从卵清蛋白中制备N-连接聚糖的高效分离制备及聚糖

摘要

本发明提供了一种卵清蛋白N-连接聚糖组分的高效分离制备方法，其主要的成分是只有一个氨基酸即天冬酰胺(Asn)连接的N-连接聚糖组分，工艺过程为将卵清蛋白用非特异性蛋白酶酶解后，离心浓缩，浓缩液用一维色谱柱去除卵清蛋白酶解后的多肽及残余蛋白，收集目标馏分。将收集到的馏分离心浓缩，将浓缩液通过二维色谱柱，除去馏分中的盐、2-4个氨基酸连接的N-连接聚糖组分以及小分子氨基酸，得到只有天冬酰胺连接的N-连接聚糖组分。本发明制备的Asn连接的N-连接聚糖组分，通过高分辨质谱鉴定，N-连接聚糖组分明确，提取分离工艺过程重复性高、可操作性好，适用于从卵清蛋白中大规模分离制备N-连接聚糖组分。

说明书

技术领域

本发明涉及从蛋白中分离制备N-连接聚糖组分的提取分离制备，具体的说是从卵清蛋白中酶解分离制备得到带有一个天冬酰胺(Asn)的N-连接聚糖组分，该组分中的聚糖为5-15个甘露糖、半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺组成，分子量在1000-3000。

背景技术

糖蛋白广泛存在于动物、植物、微生物及病毒中，是糖链以共价键的方式与蛋白质结合而形成的复合物。蛋白质糖基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，在真核生物，尤其是哺乳动物中约有一半以上的蛋白质是被糖基化的，膜蛋白则几乎100％是以糖基化的形式而存在(ApweilerR,HermjakobH,SharonN,Onthefrequencyofproteinglycosylation,asdeducedfromanalysisoftheSWISS-PROTdatabase.BiochimBiophysActa-GenSubj,1999,1473,4-8)。糖基化作为一种主要的蛋白质翻译后修饰形式，对蛋白质的结构和功能有着重要影响，如蛋白质的折叠、运输以及定位等。已知在细胞膜表面存在大量的糖蛋白，糖蛋白的糖链在细胞间的识别、黏附、通信联络以及免疫应答等方面均起着重要作用。除此之外，蛋白质糖基化的异常与肿瘤、发育、免疫异常以及感染等疾病的发生发展和诊断治疗也有密切关系。目前，已知肿瘤、类风湿等疾病会引起糖链结构的异常改变，因此，糖链被认为是一种潜在的疾病标志物和新疫苗的靶点(OhtsuboK,MarthJD,Glycosylationincellularmechanismsofhealthanddisease.Cell2006,126,855-867；KimEH,MisekDE,Glycoproteomicsbasedidentificationofcancerbiomarkers.InternationaljournalofProteomics,2011,2011,1-10.)。由于糖肽部分在酶解后肽段中所占比例非常小，(约2-5％)，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽抑制。另外，由于糖链的微观不均一性，一个糖基化位点上的糖链类型可能多达几十种，进一步降低了糖链的相对量而使得它们很难被检测到，这些使得糖链的分离制备变得异常艰难。尽管糖链不容易得到，但是去除了蛋白质中非糖肽、磷酸化肽及其它肽段的影响，在高纯度糖链基础上，研究糖链的结构信息，发现一些潜在的诊断标志物和治疗靶点将会变得简便、直接，更容易获得准确的结果，因此对于糖链的分离制备迫切需求一种高效、高通量的分离制备方法。

酶法释放糖蛋白糖链因方法简单、条件温和、能够提供有关糖链残基组成、排列顺序和糖苷键的构型等信息，目前应用较广。较常用的释放N-糖链的特异蛋白酶有N-糖肽酶F(PNGaseF)，经PNGaseF酶解能够得到完整的N-糖链，但由于糖链本身没有发色基团，不能直接用HPLC及LC-MS等进行分析，因此需要通过柱前衍生法使糖链带上紫外或荧光基团。但是衍生后的糖链会形成还原端开环结构，导致糖链的部分生物信息丢失，同时对糖链的一些活性造成影响。

链酶蛋白酶E(PronaseE)是一种非特异性蛋白酶，可随机作用于多肽上的不同位点，非特异性地将糖蛋白上结合的肽段酶切成短肽或者氨基酸，从而得到带短肽或氨基酸的糖。Lebrilla等人利用PronaseE对卵清蛋白进行酶解，得到1个到5个氨基酸的糖肽(AnHJ,PeavyTR,HedrickJL,LebrillaCB,DeterminationofN-glycosylationsitesandsiteheterogeneityinglycoproteins.AnalyticalChemistry2003,75,5628-5637)，在此基础上，通过优化酶解底物与酶的量，以及酶解时间，可以得到只带Asn的糖链。糖链上增加了一个Asn后，对于紫外和质谱的响应都有很大程度的提高，同时对糖链上Asn的氨基进行衍生，可以直接应用到糖芯片的研究中，保持了糖链的完整性。

到目前为止，虽然对糖蛋白糖链的释放、结构表征的研究很多，但是对于从酶解液中将Asn连接的糖链富集分离出来，并通过二维液相色谱分离制备得到纯度较高的Asn糖链组分，还未见报道。

发明内容

本发明提供了一种利用二维液相色谱从卵清蛋白中高效分离制备N-连接聚糖组分的方法，其主要的成分是只有一个氨基酸即天冬酰胺(Asn)连接的N-连接聚糖组分，其中N-连接聚糖是以两个N-乙酰葡萄糖胺和3个甘露糖组成的五糖核心基础上，再连接0-15个甘露糖、半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1)蛋白变性：称取卵清蛋白样品，加入一定量尿素的缓冲溶液，室温温育1-5小时，缓冲溶液的pH值为7-9。反应后加入一定量的二硫苏糖醇，35-40℃温育1-5小时，还原卵清蛋白的二硫键，然后加入一定量的碘代乙酸，避光条件下室温温育10-60分钟，将还原后的二硫键进行烷基化，得到变性蛋白。

缓冲溶液中尿素的浓度为4-10M；所使用的缓冲溶液为碳酸氢铵缓冲溶液，浓度为30-80mM；缓冲溶液中加入的蛋白与尿素的质量比为1:1-1:36。二硫苏糖醇的浓度为30-100mM，蛋白与二硫苏糖醇的质量比为16:1-162:1；碘代乙酸的浓度为30-100mM，蛋白与碘代乙酸的质量比为18:1-270:1。

2)酶解：将步骤(1)得到的变性蛋白加入到3-10倍体积的非特异性酶缓冲溶液中，酶解缓冲溶液的pH值为4-7，酶解时间为12-72小时，酶解反应温度为35-40℃。

酶解后，酶解液需要在沸水中煮5-10分钟使酶失活；酶解后可以对产物进行离心浓缩，得到酶解浓缩液后进行下一步反应。

所述非特异性酶是链霉蛋白酶PronaseE，缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液，浓度为0.05-5M；pH值为4-7；缓冲溶液使用量体积为变性蛋白溶液体积的3-10倍；酶和初始卵清蛋白的质量比为0.5:1-10:1。

3)酶解反应产物进行新型硅胶基质键合材料的二维液相色谱分离制备：以粒径2-20微米的新型硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的乙腈/水或甲醇/水作为洗脱液，以紫外为检测器，检测波长为190-280nm，收集目标洗脱组分为一维组分，再以粒径为2-20微米的新型硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的乙腈/水作为洗脱液，紫外检测器检测波长为190-280nm，收集目标洗脱组分为二维组分，离心浓缩、真空干燥后即为天冬酰胺(Asn)连接的N-连接聚糖组分，制备后得到的聚糖组分采用质谱分析鉴定。

二维液相色谱分离制备中，一维色谱柱所用的新型硅胶基质键合材料为C18为基质的极性共聚反相填料，如编号为C18-RP1或C18-RP2；二维色谱柱所用的新型硅胶基质键合材料为以C18为基质的极性共聚亲水填料，如编号为C18-HILIC1或C18-HILIC2。

所述的二维液相色谱分离制备中一维制备采用的色谱柱填料为新型硅胶基质键合材料，粒度为5-10微米，一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈(甲醇或乙腈为有机相，其中不含有或含有0.1wt％甲酸)与水(水相中不含有或含有0.1wt％甲酸)混合，洗脱条件按照有机相5－20％等度或5－50分钟有机相由5％提高到30％梯度进行；柱温为25-40℃，洗脱液流速为0.2-1.0mL/min，收集保留时间为0-10min的组分；二维制备采用的硅胶基质键合材料的粒度为3-5微米，采用的流动相为乙腈(有机相)与水(水相)混合，洗脱条件按水相10－50％V/V等度或经5－30分钟水相由10-15％提高到30-60％梯度进行，柱温为25-40℃，洗脱液流速为0.2-1.0mL/min，收集保留时间为5-25的组分。

一维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1wt％甲酸的乙腈)与水(或含0.1wt％甲酸的水)，采用等度方式，乙腈体积比例为5％-15％；二维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1wt％甲酸的乙腈)与水(或含0.1wt％甲酸的水)，采用梯度条件，水(或含0.1wt％甲酸)体积浓度为15％经15－20分钟增加到30％－40％。

最终得到的N-连接聚糖为天冬酰胺(Asn)连接的N-连接聚糖，为高甘露糖型，含有5-15个甘露糖、半乳糖或N-乙酰葡萄糖胺，分子量为1000-3000，聚糖组分中聚糖个数为5-25个。

本发明的优点

1.利用非特异性蛋白酶解，从卵清蛋白中得到带有一个氨基酸Asn连接的N-连接聚糖组分。

2.采用二维液相色谱富集分离方法，具有分离制备的正交性而达到互补分离，因此得到的Asn连接的N-连接聚糖组分纯度高，可以达到80％以上。

3.本发明所涉及的制备高纯度Asn连接的N-连接聚糖的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模制备的需要。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1：

称取卵清蛋白1mg，加入150μL的4M尿素的30mM碳酸氢铵缓冲溶液中，20℃温育1小时，缓冲溶液的pH为7。变性后的卵清蛋白加入10μL的40mM二硫苏糖醇，35℃温育1小时，还原变性后卵清蛋白的二硫键，然后加入10μL的30mM的碘代乙酸，避光条件下30℃温育10分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的卵清蛋白加入510μL的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为0.05M；加入0.5mg的PronaseE，酶解缓冲溶液的pH值为4，酶解反应温度为35℃，酶解时间为12小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。离心浓缩酶解液，得到酶解浓缩液。

用粒径2微米的C18极性共聚反相填料C18-RP1装柱，柱径3mm，柱长250mm，流动相选择甲醇为有机相，水为水相，采用5％有机相等度洗脱，柱温25℃，流动相流速为0.2mL/min，280nm紫外检测，收集0-10分钟的洗脱组分，离心浓缩为一维组分。用粒径2微米的C18极性共聚亲水填料C18-HILIC2装柱，柱径3mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相采用乙腈(含0.1％甲酸)为有机相，水(含0.1％甲酸)为水相，采用50％有机相等度洗脱，柱温35℃，流动相流速为0.3mL/min，190nm紫外检测，收集5-10分钟洗脱组分，离心浓缩，冻干后即为Asn连接的N-聚糖组分，经质谱分析鉴定，聚糖个数为5个，纯度80％。

实施例2：

称取卵清蛋白10mg，加入105μL的8M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，30℃温育5小时，缓冲溶液的pH为9。变性后的卵清蛋白加入40μL的30mM二硫苏糖醇，40℃温育2小时，还原变性后卵清蛋白的二硫键，然后加入20μL的50mM的碘代乙酸，避光条件下25℃温育30分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的卵清蛋白加入1000μL的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为0.5M，加入100mg的PronaseE，酶解缓冲溶液的pH值为6.8，酶解反应温度为40℃，酶解时间为24小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮10分钟使酶失活。离心浓缩酶解液，得到酶解浓缩液。

用粒径20微米的C18极性共聚反相填料C18-RP1装柱，柱径4.6mm，柱长150mm，流动相选择甲醇(含0.1％甲酸)为有机相，水(含0.1％甲酸)为水相，采用梯度洗脱方式：有机相浓度由5％经50分钟提高到30％，柱温40℃，流动相流速为1.0mL/min，280nm紫外检测，收集0-5分钟的洗脱组分，离心浓缩为一维组分。用粒径20微米的C18极性共聚亲水填料C18-HILIC1装柱，柱径4.6mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈(含0.1％甲酸)为有机相，水(含0.1％甲酸)为水相，采用90％有机相等度洗脱，柱温40℃，流动相流速为0.7mL/min，190nm紫外检测，收集20-25分钟洗脱组分，离心浓缩，冻干后即为Asn连接的N-聚糖组分，经质谱分析鉴定，聚糖个数为15个，纯度50％。

实施例3：

称取卵清蛋白50mg，加入200μL的10M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，25℃温育2小时，缓冲溶液的pH为7。变性后的卵清蛋白加入20μL的100mM二硫苏糖醇，37℃温育5小时，还原变性后卵清蛋白的二硫键，然后加入50μL的100mM的碘代乙酸，避光条件下30℃温育20分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的卵清蛋白加入1500μL的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为5M加入250mg的PronaseE，酶解缓冲溶液的pH值为6.5，酶解反应温度为37℃，酶解时间为72小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。离心浓缩酶解液，得到酶解浓缩液。

用粒径5微米的C18极性共聚反相填料C18-RP2装柱，柱径4.6mm，柱长250mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用20％有机相等度洗脱，柱温35℃，流动相流速为0.7mL/min，280nm紫外检测，收集0-10分钟的洗脱组分，离心浓缩为一维组分。用粒径5微米的C18极性共聚亲水填料C18-HILIC1装柱，柱径4.6mm，柱长250mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用梯度洗脱方式：水相浓度由10％经30分钟提高到60％，柱温25℃，流动相流速为1.0mL/min，190nm紫外检测，收集10-15分钟洗脱组分，离心浓缩，冻干后即为Asn连接的N-聚糖组分，经质谱分析鉴定，聚糖个数为25个，纯度85％。

实施例4：

称取卵清蛋白250mg，加入830μL的5M尿素的50mM碳酸氢铵缓冲溶液中，25℃温育2小时，缓冲溶液的pH为8。变性后的卵清蛋白加入200μL的100mM二硫苏糖醇，35℃温育1小时，还原变性后卵清蛋白的二硫键，然后加入50μL的100mM的碘代乙酸，避光条件下25℃温浴10分钟，将还原后的二硫键进行烷基化。

将变性后的卵清蛋白加入10800μL的Tris-HCl缓冲溶液，浓度为0.1M加入800mg的PronaseE，酶解缓冲溶液的pH值为7，酶解反应温度为37℃，酶解时间为48小时，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分钟使酶失活。离心浓缩酶解液，得到酶解浓缩液。

用粒径5微米的C18极性共聚反相填料C18-RP2装柱，柱径2.1mm，柱长150mm，流动相选择乙腈(含0.1％甲酸)为有机相，水(含0.1％甲酸)为水相，采用5％有机相等度洗脱，柱温30℃，流动相流速为0.2mL/min，溶液洗脱，280nm紫外检测，收集0-6分钟的洗脱组分，离心浓缩为一维组分。用粒径3微米的C18极性共聚亲水填料C18-HILIC2装柱，柱径2.1mm，柱长150mm作为二维分离色谱柱，流动相选择乙腈(含0.1％甲酸)为有机相，水(含0.1％甲酸)为水相，采用梯度洗脱方式：水相浓度由15％经30分钟提高到40％，柱温30℃，流动相流速为0.2mL/min，190nm紫外检测，收集15-20分钟洗脱组分，离心浓缩，冻干后即为Asn连接的N-聚糖组分，经质谱分析鉴定，聚糖个数为20个，纯度90％。