一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法

摘要

本发明涉及一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法，利用本发明中提供的种子培养基、发酵培养基配方和控制工艺，能够提高林可霉素大生产发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现林可霉素高效的生产。

说明书

技术领域

本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基和培养方法。

背景技术

林可霉素又称林肯霉素、洁霉素，是由林可链霉菌通过好氧发酵产生的一种广谱抗生素，属于林克胺类素。作用于敏感菌核糖体的50S亚基，阻止肽链的延长，从而抑制细菌细胞的蛋白质合成，对多数革兰阳性菌有较强抗菌活性，尤其对金葡菌和肺炎链球菌等敏感，由于其组织渗透性好，耐药性发展缓慢，对呼吸系统、骨骼和软骨组织的感染有较好疗效，而且毒性较低，是临床中一种重要的抗生素。

国内采用三级发酵模式生产林可霉素摇，其存在的主要问题：

1培养基加入了葡萄糖，部分葡萄糖在高温灭菌的条件下容易碳化，培养基溶液颜色变深，降低了培养质量。

2国内相关文献报道了林可霉素种子培养基、发酵培养基配方和培养工艺的部分内容，但不能实现工业化大生产。

3国内部分林可霉素发酵生产工艺中加入氨基酸，影响了发酵液质量，不利于脱色处理。

4国内林可霉素生产效价一般维持在9000u/ml左右，效价较低。

5林可霉素发酵培养的周期较长，一般在160h左右。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种林可霉素发酵培养基配方，有效提高林可霉素发酵质量和大生产发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对培养基的影响，缩短发酵周期，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现林可霉素工业化大生产，提高产品市场竞争力。

本发明的另一目的是提供一种林可霉素发酵生产的培养方法。

为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种林可链霉菌发酵生产林可霉素的培养基，包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其特征在于所述

一级种子培养基组成为：

小麦麸皮14-18g/L、麦芽糖6-10g/L、蚯蚓粉3-7g/L、丝素粉4-8g/L、玉米浆7-12ml/L、生物素0.08-0.12g/L、尿素0.04-0.8g/L、轻质碳酸钙1-5g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L；

二级种子培养基组成为：

小麦麸皮20-24g/L、麦芽糖9-13g/L、蚯蚓粉6-10g/L、丝素粉8-12g/L、干酪素7-11g/L、玉米浆10-14ml/L、生物素0.1-0.14g/L、尿素0.07-0.11g/L、轻质碳酸钙2-6g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L；

发酵培养基组成为：

小麦麸皮20-24g/L、麦芽糖9-13g/L、蚯蚓粉6-10g/L、丝素粉8-12g/L干酪素7-11g/L、玉米浆10-14ml/L、生物素0.1-0.14g/L、尿素0.07-0.11g/L、轻质碳酸钙2-6g/L、麦芽糖酶0.001-0.005g/L、硫酸锌0.09-0.13g/L、硫酸镁0.02-0.06g/L、TritonX-100（聚乙二醇辛基苯基醚）0.003-0.007g/L、磷酸二氢钾0.008-0.012g/L。

一种利用上述培养基生产林可霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：

1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌，冷却，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液接入一级种子罐进行培养，接种量控制在1.6L-2L/m³；至菌体浓度20-25%、pH值7.5-8.5、培养时间30-35h时移种；

2）二级种子培养：先将二级种子培养基灭菌，冷却至25-30℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9-11%。温度控制在29-30℃，至菌体浓度30-35%、pH值7.5-8.5、培养时间17-21h时移种；

3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20-25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9-11%。至菌体浓度35-40%、化学效价＞11000u/mL、pH：7.6-8.0、培养时间145-150h时终止发酵。

所述培养好的母瓶发酵液质量要求为：菌体浓度20-30%；镜检无杂菌；摇瓶发酵单位4500u/ml以上。

所述一级种子培养条件为：罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：50-60m³/h；搅拌转速50-60r/min。

所述二级种子培养条件为：罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，40-50m³/h；11h-移种：50-60m³/h；搅拌转速70-80r/min。

所述发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7-8；

b培养温度29-30℃；

c搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；

d压力控制：罐压0.05-0.06MPa；

epH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；

f空气流量：0-60h：150-200m³/h；61-120h：250-300m³/h；121h-发酵结束：100-150m³/h；

h溶氧控制：

发酵前20h内，不控制溶氧，

21-60h，溶氧控制在60%以上，

61-120h，溶氧控制在20%以上，

121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。

在发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补氨水、补水、补糖和pH控制，其中

a补氨水工艺控制，氨水的浓度控制在15-20%，

发酵前79h不用进行补氨水，

发酵时间在80-120h补入氨水溶液，要求培养基中的铵离子浓度控制在0.25-0.3%；

b补水工艺控制：

发酵前59h不用进行补水，

发酵时间在60-100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40-45%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度，

发酵时间在101h-发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35-40%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度；

c发酵过程pH控制工艺：

发酵前59h，pH不进行控制，

发酵时间在60h-发酵结束，若pH＜7.5，加入10-20%的氢氧化钠，调节pH至7.8-8.0；若pH＞8.0，加入30-40%的硫酸铵溶液，调节pH至7.5-8.5；

d补入质量体积浓度为80-90%的麦芽糖溶液，

发酵前59h，还原糖含量不进行控制，

发酵60h至120h：还原糖含量＜3%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3-4%，

发酵121h至发酵结束：还原糖含量＜1%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5-1%。

在上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其质量体积浓度控制在0.001-0.003%。

本发明的技术优势：

1本发明确认了林可霉素培养基中的最佳碳源、氮源和配伍比例。

2培养基中分别采用麸皮和麦芽糖代替淀粉和葡萄糖，降低了培养基的粘度，避免了葡萄糖效应，提高了发酵液培养质量。

3摇瓶种子培养基中加入了丝素粉和干酪素，保证了摇瓶种子培养所需各种氨基酸，有利于提高林可霉素摇甁种子液质量。

4本发明对林可霉素发酵生产工艺进行了详细的阐述，确认了林可霉素最佳的培养工艺和控制参数。

5利用本发明提供的生产发酵工艺，经三级发酵后，林可霉素的发酵单位（发酵液体积达到100m）达到11000u/ml以上，发酵周期控制150h以内，达到国内先进水平。

6本发明适用于规模化发酵生产林可霉素，能够满足年产2000吨林可霉素的生产需求。

具体实施方法

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

实施例中母瓶发酵液质量：菌体浓度20-30%；镜检无杂菌；摇瓶发酵单位4500u/ml以上。

实施例1

一级种子培养：培养基体积为1m³。

一级种子培养基组：

小麦麸皮14kg、麦芽糖6kg、蚯蚓粉3kg、丝素粉4kg、玉米浆7L、生物素0.08kg、尿素0.04kg、轻质碳酸钙1kg、麦芽糖酶0.001kg。

首先将一级种子培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.6L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：50m³/h；搅拌转速50r/min。一级种子培养结束，菌体浓度20%、pH值7.5、培养时间30h时移种。

二级种子培养：培养基体积为10m³。

小麦麸皮200kg、麦芽糖90kg、蚯蚓粉60kg、丝素粉80kg、干酪素70kg、玉米浆100L、生物素1kg、尿素0.7kg、轻质碳酸钙20kg、麦芽糖酶0.01kg。

先将二级种子培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，40m³/h；11h-移种：50m³/h；搅拌转速70r/min。二级种子培养结束，菌体浓度30%、pH值7.5、培养时间17h。

发酵培养基：培养基的体积为100m³。

小麦麸皮2000kg、麦芽糖900kg、蚯蚓粉600kg、丝素粉800kg、干酪素700kg、玉米浆1000L、生物素10kg、尿素7kg、轻质碳酸200kg、麦芽糖酶0.1kg、硫酸锌9kg、硫酸镁2kg、TritonX-1000.3kg、磷酸二氢钾0.8kg。

发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至20℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9%。

发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.1；

b培养温度32-33℃；

c搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；

d压力控制：罐压0.05-0.06MPa；

epH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；

f空气流量：0-60h：150m³/h；61-120h：250m³/h；121h-发酵结束：100m³/h；

h溶氧控制：

发酵前20h内，不控制溶氧；

21-60h，溶氧控制在60%以上；

61-120h，溶氧控制在20%以上；

121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。

发酵培养结束，菌体浓度35%、化学效价11081u/mL、pH：7.6、培养时间145h。

实施例2

一级种子培养：培养基体积为1m³。

一级种子培养基组：

小麦麸皮15kg、麦芽糖7kg、蚯蚓粉4kg、丝素粉5kg、玉米浆8L、生物素0.09kg、尿素0.05kg、轻质碳酸钙2kg、麦芽糖酶0.002kg。

首先将一级种子培养基灭菌，冷却至27℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.7L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：52m³/h；搅拌转速53r/min。一级种子培养结束，菌体浓度22%、pH值7.8、培养时间32h时移种。

二级种子培养：培养基体积为10m³。

小麦麸皮210kg、麦芽糖100kg、蚯蚓粉70kg、丝素粉90kg、干酪素80kg、玉米浆110L、生物素1.1kg、尿素0.8kg、轻质碳酸钙30kg、麦芽糖酶0.02kg。

先将二级种子培养基灭菌，冷却至26℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在9.5%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，43m³/h；11h-移种：52m³/h；搅拌转速73r/min。二级种子培养结束，菌体浓度31%、pH值7.7、培养时间18h。

发酵培养基：培养基的体积为100m³。

小麦麸皮2100kg、麦芽糖1000kg、蚯蚓粉700kg、丝素粉900kg、干酪素800kg、玉米浆1100L、生物素11kg、尿素8kg、轻质碳酸300kg、麦芽糖酶0.2kg、硫酸锌10kg、硫酸镁3kg、TritonX-1000.4kg、磷酸二氢钾0.9kg。

发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至22℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在9.5%。

发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.3；

b培养温度29-30℃；

c搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；

d压力控制：罐压0.05-0.06MPa；

epH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；

f空气流量：0-60h：160m³/h；61-120h：270m³/h；121h-发酵结束：120m³/h；

h溶氧控制：

发酵前20h内，不控制溶氧；

21-60h，溶氧控制在60%以上；

61-120h，溶氧控制在20%以上；

121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。

发酵培养结束，菌体浓度36%、化学效价11237u/mL、pH：7.7、培养时间146h。

实施例3

一级种子培养：培养基体积为1m³。

一级种子培养基组：

小麦麸皮16kg、麦芽糖8kg、蚯蚓粉5kg、丝素粉6kg、玉米浆9L、生物素0.1kg、尿素0.06kg、轻质碳酸钙3kg、麦芽糖酶0.003kg。

首先将一级种子培养基灭菌，冷却至28℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.8L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：55m³/h；搅拌转速55r/min。一级种子培养结束，菌体浓度23%、pH值8.0、培养时间33h时移种。

二级种子培养：培养基体积为10m³。

小麦麸皮220kg、麦芽糖110kg、蚯蚓粉80kg、丝素粉100kg、干酪素90kg、玉米浆120L、生物素1.2kg、尿素0.9kg、轻质碳酸钙40kg、麦芽糖酶0.03kg。

先将二级种子培养基灭菌，冷却至27℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在10%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，45m³/h；11h-移种：55m³/h；搅拌转速75r/min。二级种子培养结束，菌体浓度32%、pH值8.0、培养时间19h。

发酵培养基：培养基的体积为100m³。

小麦麸皮2200kg、麦芽糖1100kg、蚯蚓粉800kg、丝素粉1000kg、干酪素900kg、玉米浆1200L、生物素12kg、尿素9kg、轻质碳酸400kg、麦芽糖酶0.3kg、硫酸锌11kg、硫酸镁4kg、TritonX-1000.5kg、磷酸二氢钾1kg。

发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至23℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在10%。

发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.5；

b培养温度29-30℃；

c搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；

d压力控制：罐压0.05-0.06MPa；

epH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；

f空气流量：0-60h：175m³/h；61-120h：280m³/h；121h-发酵结束：130m³/h；

h溶氧控制：

发酵前20h内，不控制溶氧；

21-60h，溶氧控制在60%以上；

61-120h，溶氧控制在20%以上；

121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。

发酵培养结束，菌体浓度38%、化学效价11381u/mL、pH：7.8、培养时间147h。

实施例4

一级种子培养：培养基体积为1m³。

一级种子培养基组：

小麦麸皮17kg、麦芽糖9kg、蚯蚓粉6kg、丝素粉7kg、玉米浆10L、生物素0.11kg、尿素0.07kg、轻质碳酸钙4kg、麦芽糖酶0.004kg。

首先将一级种子培养基灭菌，冷却至29℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液1.9L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：57m³/h；搅拌转速58r/min。一级种子培养结束，菌体浓度24%、pH值8.2、培养时间34h时移种。

二级种子培养：培养基体积为10m³。

小麦麸皮230kg、麦芽糖120kg、蚯蚓粉90kg、丝素粉110kg、干酪素100kg、玉米浆130L、生物素1.3kg、尿素1kg、轻质碳酸钙50kg、麦芽糖酶0.04kg。

先将二级种子培养基灭菌，冷却至28℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在10.5%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，47m³/h；11h-移种：58m³/h；搅拌转速76r/min。二级种子培养结束，菌体浓度33%、pH值8.3、培养时间20h。

发酵培养基：培养基的体积为100m³。

小麦麸皮2300kg、麦芽糖1200kg、蚯蚓粉900kg、丝素粉1100kg、干酪素1000kg、玉米浆1300L、生物素13kg、尿素10kg、轻质碳酸500kg、麦芽糖酶0.4g、硫酸锌12kg、硫酸镁5kg、TritonX-1000.6kg、磷酸二氢钾1.1kg。

发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至24℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在10.5%。

发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在7.8；

b培养温度29-30℃；

c搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；

d压力控制：罐压0.05-0.06MPa；

epH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；

f空气流量：0-60h：190m³/h；61-120h：290m³/h；121h-发酵结束：140m³/h；

h溶氧控制：

发酵前20h内，不控制溶氧；

21-60h，溶氧控制在60%以上；

61-120h，溶氧控制在20%以上；

121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。

发酵培养结束，菌体浓度39%、化学效价11286u/mL、pH：7.9、培养时间149h。

实施例5

一级种子培养：培养基体积为1m³。

一级种子培养基组：

小麦麸皮18kg、麦芽糖10kg、蚯蚓粉7kg、丝素粉8kg、玉米浆11L、生物素0.12kg、尿素0.08kg、轻质碳酸钙5kg、麦芽糖酶0.005kg。

首先将一级种子培养基灭菌，冷却至30℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的林可链霉菌母瓶发酵液2L接入一级种子罐进行培养。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-4h，采用空气搅拌代替机械搅拌；5h-移种：60m³/h；搅拌转速60r/min。一级种子培养结束，菌体浓度25%、pH值8.5、培养时间35h时移种。

二级种子培养：培养基体积为10m³。

小麦麸皮240kg、麦芽糖130kg、蚯蚓粉100kg、丝素粉120kg、干酪素110kg、玉米浆140L、生物素1.4kg、尿素1.1kg、轻质碳酸钙60kg、麦芽糖酶0.05kg。

先将二级种子培养基灭菌，冷却至30℃，并用无菌空气保压，将培养好的一级种子液移入二级种子培养基中进行二级种子培养，移种比例控制在11%。罐压0.03-0.05MPa；罐温29-30℃；空气流量：0-10h，50m³/h；11h-移种：60m³/h；搅拌转速80r/min。二级种子培养结束，菌体浓度35%、pH值8.5、培养时间21h。

发酵培养基：培养基的体积为100m³。

小麦麸皮2400kg、麦芽糖1300kg、蚯蚓粉1000kg、丝素粉1200kg、干酪素1100kg、玉米浆1400L、生物素14kg、尿素11kg、轻质碳酸600kg、麦芽糖酶0.5g、硫酸锌13kg、硫酸镁6kg、TritonX-1000.7kg、磷酸二氢钾1.2kg。

发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至25℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，移种比例控制在11%。

发酵培养条件为：

a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在8.0；

b培养温度29-30℃；

c搅拌转速：采用变频搅拌控制方法，0-100h：转速控制在100r/min；101-120h：转速控制在130r/min；121h-发酵结束：转速控制在90r/min；

d压力控制：罐压0.05-0.06MPa；

epH控制：发酵过程中pH控制在7.5-8.0；

f空气流量：0-60h：200m³/h；61-120h：300m³/h；121h-发酵结束：150m³/h；

h溶氧控制：

发酵前20h内，不控制溶氧；

21-60h，溶氧控制在60%以上；

61-120h，溶氧控制在20%以上；

121-发酵结束：溶氧控制在30%以上。

发酵培养结束，菌体浓度39%、化学效价11208u/mL、pH：8.0、培养时间150h。

上述实施例1-5中，在发酵过程中需要采用流加法进行补料，补料包括补氨水、补水、补糖和pH控制，具体为：

a补氨水工艺控制，氨水的浓度控制在15-20%，

发酵前79h不用进行补氨水，

发酵时间在80-120h补入氨水溶液，要求培养基中的铵离子浓度控制在0.25-0.3%。

b补水工艺控制：

发酵前59h不用进行补水，

发酵时间在60-100h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40-45%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度，

发酵时间在101h-发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35-40%，每隔6-8h检测发酵液菌体浓度。

c发酵过程pH控制工艺：

发酵前59h，pH不进行控制，

发酵时间在60h-发酵结束，若pH＜7.5，加入10-20%的氢氧化钠，调节pH至7.8-8.0；若pH＞8.0，加入30-40%的硫酸铵溶液，调节pH至7.5-8.5；

d补入麦芽糖溶液，麦芽糖溶液质量体积浓度为80-90%，其中还加入有麦芽糖酶，其质量体积浓度控制在0.001-0.003%。

发酵前59h，还原糖含量不进行控制，

发酵60h至120h：还原糖含量＜3%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在3-4%，

发酵121h至发酵结束：还原糖含量＜1%时，补入麦芽糖溶液，使还原糖的含量控制在0.5-1%。