一种荔枝叶片特性表达基因LcFKBP16-2启动子的功能鉴定及其应用

摘要

本发明公开了一种荔枝叶片特性表达基因LcFKBP16?2启动子的功能鉴定及其应用。本发明提供了一种DNA片段，为如下1)或2)或3)的DNA分子：1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有70％以上相似性，且具有启动子功能的分子。本发明的实验证明，本发明从荔枝中克隆了一种在荔枝叶片特异表达启动，并证明其能驱动目的基因在荔枝中表达，证明其为组织特异性表达的启动子。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种荔枝叶片特性表达基因LcFKBP16-2启动子的功能鉴定及 其应用。

背景技术

荔枝(LitchichinensisSonn.)原产于中国南部和越南北部，是我国热带和亚热带地区重要的特色水果。 在我国，荔枝的栽培面积占果树总面积的6％，是第五大水果。

在生产上，荔枝病虫害危害巨大，严重了影响荔枝的产量、品质以及鲜果的贮运和外销。培育优良的 抗性品种是防治病害的根本途径。而由于内源抗性受多基因控制，通过常规育种的方法不仅周期长，且抗 性与高产负相关，抗性育种难度较大。

20世纪90年代，世界上第一种转基因食品(保鲜延熟型西红柿)在美国上市，正式开启了转基因食品 进入人们生活的时代。通过转基因方法将苏云金芽孢杆菌的Bt蛋白基因导入玉米获得抗病虫品种，为抗 性育种提供了新的思路。但是外源基因的表达可能改变植物自身的代谢，从而带来目前不为人知的潜在风 险，转基因植物的安全性一直是人们关注的焦点。

基因的启动子中包含一系列顺式作用元件，在转录水平上参与基因表达和调控。对启动子的研究有助 于了解基因的表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中以提高或改进外源目的基因的表达。植物组织 特异性启动子是一类能够调控基因在某些特定的器官或组织中表达DNA片段。有研究发现，组织特异性 启动子在植物的器官发育，营养物质的运输，抵抗生物胁迫以及植物与微生物互作等方面发挥重要作用。 随着分子生物学技术的发展，植物基因工程技术由于它具定向改造性状、周期短等特点为荔枝育种提供了 新的途径和思路，另一方面与荔枝经济性状有关的基因正不断地被认识和分离。与果皮组织水分运输相关 的荔枝水孔蛋白基因LcPIP，与胚败育相关的荔枝胚败愈差异表达基因，与花发育相关的荔枝MAD-box 基因，与果实发育相关的荔枝果实成熟诱导基因，与荔枝幼果脱落相关的荔枝ACO基因等，都可通过转 基因方法直接快速且定向地改良不良性状或作为育种新资源。

随着转基因技术育种越来越普遍，食品安全问题也受到了广泛的关注。为了更安全、高效防治病虫害 和提高叶片的光合作用等，将外源基因表达对植物和环境的影响降低到最小，在转基因载体中使用叶片特 异表达基因的启动子代替组成型CaMV35S启动子驱动目的基因的表达，不仅可以改良叶片的某些性状(抗 性、颜色、光合特性等)，而且可以将外源基因表达带来的潜在的食品安全风险降到最低。

发明内容

本发明的目的是提供一种荔枝叶片特异性表达启动子，该启动子具有在荔枝的叶中有很强的表达活 性，而在果肉中低表达。

本发明所提供的启动子，来源于无患子科荔枝(L.chinensisSonn)妃子笑品种，可以是下述核苷酸序 列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有70％以上相似性且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中序列1是由1560个脱氧核苷酸组成。

含有本发明启动子的重组载体、含有载体的宿主菌株、表达盒、转基因细胞系或者转基因植株均属于 本发明的保护范围。

本发明通过实时荧光定量PCR技术进行分析，发现LcFKBP16-2基因在荔枝叶片中特异性高表达，克隆 该基因的启动子，其序列如序列表中序列1所示。

为了验证本发明的启动子功能，构建了GUS融合表达载体，并对本发明的启动子进行瞬时转染转基因 分析，确定该启动子为叶片特异性表达启动子。

本发明的启动子具有叶片特异性高表达，果肉低表达的特性，可应用于转基因育种领域。通过构建含 有该启动的植物表达载体，转化到植物，例如双子叶植物荔枝等的基因组中，驱动目的基因在植物叶片中 特异性高表达，可用于培育新的育种材料。

附图说明

图1LcFKBP16-2基因在荔枝不同组织中的定量PCR表达；

图2LcFKBP16-2基因启动子表达载体图示；

图3pCAMBIA1304-LcFKBP16-2-LcTPL表达载体在荔枝不同组织的表达活性。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1.荔枝叶片特异性表达基因LcFKBP16-2启动子序列的获得

摘取结果母枝中部无病虫害的成熟功能叶片和刚刚开放的花朵，3h内运回实验室，无菌水清洗干净， 吸干多余水分，液氮速冻，-76℃超低温冰箱保存备用。采摘八成熟“妃子笑”果实且3h内运回实验室， 挑选无病虫害的健康果实，灭菌水冲洗数次，吸干多余水分，剥取果皮、种子和果肉，液氮速冻，-76℃超 低温冰箱保存备用。“妃子笑”成熟种子在育苗塞中培育出健康幼苗，3个月后，取根，无菌水冲洗干净,吸 干多余水分，液氮速冻，-76℃超低温冰箱保存备用。以上材料用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒提 取总RNA。

用寡聚dT引物将mRNA逆转录成cDNA，具体操作如下：30.5μL总RNA，12μL5×逆转录缓冲液， 10μL2.5mmol/LdNTPs，6μL0.1mmol/LDTT，1μL0.1mmol/LOligo(dT)₁₅，0.5μLRNase，1μLMMLV逆转 录酶，体系轻柔混匀，简短离心，在42保温1小时。

从前期荔枝各个组织(根、叶、花、果皮、果肉、果核)转录组数据分析表明，荔枝LcFKBP16-2基因 在叶中有很强的表达活性，而在果肉中表达量很低。根据荔枝转录组拼接的序列和基因组的序列设计针对 LcFKBP16-2基因的特异引物(LcFKBP16-2-F/R)。其序列为LcFKBP16-2-F： AACTGCAGAAAATCGTAATAATGAAAATGAAGT(下划线为PstI酶切位点)；LcFKBP16-2-R： CGGAATTCTTGCTGGGTTGAAGGAAA(下划线为EcoRI酶切位点)。以荔枝品种妃子笑叶片为材料，采用艾德 莱公司的DNA小量提取试剂盒提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测其浓度和纯 度。以其DNA为模板，LcFKBP16-2-F/R为引物进行PCR。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s； 56℃退火30s；72℃延伸2min，循环35次后；72℃延伸8min。琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收目的条 带。PCR回收产物连接PMD18-T载体，转化大肠杆菌感受态。蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆单菌落用于摇 菌，提取质粒。筛选具有扩增目的片段的单克隆，后送北京华大基因工程技术服务有限公司测序。测序获 得LcFKBP16-2基因编码区及上游序列，将所获目的片段序列与前期所获序列比对分析，两条序列碱基组成 一致。选取翻译起始位点上游1560bp作为启动子序列进行研究，其核苷酸序列为序列表中的序列1。

实例2.荔枝LcFKBP16-2基因在不同组织的表达模式调查

由于荔枝actin(肌动蛋白)基因在荔枝各个组织的表达量基本一致，所以检测荔枝基因的相对表达量 一般使用actin作为内参基因，采用如下的引物对各个组织的cDNA进行扩增：Act_F： CAACTGGTATTGTCTTGGATTCTG；Act_R：TCATCAAGGCATCGGTTAGA。采用如下的引物扩增LcFKBP16-2基因的 cDNA：LcFKBP16-2_F：TTCAACCCAGCAATCGTCT；LcFKBP16-2_R：CGGAGCGAGCAAAAGTGA。反应体系如下： 5μL2×SYCRPremixExTaq^TMII，1μLcDNA模板，0.4μL正向引物(LcFKBP16-2_F，10μM)和0.4μL反 向引物(LcFKBP16-2_R，10μM)，0.2μL50×ROXReferenceDyeII，3μLddH₂O。反应条件为：95℃预变性 30s；94℃变性5s；60℃退火34s；循环40次。

定量PCR分析结果表明，LcFKBP16-2基因在荔枝叶片高表达，在其余5个组织中表达量较低，尤其是 在果肉中表达量最低。证实LcFKBP16-2基因的启动子为荔枝叶片特异性表达启动子。

实例3.植物LcFKBP16-2基因启动子表达载体的构建

提取植物表达载体pCAMBIA1304质粒，使用限制性内切酶PstI、SpeI双酶切除去CaMV35S启动子， 切胶回收大片段。将测序正确的LcFKBP16-2基因启动子克隆载体进行PstI、EcoRI双酶切，LcTLP(类甜蛋 白)基因克隆载体进行EcoRI、SpeI双酶切，切胶回收分别获得LcFKBP16-2基因启动子片段和LcTLP基因 片段。然后使用T4连接酶连接LcFKBP16-2基因启动子、LcTLP基因以及去CaMV35S启动子的pCAMBIA1304 基础表达载体。具体连接体系(25μL)为：10×T4DNALigaseBuffer2.5μL，LcFKBP16-2基因启动子DNA 片段(85ng/μL)3.6μL，LcTLP基因DNA片段(58.1ng/μL)1.17μL、去CaMV35S启动子的pCAMBIA1304 质粒载体(98.5ng/μL)0.5μL，T4DNAligase1μL，ddH₂O16.23μL，16℃连接过夜。连接产物转化DH5 α大肠杆菌感受态，涂布在添加50μg/mL卡那霉素的LB筛选平板上，挑取阳性克隆单菌落用于摇菌，提 取质粒，经PCR检测和酶切鉴定后送北京华大基因工程技术服务有限公司测序。测序结果确认不同片段的 插入顺序和插入LcFKBP16-2基因启动子与序列中序列1的序列一致，构建的植物表达载体为 pCAMBIA1304-LcFKBP16-2-LcTLP，载体如附图2所示。

实例4.基因枪转化与GUS基因瞬时表达验证启动子功能

摘取结果母枝中部无病虫害的成熟功能叶片和刚刚开放的花朵，3h内运回实验室，无菌水清洗干净， 吸干多余水分。采摘八成熟“妃子笑”果实且3h内运回实验室，挑选无病虫害的健康果实，0.1％HgCl₂消 毒1min后，灭菌水冲洗数次，晾干后，剥取果皮、种子和果肉。“妃子笑”成熟种子在育苗塞中培育出健 康幼苗，3个月后，取根组织的伸长区、分生区以及根冠，无菌水冲洗干净,吸干多余水分。以上材料立 即用于基因枪转化实验。

微弹载体制备

1)称取10mg钨粉，置于1.5mL的离心管中；

2)加入1mL70％(体积百分浓度)的乙醇溶液，充分涡旋5min，室温静置15min，1500rpm离心5 min；

3)小心去除上清液，加入1mL无菌水，充分涡旋5min，室温静置15min，1500rpm离心5min；用 无菌水重复冲洗三次。

4)去除上清液，加入50％(体积百分浓度)的无菌甘油，使钨粉的终浓度为60mg/mL；

5)取50μL上述制备好并以充分涡旋的钨粉转入另一无菌的1.5mL离心管中；

6)按顺序加入5μL质粒(pCAMBIA1304-LcFKBP16-2-LcTLP)、50μL2.5M无菌CaCl₂溶液和20μL 0.1M的亚精胺(现配现用，过滤除菌)；

7)将混合物充分涡旋10min，室温静置15min，12000rpm离心3min；

8)弃上清，加入140μL的70％(体积百分浓度)的乙醇溶液，涡旋，12000rpm离心30sec；

9)弃上清，加入140μL的100％的乙醇，涡旋，12000rpm离心30sec；

10)弃上清，加入48μL的100％的乙醇，重新悬浮颗粒，并将离心管浸入超声波清洗器中3sec，分 散颗粒，每枪上样10μL，每次上样可轰击3次。

转化受体材料

1)打开超净工作台灭菌，灭菌后打开通风开关；

2)用75％(体积百分浓度)的乙醇溶液对基因枪进行消毒，可破圆片和阻挡网于121℃高压灭菌20 min；

3)连接基因枪和高压氦气瓶，用无菌镊子将可裂圆片和阻挡网安装好，并旋紧；

4)取10μL包被DNA的钨粉颗粒无水乙醇悬浮液，均匀涂布于弹夹中；

5)将载有微弹的弹夹装入微弹发射装置中；

6)把氦气压力调到1100千帕高压，按下扳机轰击受体材料

7)取出可列圆片和阻挡网，更换弹夹，重复4～6步骤，轰击转化其他受体材料；

8)分别以pCAMBIA1304质粒为阳性对照，钨粉为阴性对照，pCAMBIA1304-LcFKBP16-2-LcTLP质粒轰 击上述荔枝不同组织材料。将轰击过的荔枝材料置于28℃暗培养24h。

GUS组织化学染色

1)将转化培养后的受体材料，用无菌水清洗样品数次，用滤纸将样品表面水吸干；

2)将荔枝果皮剥出，并用无菌手术刀将基因枪轰击的果皮、种子和叶片，切成小块；

3)将切好的样品转至10mL的无菌离心管中，每管中加入5mL的固定液(组份：1％(体积百分浓度) 甲醛，0.05M磷酸钠缓冲液，0.05％(质量百分浓度)Triton-100)，放到摇床上200rpm温和摇动30min；

4)将固定液去除，用0.05M磷酸钠缓冲液洗涤样品三次，每次于200rpm温和摇动10min；去除用 过的缓冲液；

5)每管中加入600μL的现配制的GUS染色液(配方：50mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.1M铁氰化钾， 0.1M亚铁氰化钾，10mMEDTA，0.1％Triton-100，20％甲醛，0.5mMX-gluc)浸没转化材料，于37℃水 浴保温1h；

6)取出材料，用75％的乙醇漂洗20min；

7)先后用20％乙醇、50％乙醇各浸泡20min；

8)在显微镜下观察转化材料的GUS的染色结果并拍照。

分析染色结果发现，pCAMBIA1304质粒(阳性对照)在所有组织中均出现了蓝色斑点，表明CaMV35S 启动子能调控pCAMBIA1304质粒中的GUS基因表达。钨粉(阴性对照)轰击在所有材料中均未出现蓝 色斑点，表明钨粉轰击不会导致荔枝组织出现蓝色斑点，使实验结果出现假阳性。构建的植物表达载体 pCAMBIA1304-FKBP16-2-LcTLP在叶片中表达强烈，同时在根、花、果皮和种子中均有微弱表达，但在 果肉中没有出现，说明构建的植物表达载体pCAMBIA1304-FKBP16-2-LcTLP能调控GUS基因在荔枝的叶 片中特异性高表达，但不能调控其在果肉中表达。