸ε‑氨基及N端氨基全部同重标记，分别标记为‑N(C

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质或多肽的定量分析方法，尤其是涉及一种基于轻同位 素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法。

背景技术

近两三年来，商业化的高质量分辨、高质量测量精度质谱仪有了飞跃式发展， 也就是轨道阱质谱仪的出现。轨道阱质谱仪跟傅里叶变换离子回旋共振质谱仪分辨 率和精度相当；但价格相对便宜，质谱采集速度更快、解离效率更高。该质谱仪的 相对普及为分子量相对较大的整体蛋白的质谱及串级质谱分析提供了坚实的基础。 在整体蛋白定量标记方面，基于SILAC的体内标记和基于TMT的体外标记，由于 靶向氨基酸的非完全标记(如重的赖氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非 靶向氨基酸的非选择性标记(如苏氨酸的TMT标记)，其应用范围受到了比较大的 限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)标记由于其试剂易得，标记效 率高，在多肽定量方面已得到了广泛的研究和应用；我国科学家在这个定量技术方 面也做出了巨大的贡献，发展了多种不同形式的二甲基标记；其中中国科学院大连 化学物理研究所张玉奎院士和张丽华研究员课题组发展的N端同重二甲基标记和 复旦大学杨芃原教授和陆豪杰教授课题组发展的赖氨酸残基上的氨基的胍化保护 组合起来可直接应用于蛋白的定量标记，有较好的前景。

然而，上述同重二甲基标记中所使用的重同位素(¹³C和D)试剂都非常昂贵， 如1mL20％¹³C甲醛(H¹³CHO)的价格为4350元(CambridgeIsotopeLab，产 品代码CLM-806-PK)，1g氘代氰基硼氢化钠的价格为2377.25元(Sigma，产品 代码190020-1G)。因此，新型高效但廉价的试剂有着广阔的前景和市场。

申请人前期在整体蛋白质定性定量分析方面已经做了较多的工作，有较好的 基础。

在定量数据挖掘方面，公布号为CN103389335A的中国专利公布了一种鉴定 生物大分子的分析装置和方法。公布号为CN104765984A的中国专利公布了一种 生物质谱数据库快速建立与搜索的方法。公布号为CN104359967A的中国专利公 布了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法。上述专利中公布了同位素轮廓指纹 比对算法(isotopicenvelopefingerprinting，iEF)，直接在原始数据上进行匹配离子 的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节 省相应的时间；根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对 理想及非理想实验数据进行很好的区分，保证蛋白鉴定的可信度；根据已知重叠离 子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法申请人成 功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，在单个标准蛋白(泛素、肌 红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌) 的定性鉴定中，表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面， ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势；一方面基于同位素轮廓及其中每 个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对；另一方 面，搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出，可以用来直 接计算相对定量比。

在定量标记方面，公布号为CN105137088A的中国专利公布了一种整体蛋白 质定量分析方法。公布号为CN105242050A的中国专利公布了一种不同生理或病 理条件下整体蛋白质的定量分析方法，该专利对N端氨基进行同重标记，分别标 记为-N(CH₂D)₂和-N(¹³CH₃)₂。上述两份专利均是基于重同位素的定量标记方法。 由于采用重同位素(¹³C和D)，因此其费用仍然很高。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于轻同位 素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法，包括以下步骤：

(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别 进行赖氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重标记，分别标记为-N(C₅H₁₁O₂CH₂)₂和 -N(C₅H₁₁SCH₂)₂，其单个标记后氨基的质量差异为0.017759Da；

(2)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到 一个数据组；

(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一 个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上 调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。

优选地，步骤(1)中，控制组蛋白或疾病组蛋白，一组蛋白质用氰基硼氢化 钠(NaCNBH₃)和4-(甲氧基甲氧基)丁醛(C₅H₁₁O₂CHO)标记，另一组蛋白质 用氰基硼氢化钠(NaCNBH₃)和5-(甲硫基)戊醛(C₅H₁₁SCHO)标记。

优选地，步骤(1)中进行同重标记的反应过程和条件如下：蛋白溶解在乙酸 钠缓冲溶液后，加入4-(甲氧基甲氧基)丁醛或5-(甲硫基)戊醛，在搅拌条件 下加入氰基硼氢化钠溶液，室温反应1小时后，用氨水淬灭。

优选地，所述的乙酸钠缓冲溶液为100mmol/L，pH为5-6。

优选地，所述的4-(甲氧基甲氧基)丁醛或5-(甲硫基)戊醛溶液质量分数 为4％(w/w)。

优选地，所述的氨水溶液体积分数为4％(v/v)。

步骤(2)所述的等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量 以1:1比例进行混合。

步骤(3)中对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病 组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术，优选使用背景技术 中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，同时也可以使用其他数据库。

本发明涉及的方法同样适用于蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基其他基 于正常轻同位素的全同重化学共价标记以及氨基酸其他特定官能团的基于正常轻 同位素的全同重化学共价标记。

与现有技术相比，本发明的解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计 算含标记基团碎片离子的平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件 下的相对强度。本发明的定量方法对整体蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基 的同重标记和其高分辨串级质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析， 标记效率高，准确度高，适用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。

附图说明

图1、基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法流程图。

图2、蛋白质分子赖氨酸ε-氨基和N端氨基全同重标记示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

一种基于轻同位素近同重标记的整体蛋白质定量分析方法，包括以下步骤：

(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别 进行赖氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重标记，一组用氰基硼氢化钠(NaCNBH₃) 和4-(甲氧基甲氧基)丁醛(C₅H₁₁O₂CHO)，另一组用用氰基硼氢化钠(NaCNBH₃) 和5-(甲硫基)戊醛(C₅H₁₁SCHO)(如图1所示)；也就是分别标记为-N(C₅H₁₁O₂CH₂)₂和-N(C₅H₁₁SCH₂)₂(如图2所示)，其单个标记后氨基的质量差异为0.017759Da， 反应过程和条件如下：蛋白溶解在乙酸钠缓冲溶液(100mM,pH5-6)后，加入刚 刚配制的4％(w/w)的醛溶液；在搅拌条件下加入600mM的新配制的氰基硼氢化 钠溶液。室温反应1小时后，反应用4％(v/v)的氨水淬灭；

(2)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到 一个数据组，等比例混合指：按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比 例进行混合；

(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一 个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上 调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。对数据组进行定性、 定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比 例为本领域的常规技术，优选使用背景技术中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎 ProteinGoggle，同时也可以使用其他数据库。

以上实施例的方法同样适用于蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基其他基 于正常轻同位素的全同重化学共价标记以及氨基酸其他特定官能团的基于正常轻 同位素的全同重化学共价标记。

以上解析方法基于所述质谱的原始二级质谱，通过计算含标记基团碎片离子的 平均相对强度从而计算标记蛋白在不同生理或病理条件下的相对强度。本发明的定 量方法对整体蛋白质序列中赖氨酸ε-氨基及N端氨基的同重标记和其高分辨串级 质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析，标记效率高，准确度高，适 用于整体蛋白质基于高分辨串级质谱的定量分析。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发 明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此 说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限 于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改 进和修改都应该在本发明的保护范围之内。