治疗银屑病中药在制备治疗多发性硬化症药物中的应用

摘要

本发明涉及治疗银屑病中药在制备治疗多发性硬化症药物中的应用；其中治疗多发性硬化症药物的有效成分由以下原料药制得：肿节风15重量份、莪术9重量份、土茯苓60重量份、赤芍9重量份、乌梅15重量份、紫草15重量份和甘草6重量份。本发明所述治疗多发性硬化症药物可以改善神经功能，减少脑白质区和脊髓里的病理改变，如炎性细胞浸润，减少“血管套”形成，髓鞘脱失和神经元细胞空泡样坏死，从而达到治疗多发性硬化症的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及医用的配制品，具体涉及含有来植物的未确定结构的药物制剂。

背景技术

多发性硬化症(MultipleSclerosis，简称MS)是一种慢性进行性以中枢神经系统(CentralNervousSystem，CNS)白质脱髓鞘病变为特点，在欧美国家的发病率为177-350/100000，亚洲发病率有上升趋势，因其有较高的复发率、慢性病程对社会带来沉重的医疗和经济负担，尤其是青壮年易患(好发于20-40岁，女性多见，男女患病比率约为1：2)，是其非创伤性致残的常见病因，严重影响生活质量，故而一直倍受重视。MS的主要发病模式有四种：复发-缓解型(Relapsing-Remitting，RR)，原发-进展型(Primary-Progressive，PP)，继发-进展型(Secondary-Progressive，SP)和进展-复发型(Primary-Relapsing，PR)。病程常以急性或亚急性起病，持续数天后，症状有不同程度的缓解，缓解数周或数月后，症状反复发作。临床特点均表现为病灶播散广泛，可同时或相继累及大脑、小脑、脑干和脊髓，病程中常有间歇性发作的脑、脊髓和视神经神经损害，包括视觉障碍，共济失调，运动和感觉缺失，肠和膀胱失禁等。这些炎症在脑白质和脊髓中反复发作，导致大量炎性细胞累积分布在脑白质和脊髓血管周围，少突胶质细胞、神经元及轴索被破坏，形成脑白质脱髓鞘表现，使神经功能瞬态损伤或永久性丧失,严重时最终可能致残。

MS的病因尚不明确，但大量研究表明MS可能是在易感基因的基础上，受某些环境因素的影响以及病毒感染触发而导致自身免疫系统遭到不良影响，从而造成神经髄鞘发炎受损的一种病变，人们普遍认为MS病理学是由自身反应性T细胞浸润到中枢神经系统，随后对CNS的髓鞘产生免疫攻击，故MS被认为是一种自身免疫性疾病。

目前尚无治疗多发性硬化(MS)特效药物问世，治疗目标只是“减少复发频率、延缓病情发展”，主要目的是抑制炎性脱髓鞘病变的进展，防止急性期病变恶化和缓解期复发，西医常用的糖皮质激素(Glucocorticoid，GC)及免疫抑制剂治疗，此外以中和炎症因子为目标的生物制剂(如那他珠单抗)也逐渐在MS的治疗中兴起。这些药物虽可以使急性期缩短，但仍不能改变其反复发作而致病情恶化的病程，且上述药物长期大量使用，会导致明显的副作用。

从中医理论分析，MS病因与感受外邪、情志不舒、饮食不节、劳伤过度、先天肾精不足等有关。其病机主要包括正虚邪客、肾阳亏虚、肝肾阴虚、脾胃气血虚弱、痰湿中阻、气虚血瘀等几个方面。从临床经验和临床文献报道总结分析，肾虚和血瘀为本病的主要病机，病位在脑髓，与肾、肝、脾等有关，尤与肾关系密切，而血瘀亦是本病重要的病理因素。诸医家辨证分型急性期多属风湿、湿热、痰瘀阻络等，缓解期多以肝脾肾虚、痰瘀阻络之证为主。痰瘀阻滞贯穿疾病始终，治疗上应以化痰泄热、化瘀通络为法，现代药理研究证明，中药特别是补肾、活血化瘀之品，可调节机体免疫功能，具有抗炎、抗过敏作用，可提高机体的抵抗力。提示中医理论中具有活血化瘀兼调节自身免疫功能的中药，可能存在改善MS症状的有效成分，对MS可能具有潜在的治疗作用。

自身反应性T细胞在中枢神经系统(Centralnervoussystem，CNS)血管周围被重新激活，脑组织及脊髓血管周围特异性T细胞、单核细胞浸润，形成轴索脱髓鞘是MS的一个重要的病理学特征。辅助性T细胞(helperTcell，Th)中的Thl/Th17平衡失调是MS形成和发展的关键因素。此外，在细胞因子的调节下，Th细胞亚群之间可能发生相互转化，并产生相应的免疫应答反应，免疫调节细胞及相关的细胞因子之间的相互作用便形成一个不可分割的网络，他们之间的共同作用促进了MS的形成和发展。我们可以得出结论，降低炎症反应，调节Th细胞亚群的平衡成为治疗MS的关键。

用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MyelinOligodendrocyteGlycoprotein，MOG)多肽片段免疫诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎模型(ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，EAE)是一种以特异性致敏性CD4+T细胞介导为主的，以中枢神经系统内小血管周围出现单个核细胞浸润为特征的自身免疫性疾病，能从发病机制上模拟MS，并且再现了各种MS类型的临床病程；其病理改变也有炎性细胞浸润、髓鞘脱失、轴索变性等典型特点。目前EAE已成为MS临床前研究和基本T细胞免疫学的最成功的动物模型之一，它不仅概括了以MS病理特点为原型的器官特异性自身免疫性疾病，同时也可以用来作为研究体内T细胞发育免疫反应的合适模型。

目前，国内外多项研究发现，中药通过调节T细胞亚群失衡的状态及相关炎性因子的表达，对自身免疫性疾病，如EAE起到了一定的治疗效果。刘瑞华等用雷公藤干预治疗42例MS临床患者，雷公藤治疗组治疗前后外周血中CD4+T细胞较治疗前明显降低，CD8+T细胞明显增加，CD4+/CD8+比值则显著降低，说明雷公藤治疗多发性硬化症的免疫抑制机制可能是通过调节T淋巴细胞亚群分布而发挥作用。研究多局限在中药单体或活性成分，而中药组合物治疗多发性硬化症的研究很少。临床研究显示,中医药治疗MS多以补肾方药化裁。如益髄灵胶囊(人参、鹿茸、菟丝子、何首乌、枸杞子等)、二黄汤(生地黄、熟地黄、制何首乌等)、补肾固髓片(淫羊藿、肉苁蓉、仙茅、生地黄、制何首乌等)、地黄合剂(熟地黄、山茱萸等)、龟鹿益髓胶囊(人参、鹿茸、龟板、菟丝子、何首乌、枸杞子等)、益肾达络饮(熟地黄、鹿角胶等)、左归丸、右归丸(熟地黄、菟丝子、牛膝、龟板胶、鹿角胶、枸杞子等)辨证治疗MS患者。实验研究表明左归丸可下调EAE急性期血浆中Thl/Th2水平，左归丸和右归丸均能上调EAE缓解期血浆Thl/Th2水平，改善Lewis大鼠的EAE症状，认为二者通过下调TNF-α、MMP-9表达、上调IL-12p40和TGF-β表达可能是中医药辨证论治治疗急性期MS的部分机制所在。王平等用二黄方(生地黄、熟地黄、制首乌等)治疗MS的作用机制可能是通过下调患者脑脊液中的MCP-1和上调TGF-β，从而起到降低复发的作用。

公开号为CN101632827A的专利申请公开了一种治疗银屑病的中药组合物，该组合物为含有如下重量份原料制成的制剂：肿节风3～30份，莪术3～30份，土茯苓2～60份，赤芍5～30份，乌梅2～30份，紫草2～50份，甘草1～10份。该专利申请的组方具有养血润燥、凉血解毒、化瘀通络之功效，临床用于治疗血虚风燥型的银屑病疗效确切。

现代药理研究表明，银屑灵中药组分具有多种药理活性，均对机体免疫功能及炎性反应产生影响，概况起来讲，目前已公开的文献报道的药理作用如下：

(1)方中含有的肿节风等指标成分中含有绿原酸、迷迭香酸等化合物，具有抗炎、免疫抑制等作用(冯丽敏,赵瑞芝,王银洁,韩凌,卢传坚.正交设计法优选银屑灵片中肿节风有效成分的提取工艺[J].时珍国医国药,2011,08:1860-1861.)。

(2)红条紫草中的紫草素可以降低Th1型细胞因子表达水平，使Th2型细胞因子表达增高(代巧妹,王金凤,张凤山.紫草素对晚期胶原性关节炎的作用研究[J].哈尔滨医科大学学报,2009,43(1):48-51.)。

(3)莪术可明显提高小鼠的免疫功能(李法庆,邸大林,陈蕾.莪术对小鼠免疫功能影响的研究[J].时珍国医国药,2006,17(8):1482-1483.)。

(4)土茯苓及其有效成分落新妇苷可以抑制活化T细胞的迁移和CD4+的表达，使免疫反应有Th1型向Th2型偏移，对免疫应答产生抑制作用(FeiM,WuX,XuQ.AstilbininhibitscontacthypersensitivitythroughnegativecytokineregulationdistinctfromcyclosporinA[J].JAllergyClinImmunol.2005,116(6):1350-1356；陈涛,潘铁成,高思海等.落新妇苷对小鼠心脏移植排斥反应的抑制作用[J].山东医药,2006,46(33):7-8.)。

(5)乌梅对溃疡性结肠炎有治疗作用，可上调抗炎细胞因子，下调促炎细胞因子的作用，使免疫功能恢复正常(范恒,邱明义,梅家俊等.乌梅丸对溃疡性结肠炎大鼠组织细胞因子的干预效应[J].中国临床康复,2006,10(7):87-89.)。

(6)甘草酸类具有免疫激活作用，可增强辅助性T淋巴细胞的增殖能力和活性。甘草多糖“香豆素”也具有抗炎解痉等功效。甘草提取物对机体特异性免疫有一定的促进作用(高章图,张建新,徐铎.甘草酸抗炎抗病毒及免疫调节作用研究进展[J].解放军药学学报,1999,15(5):27；刘丽萍，任翠爱，赵宏艳.甘草酸的免疫调节作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2010，16(6):272-276；朱雪峰,谢鲲鹏等.甘草提取物的抑菌作用及其对小鼠免疫功能的影响[J].中国微生态学杂志,2013,25(3):254-257.)。

(7)中药提取液对于TNF-α刺激产生的IL-8的具有抑制作用(卢传坚,刘凤年.“银屑灵片”中药提取液对肿瘤坏死因子-α刺激后角朊细胞分泌细胞因子IL-8的影响[J].辽宁中医杂志,2009,11:1862-1863.)。

(8)全方通过改善病变微循环，抑制炎症反应对于寻常型银屑病(瘀滞肌肤型)有治疗作用(廖列辉,黄咏菁,范瑞强,禤国维.活血法治疗寻常型银屑病(瘀滞肌肤型)47例疗效观察[J].新中医,2005,37(12):40-41.)。

以上研究提示，银屑灵片具有抗炎、免疫抑制等作用，对角质形成细胞株增殖有抑制及凋亡的作用，并能抑制上皮细胞有丝分裂而起到抑制表皮增生过快的作用，目前，银屑灵片作为治疗银屑病的药物在临床上应用，尚未见有将其应用于防治MS的研究报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供治疗银屑病中药在制药中的新用途。

所述治疗银屑病中药在制药中的新用途具体是：

治疗银屑病中药在制备治疗多发性硬化症药物中的应用,其中，所述的治疗多发性硬化症药物的有效成分的制备原料与公开号为CN101632827A专利申请公开的治疗银屑病中药组合的原料药相同，即由以下原料药制成：

肿节风15重量份、莪术9重量份、土茯苓60重量份、赤芍9重量份、乌梅15重量份、紫草15重量份和甘草6重量份。

上述应用中的所述的有效成分由以下方法制成：

(1)将所述的原料药，直接捣碎成粗粉，加8-10倍量体积浓度为70％的乙醇提取两次，每次2小时，合并提取液；

(2)减压浓缩，回收乙醇，制得浸膏。

本发明所述治疗多发性硬化症药物可由上述有效成分加入医学上可接受的辅料制成常规的口服制剂，成人每日用量相当于上述有效成分2.15g生药/kg体重，21天一个疗程。

本发明所述治疗多发性硬化症药物可以改善神经功能，减少脑白质区和脊髓里的病理改变，如炎性细胞浸润，减少“血管套”形成，髓鞘脱失和神经元细胞空泡样坏死，从而达到治疗多发性硬化症的目的。

为了更好地理解本发明，下面将通过实施例和动物实验进一步阐明所述治疗银屑病中药在防治多发性硬化症中的效果。

附图说明：

图1为用MOG35-55免疫的C57BL/6雌性小鼠诱导实验性自身免疫性脑脊髓膜炎动物模型发病率、体重均数及神经功能评分比较的曲线图。

图2为造模后小鼠的脑和脊髓组织HE染色图片。

图3为小鼠脑组织中炎症因子的Q-PCR的结果柱状图。

图4为小鼠脊髓组织中炎症因子的Q-PCR的结果柱状图。

具体实施方式

下述药效实验所用药物均按公开号为CN101632827A专利申请实施例1所述处方和制备方法制成的片剂(即下述的银屑灵片)。

一、银屑灵对MOG_(35-55)诱导的EAE小鼠中枢神经系统中Th细胞亚群的调节作用实验

材料与方法：

1、动物来源

从广州省实验动物中心(中国广州)获得，30只18～22克雌性C57BL/6小鼠，适应性喂养1周。小鼠无特定病原体条件下饲养，温度为24±1℃，湿度为40-80％和12小时光照/12小时黑暗周期。

2、仪器与材料

髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG(35-55):MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK)(BioGenscript公司，纯度大于95％)，完全福式佐剂(CFA)(Sigma公司)，结核菌素(MT)(Difco公司)，百日咳毒素(PTX)，ListBiologic公司)。CD3抗体(Abcom公司)，山羊血清、兔二抗、DAB显色液(Maxim公司)，RNA逆转录试剂盒(Promega公司)，引物合成(LiuheGenomics公司)，SYBRGreensupermix(Bio-rad公司)，低温冰箱(三洋，日本)，超低温冰箱(美菱，中国)，均质器(BD，美国)，台式高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)，RT-PCR仪、电泳装置(Bio-Rad公司，美国)，7500序列荧光定量PCR仪(应用Blosystems，美国)和PM-30倒置显微镜－计算机图像分析系统(Olympus，日本)。

3、药液配制

根据《中药药理实验方法学》规定，小鼠给药剂量的选择按照不同种属动物间等效剂量的直接折算公式计算，成人每日服用129g生药，小鼠的用药剂量是成人的12倍，取所述的银屑灵浸膏加入蒸馏水充分混悬配制成每毫升含有生药量2.58克的混悬液，4℃保存备用。

4、免疫造模

将MOG35-55(10mg/mL，用灭菌后PBS配制成相应浓度)与等体积的CFA(含500μg灭活的结核分枝杆菌(MT)用巳经灭菌玻璃注射器充分乳化，沿其后背部正中线两侧，分两点给小鼠背部皮下注射(l00μL/只)乳化液，每个部位各50μL，最终每只小鼠皮下注射的MOG35-55和MT剂量均为200μg。在免疫当天和72小时后给每只小鼠腹腔注射300ng百日咳毒素(PTX)。

5、分组与给药：

将小鼠随机分为EAE模型组(10只)、银屑灵片治疗组(10只)、正常对照组(10只),共3组。于造模前一天开始预防性给药，每天一次，银屑灵治疗组给予银屑灵混悬液(25.8g生药/kg)灌胃，EAE模型组和正常对照组给予等剂量蒸馏水灌胃，连续灌胃给药21天。所用剂量均根据人体用量换算得到。

6、指标监测：

(1)体重监测：采用双盲法，每日一次对小鼠进行称重、评估。

(2)小鼠神经功能监测：每天2人至少1次在同一时间按Benson评分标准，对EAE严重性进行临床评估。

Benson评分标准

0分：无任何临床症状；

1分：尾部张力消失，可见轻度步态笨拙；

2分：双后肢无力，被动翻身后可以恢复；

3分：双后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可以挪动；

4分：双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；

5分：濒死状态或死亡。

注：症状介于两者标准之间者以土0.5计。“每日积分均值”由当日组内所有动物分值总和除以该组动物数量所得。

(3)发病率监测：按Benson评分标准，EAE临床神经功能评分≥1分者定为发病，进行发病率的计算。

7、组织取材：

每组实验小鼠在造模免疫后第21天取材：颈椎脱臼处死，剖取脑和脊髓腰椎膨大部组织，用PBS洗净组织，滤纸大致吸干脑和脊髓组织表面水分，将组织平均分为3份，一部分按照实时荧光定量PCR方法要求处理样品待测；用于苏木素-伊红(H&E)染色观察时，取出所需要的部分组织在10％中性甲醛溶液中固定24小时后，脱水，石蜡包埋，，3.5μm连续切片行H&E染色。另一部分取新鲜组织覆盖于冰冻包埋液(OCT)迅速放于液氮中冷却，-80℃保存备用，5μm冰冻切片用于免疫组化。

8、组织病理学检测及评价指标：

(1)苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色：用石蜡切片机进行石蜡样本的切片，厚度3.5μm，连续切片，染色程序为烤片干燥20分钟，二甲苯2次×10分钟，无水乙醇2次×2分钟，95％乙醇1分钟，80％乙醇1分钟，70％乙醇1分钟，水洗1分钟，苏木素8分钟，苏木素10分钟，水洗2次×1分钟，0.5％盐酸酒精10秒，水洗10分钟，伊红2分钟，水洗1分钟，80％乙醇5秒，85％乙醇5秒，90％乙醇5秒，95％乙醇1分钟，无水乙醇2次×2分钟，无水乙醇3分钟，二甲苯2次×2分钟，结束染色后直接中性树胶封片。

(2)根据Okuda病理评分标准，对HE染色图片进行分析。每个样本切片取5个高倍视野(×400)图片，每个切片从在脑白质、海马区及脊髓白质区随机选择的。评分标准如下：

(3)免疫组化(CD3)染色方法：①切片、固定：-80℃取出切片，放入丙酮中，4℃固定20分钟。②PBS清洗3次，每次3分钟。②消酶：用3％双氧水/甲醇消除内源性过氧化物酶，室温孵育10分钟。③PBS清洗3次，每次3分钟。④用二抗同来源血清(动物非免疫羊血清)封闭，室温孵育30分钟。⑤孵一抗：用抗体稀释液稀释，放入保湿盒中4℃孵育过夜，16小时，需设PBS阴性对照，样品阳性对照和样品阴性对照，批量做之前需做抗体浓度梯度，寻找最佳条件。⑥复温：次日，取出切片，室温复温30分钟。⑦PBS清洗3次，每次5分钟。⑧孵二抗：因为一抗为兔来源抗鼠抗体，所以二抗选用羊抗兔二抗，即用型，室温孵育15分钟。⑨PBS清洗3次，每次5分钟。⑩二氨基联苯胺(DAB)显色：避光镜下显色3分钟。自来水冲洗，苏木素复染30秒，自来水冲洗，0.5％盐酸酒精分化10秒，PBS返蓝。脱水：70％乙醇1次×3分钟，95％乙醇1次×3分钟，无水乙醇1次×3分钟，二甲苯透明1次×3分钟。中性树胶封片。

(4)关于免疫图像的定量分析，用Image-ProPlus6.0系统进行。每组取5个样本，每个样本取5个高倍视野(×400)图片，每个切片从在脑白质、海马区及脊髓白质区随机选择的。阳性结果用平均光密度表示。(平均光密度(meandensity)＝积分光密度(IODSUM)/Area)

9、组织总RNA提取分离：

将100g组织移至用预冷的经180℃烘烤8小时的研钵中，研磨标本至成粉末状，研磨过程中不断加入液氮；加入适量的trizol裂解组织并研磨；室温下放置3-5分钟，待液化后将裂解液移至干净的无酶微量离心管中。加入预冷的三氯甲烷0.2mL，迅速用力上下颠倒混匀，冰上静置5分钟，使蛋白复合体全部裂解，离心(4℃，13000g,15分钟)。吸取上层水相，转移到另一个无酶离心管中，加入400μL异丙醇，迅速用力上下颠倒混匀，-20℃静置30分钟，沉淀RNA。离心(4℃，13000g,10分钟)，管底可见少许白色沉淀，去上清，加入1mL的70％乙醇(用无酶水现配)，上下颠倒混匀后洗涤去杂，冰上放置5分钟。离心(4℃，7600g,5分钟)，尽量吸干乙醇，室温下干燥5分钟，待残余的乙醇挥发完全至RNA沉淀透明，最后加入30μL无核酸酶水,溶解RNA。

10、逆转录cDNA：

根据试剂盒说明书中的程序(表1)进行cDNA的合成。样品反应体系4μL含有2.5μgRNA和随机引物1μL，加入无核酸酶水至5μL，70℃加热5分钟。在冰上立即冷冻至少5分钟，加入逆转录混合物15μL，瞬时离心10秒。混匀后退火加热至25℃孵育5分钟、延伸加热1小时至42℃，冷却至4℃后取出，-20℃保存。

逆转录混合物如下：

11、RealTime-PCR分析：

在10μL的实时反应体系中含有：5μL的universalSYBRGreensupermix(2x)，上游引物的0.5μL(10μmol/L)，下游引物的0.5μL(10μmol/L)，稀释的cDNA4μL。

用荧光定量专用封口膜覆盖96孔PCR板，瞬时离心后放入荧光定量PCR仪内，扩增40个循环，变性、退火、延伸所需温度、时间分别为95℃30s、60℃30s、72℃90s。

CD3ε作为内参基因，每个样品重复测定3次。mRNA的相对量用Ct值表示，平均相对表达量通过2^－△△Ct计算方法分析。

所用引物序列如下：

12、统计学处理：

实验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料均以均数±标准差表示计量资料均数的组间比较应用ANOVA方差分析，P<0.05具有统计学意义；计数资料采用卡方检验，P<0.05具有统计学意义；等级资料采用秩和检验中Kruskal-Wallis法进行检验，P<0.05具有统计学意义。

二、结果分析

1.银屑灵对MOG_(35-55)诱导的EAE小鼠发病率、体重的影响及对神经系统功能的保护作用

整个实验过程中正常组小鼠无发病，反应、活动、食欲均正常，体重逐渐增加。抗原免疫诱导7天后，模型小鼠逐渐开始发病，临床表现为反应迟钝、活动减少、体重减轻，并出现明显神经系统体征：以尾部下垂无力、双后肢瘫痪多见，部分严重者四肢均瘫痪、甚至呈濒死状态，症状均符合EAE小鼠模型表现，且随时间的延长逐渐加重。第14天达到发病高峰，随后开始神经功能恢复。两组小鼠经MOG抗原免疫后，发病率均可达到100％(p<0.0001)，且银屑灵组与模型组无明显差别(p>0.05)，说明造模成功(见表1、图1A)；造模后到第14天高峰期前，EAE模型组小鼠体重未见明显减轻，正常组、模型组及银屑灵给药组三组比较，p＝0.00528>0.05，无统计学差异，但第14天发病高峰时期，小鼠全部出现不同程度地疾病进展，MOG诱导的模型组体重降低明显，而经银屑灵干预治疗后，小鼠体重不但未见明显减轻，反而较正常组有所增加，p＝0.0025<0.01，统计学分析存在显著性差异，说明银屑灵可使EAE小鼠在急性发病中晚期体重增加(见表2、图1B)；而在运用银屑灵浸膏水溶液灌胃治疗后，小鼠的发病程度较模型组轻，神经功能评分显著下降(p＝0.0244<0.05)(见表3、图1C)，有统计学意义，说明银屑灵可以改善EAE小鼠神经功能。

表1：各组小鼠发病率比较(百分比)

注：与正常对照组相比，P<0.0001，有显著性差异，说明造模免疫成功。

表2：各组小鼠体重变化比较(克)

注：急性发病早期，三组体重均数比较，p＝0.00528>0.05，无统计学差异；急性发病中晚期，YXL组与正常对照组、模型组相比，p＝0.0025<0.01，有显著性差异。

表3：各组小鼠神经功能评分比较

注：银屑灵治疗组与EAE模型组相比较，p＝0.0244<0.05，有统计学差异。

2.银屑灵对MOG_(35-55)诱导的EAE小鼠中枢神经系统病理损害有改善作用

银屑灵药液治疗EAE小鼠模型的脑和脊髓组织经HE染色及免疫组化法(CD3ε)染色发现，正常对照组小鼠组织未见明显异常改变，免疫模型组小鼠可见到脑和脊髓组织有多个部位的，血管周围大量炎性细胞浸润，小血管明显扩张，部分微血管周围被炎症细胞围绕，形成典型的“血管袖套样”改变，胶质细胞脱髓鞘及神经元细胞空泡样坏死等病理特点改变，上述改变以大脑白质区、侧脑室海马区和脊髓白质区最为显著，部分皮髓质交界处也可出现；且神经功能评分越高者，炎性病灶范围和细胞浸润的程度也相应增加；对HE染色图片经行Okuda病理学评分发现，模型组大部分呈中-重度炎性浸润，炎性细胞浸润数量较多，范围较广；而在银屑灵治疗组小鼠脑和脊髓组织中也可见炎性细胞浸润，和少量神经元细胞空泡样坏死，但病变范围、数量较模型组明显减少，极少数可见“血管袖套样”改变(见表4、5及图2)。

各组脑和脊髓组织冰冻切片免疫组化，观测免疫21天后疾病急性期小鼠组织中总T淋巴细胞(CD3ε)的浸润情况，图片放大倍数为400倍；正常对照组，未见明显T淋巴细胞浸润；EAE模型组，可见炎性细胞大量浸润，聚集于部分小血管周围；银屑灵治疗组中炎性病灶范围和数量较模型组减少，每组取5个样本，每个样本取5个视野图片进行平均光密度IOD值定量分析及统计，模型组CD3ε表达的平均光密度值较高于YXL组(P<0.05)，有统计学意义(见表6)。

表4：各组小鼠治疗后脑组织病理得分分布及脑炎轻重程度分布百分率(百分比＝各得分分布例数/各组总样本数×100％)

注：银屑灵治疗组与模型组比较，p＝0.0088＜0.01，有显著性差异。

表5：各组小鼠治疗后脊髓组织病理得分分布及脊髓炎轻重程度分布百分率(百分比＝各得分分布例数/各组总样本数×100％)

注：银屑灵治疗组与模型组比较，p＝0.0036＜0.01，有显著性差异。

表6：免疫组化(CD3)表达情况比较

注：银屑灵治疗组与模型组比较，脑组织中P＜0.0001，有统计学显著性差异；脊髓组织中P＜0.0001，有明显统计学意义。

3.银屑灵对MOG_(35-55)诱导的EAE小鼠中枢神经系统中炎症因子的影响

CD3ε是T淋巴细胞的特征基因，其含量的多少反映组织中炎性浸润的程度。正常对照组小鼠中不表达或仅少量表达CD3ε，给予MOG抗原免疫造模后，CD3ε基因表达明显升高(脑P＝0.0004<0.01；脊髓P＝0.0156，P<0.05)，有统计学差异，说明炎症浸润严重。经银屑灵药液治疗后，CD3ε相对表达量下降(脑P＝0.003<0.05，见表7及图3；脊髓P＝0.0011，P<0.01，见表8及图4)，有显著性差异。

MOG免疫后21天后急性期，小鼠脑白质和脊髓组织中促炎因子IFN-γ、IL-6、IL-17A及ROR-γt的相对表达量均明显上调(P<0.05)；与模型组相比，银屑灵治疗组IFN-γ、IL-6、IL-17A及ROR-γtmRNA的相对表达量明显降低，尤其是脊髓中IFN-γmRNA表达显著降低(P<0.01，见表8及图4)，存在显著性差异。抑炎因子IL-4、TGF-β、IL-10mRNA在脑白质和脊髓中的表达较正常对照组明显降低(P<0.05)，而经银屑灵药液治疗后，表达量较模型组显著增加(P<0.05，见表7及图3)，尤其是脊髓组织中IL-4、TGF-β1、IL-10mRNA表达显著增加(P<0.01，见表8及图4)，存在显著性差异。

表7：脑组织中基因表达情况比较

注：银屑灵治疗组与模型组比较，脑组织中^△P＜0.05，有统计学意义；^△△P＜0.01，有显著性差异。

表8：脊髓组织中基因表达情况比较

注：银屑灵治疗组与模型组比较，脊髓组织中^△P＜0.05，有统计学意义；^△△P＜0.01，有显著性差异。

结论

实验性自身免疫性脑脊髓膜炎模型经过银屑灵药液干预处理，可减轻发病程度，改善神经功能作用，能够减轻小鼠病变组织内炎性浸润，保护神经组织。