用于减少烟草植物材料中结合基质的尼古丁衍生物亚硝胺酮的方法

摘要

本文提供一种减少干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量的方法，所述方法包括减少所述干制烟草植物材料中的木质素的量。描述了一种减少在烟草植物材料的干制过程中结合基质的NNK的形成的另一方法，所述包括在干制前减少其中的木质素的量。

说明书

技术领域

本发明大体上涉及用于减少烟草植物材料中尼古丁衍生物亚硝胺酮或4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的量的方法。

背景技术

在烟草产品的制造和处理过程中，产生诸如烟草茎和散叶的副产品。来自制造过程的烟草茎和烟草碎料不适合直接用于制造烟草产品。由于所述茎和碎料占原料投入的相当大一部分数量，已经开发了方法来将这些茎和碎料进一步转化成产品(诸如再生烟草材料(例如再生烟草片))，其然后可以以相对大量与可接受的经加工的烟草叶混合使用。可以在浆或浇铸片工艺中制造再生烟草，其中将磨碎的烟草茎的浆和烟草叶的其它部分研磨，并与可能含有不同添加剂的溶液混合。然后对所得烟草浆进行喷雾以形成薄膜，干燥、滚轧和切成条，将所述条加入填充物中。

亚硝胺是在许多消费品(诸如烟草、食品和化妆品)中发现的有机化合物。亚硝胺已经引起强烈的科学兴趣，因为在此类别中的有些化合物已经被证实在实验动物中是致癌的。据报道，一些干制烟草含有在无烟烟草、香烟的主流烟气和侧流烟气中可以发现的烟草特有的亚硝胺。在烟草中，产生可察觉的量的至少4种亚硝胺。这些是尼古丁衍生物亚硝胺酮或4-(甲基亚硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基去甲烟碱(NNN)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)和N-亚硝基八角枫碱(NAB)。不认为烟草特有的亚硝胺以显著数量存在于生长中的烟草植物或新鲜的切割烟草(绿烟草)中，但是在烟草干制工艺过程中形成。除了在绿叶的干制工艺过程中形成烟草特有的亚硝胺以外，烟草特有的亚硝胺也可以在用于制备水性烟草浆的工艺(诸如用于制备再生烟草的工艺)中形成。

在减少烟草特有的亚硝胺的尝试中，已经提出了烟草植物或收获的烟叶的各种处理，包括辐射处理、化学处理和萃取。MacKown等人(J.Agric.FoodChem.36,1031-1035，1988)已经提出了用于减少烟草特有的亚硝胺的其它方法。这些方法涉及使用灭菌、微生物抑制剂、碱(用于增加pH)或抗坏血酸(用于减少在再生烟草片的生产过程中烟草特有的亚硝胺的积累)的处理。WO2012160133描述了通过增加其pH而降低烟草匀浆物中的烟草特有的亚硝胺的水平的方法，特别是当用升高的亚硝酸盐水平建立升高的亚硝胺水平时。

与设法降低烟草中的烟草特有的亚硝胺的水平有关的一个问题是，晾干的烟草中的一些亚硝胺(包括NNK)以结合或基质结合的形式存在，可能难以去除或萃取。基质结合的NNK可以用0.1NKOH溶液从经水洗涤的白肋烟草填充物中提取。该碱处理也会降低烟气中的NNK水平(Keene,C.K.,1992,TheEffectofBaseDigestiononTSNAinExtractables-DepletedFillers.LegacyTobaccoDocuments)。但是，所述处理可能将毒理学上有关的化合物引入烟草中，并可能显著地降低烟草的质量，其对于烟草行业具有高度争议性。

WO2010/021809描述了一种用于减少烟草中的氮化合物和木质素的方法。通过溶剂提取去除氮化合物；在单独步骤中去除木质素。

需要用于减少结合基质的NNK的有效的及具成本效益的方法，所述结合基质的NNK在烟草的干制过程中形成。特别地，尤其需要一种用于减少干制烟草中的结合基质的NNK的水平的具成本效益且简单的方法，所述方法不引入有毒的或可能有毒的化合物且不会降低烟草产品的质量。

发明内容

本发明至少部分地基于结合基质的NNK与烟草植物中的木质素共同定位的惊人发现。特别地，本发明发明人已观察到，在烟草植物的干制部分中(诸如在茎和中脉中)，结合基质的NNK与木质素(诸如尤其在维管束(例如木质部)中的木质化组织，且并非诸如皮质的周围组织)共同定位或主要地共同定位或特定地共同定位。因此，去除木质素(例如，通过将木质化组织与非木质化组织分离)可减少植物材料中的结合基质的NNK及其代谢物的量。结合基质的NNK可共价地或非共价地键合到木质素。预期植物材料释放具有减少的NNK水平和可能改进的感觉特性的烟。本公开内容可应用于累积结合基质的NNK或具有累积结合基质的NNK的可能性的那些植物材料。特别地，本公开内容可应用于用于某些烟草方法的包括结合基质的NNK的低价植物材料。本文所述的方法可在不使用任何添加剂的情况下进行且因此不将额外的毒理学相关的化合物引入到植物材料中。在烟草植物材料的干制过程中或干制后可去除木质素。可在干制前去除木质素以防止、减少或抑制与木质素一起的结合基质的NNK共同定位。

本公开内容的一个一般目的为减少用于吸烟或通过其他方式消费的烟草中的结合基质的NNK及其代谢物的量。另一个一般目的是减少烟草产品(包括香烟、雪茄、嚼烟、鼻烟和含烟草的口香糖和锭剂)的致癌潜力。又一另一个一般目的是降低或减少烟草植物材料中及烟草产品中的结合基质的NNK及其代谢物的量。另一个一般目的是减少干制(诸如部分或完全干制)烟草植物材料中的结合基质的NNK及其代谢物的量。另一个一般目的是减少气溶胶(包括烟)中的NNK及其代谢物的量。本公开内容的另一个目的是减少人中的NNK或其代谢物的量，所述人抽吸、消费或以其它方式摄入某些形式的烟草，提供适合用于人消费的烟草产品，所述烟草产品含有减少量的NNK或其代谢物，由此降低此产品的致癌潜力。

在一个方面，提供一种减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量，所述方法包括通过将木质化组织与非木质化组织分离减少其中的木质素的量，优选地，其中采用化学方式及/或械方式减少木质素的量。

在一个实施例中，处理烟草植物或烟草植物材料以使非木质化植物组织膨胀。通过基于膨胀及非膨胀植物组织的不同密度(例如，浮力密度)和/或其不同强度和/或其不同尺寸和/或其不同重量将其分离来减少木质化组织的量。可收集膨胀的植物组织以进行进一步烟草处理。

已观察到，可通过划分木质化组织来得到NNK及其相关联的TSNA的水平的显著减少。氮化合物和/或木质素的单独化学提取为不必的。

在一个实施例中，通过自植物或植物材料去除维管束或木质部或木质化厚壁组织或其两种或两种以上的组合来减少木质素的量。木质素可位于维管束中。木质素可特定地位于维管束中。木质素可特定地位于维管束中且非周围组织。木质素可位于木质部中。木质素可特定地位于木质部中。木质素可特定地位于木质部中且非周围组织。木质素可位于厚壁组织中。木质素可特定地位于厚壁组织中。木质素可特定地位于厚壁组织中且非周围组织。木质化组织通常不在植物中脉的外层。

在一个实施例中，根据本公开内容的处理的植物或植物材料包括植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上的组合、由植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上组成或基本上由植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上组成。

在一个实施例中，通过自植物或植物材料收割皮层(诸如外皮层)来减少木质素的量。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)提供干制烟草植物或干制烟草植物材料；(b)通过划分烟草植物材料减少干制烟草植物或干制烟草植物材料中的木质素的量；及(c)得到其中相较步骤(a)中提供的干制烟草植物或干制烟草植物材料木质素的量减少且结合基质的NNK的量减少的干制烟草植物或干制烟草植物材料。

在一个实施例中，在步骤(a)之后存在测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的另一步骤，且任选地，其中在步骤(b)之后存在测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的量的另一步骤。

在一个实施例中，所述方法包括将在步骤(a)之后测量的至少结合基质的NNK的水平与在步骤(b)之后测量的结合基质的NNK的水平进行比较的另一步骤(d)，其中在步骤(b)中得到的所述烟草材料中的结合基质的NNK的所述量相较步骤(a)中提供的所述烟草材料的减少指示所述烟草材料中的结合基质的NNK的所述量减少。

在另一方面，提供一种减少在烟草植物或烟草植物材料的干制过程中结合基质的NNK的形成的方法，所述方法包括在干制前减少其中的木质素的量。

在一个实施例中，所述方法包括以下步骤：(a)提供未干制烟草植物或未干制烟草植物材料；(b)在干制前减少未干制烟草植物或未干制烟草植物材料中的木质素的量；(c)干制步骤(b)中提供的烟草植物或烟草植物材料；及(d)得到其中相较其中木素素的量未减少的对照结合基质的NNK减少的干制烟草植物或干制烟草植物材料。

在一个实施例中，在步骤(a)之后存在测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的另一步骤，且优选地，其中在步骤(b)之后存在测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的量的另一步骤，且优选地，其中在步骤(c)之后存在测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的另一步骤。

在一个实施例中，在步骤(c)或步骤(d)之后所述方法包括将在步骤(a)之后测量的至少结合基质的NNK的水平与在步骤(b)之后测量的结合基质的NNK的水平进行比较的另一步骤(d)，其中在步骤(b)或步骤(c)中得到的所述烟草材料中的结合基质的NNK的所述量相较步骤(a)中提供的所述烟草材料的减少指示所述烟草材料中的结合基质的NNK的所述量减少。

在另一个方面，提供了通过本文描述的方法得到或可得到的烟草植物材料。

在另一个方面，提供了烟草植物或烟草植物材料的使用，其中其中的木质素的量相较用于制造具有结合基质的NNK的减少的水平的烟草的对照烟草植物材料已减少，其中结合基质的NNK的水平相较所述对照减少。

在另一个方面，提供了用于生产再生烟草的方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行本文所述的方法；(b)将步骤(a)中得到的烟草材料制造成再生烟草；及(c)任选地将再生烟草并入烟草产品中。

在另一个方面，提供了通过本文描述的方法得到或可得到的再生烟草。

在另一个方面，提供了用于制备用作烟草切割填充物的烟草的方法，所述方法包括以下步骤：(a)进行本文所述的方法；及(b)轧制及切割烟草材料以用作烟草切割填充物。

在另一方面，提供含有相较其中木质素的所述量已减少的对照烟草植物材料的减少水平的木质素的干制烟草植物材料，且其中结合基质的NNK的所述量优选地为约3500ng/g或更少。

在一个实施例中，平均粒径大于约0.5毫米。

在一个实施例中，游离的NNK的量小于约330ng/g，任选地其中NNN含量小于约1700ng/g，且任选地其中尼古丁含量小于约2610μg/g。

在一个实施例中，干制烟草植物材料包括植物皮层(诸如外部植物皮层)、由植物皮层(诸如外部植物皮层)组成、基本上由植物皮层(诸如外部植物皮层)组成。

在一个实施例中，维管束或木质部或木质化厚壁组织或其两种或两种以上的组合实质上不在干制烟草植物材料中。

在一个实施例中，干制烟草植物材料包括植物皮层(诸如外部植物皮层)、由植物皮层(诸如外部植物皮层)组成、基本上由植物皮层(诸如外部植物皮层)组成，且维管束或木质部或木质化厚壁组织或其两种或两种以上的组合实质上不在其中。

在一个实施例中，干制烟草植物材料自植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上的组合得到或可得到。

在一个实施例中，平均粒径大于约0.5毫米。

在一个实施例中，游离的NNK的量小于约330ng/g。

在一个实施例中，NNN含量小于约1700ng/g。

在一个实施例中，尼古丁含量小于约2610μg/g。

在另一方面，提供一种烟草产品或再生烟草产品，其包括本文所述的植物材料或干制植物材料，由本文所述的植物材料或干制植物材料组成，或基本上由本文所述的植物材料或干制植物材料组成。

在另一方面，提供一种产生气溶胶的方法，其中NNK的量相较对照气溶胶减少，所述方法包括以下步骤：(a)提供干制烟草植物或干制烟草植物材料；(b)减少干制烟草植物或干制烟草植物材料中的木质素的量；(c)得到其中相较步骤(a)中提供的干制烟草植物或干制烟草植物材料木质素的量减少且结合基质的NNK的量减少的干制烟草植物或干制烟草植物材料；及(d)加热自步骤(c)的干制烟草植物或干制烟草植物材料以产生气溶胶。

在另一方面，提供一种产生气溶胶的方法，其中NNK的量相较对照气溶胶减少，所述方法包括以下步骤：(a)提供未干制烟草植物或未干制烟草植物材料；(b)在干制前减少未干制烟草植物或未干制烟草植物材料中的木质素的量；(c)干制步骤(b)中提供的烟草植物或烟草植物材料；及(d)得到其中相较其中木素素的量未减少的对照结合基质的NNK减少的干制烟草植物或干制烟草植物材料；和(e)加热自步骤(d)的干制烟草植物或干制烟草植物材料以产生气溶胶。

在另一方面，提供一种产生气溶胶的方法，其中NNK的量相较对照气溶胶减少，所述方法包括以下步骤：(a)提供烟草产品或再生烟草产品，其包括通过本文所述的方法得到或可得到的烟草植物材料或干制植物材料，由通过本文所述的方法得到或可得到的烟草植物材料或干制植物材料组成或基本上由通过本文所述的方法得到或可得到的烟草植物材料或干制植物材料组成；及(b)加热烟草产品或再生烟草产品以产生气溶胶。

在另一个方面，提供了通过本文描述的方法得到或可得到的气溶胶。

在另一方面，提供基本上由烟草植物皮层组成的干制烟草植物材料，且其中结合基质的NNK的量减少，如本文所述。

在另一方面，提供一种掺合其中掺合有至少两种不同类型烟草的烟草以形成烟草混合物的方法，所述方法包括下述步骤：(a)提供第一干制烟草植物材料及减少其中木质素的量；(b)测量第一干制烟草植物材料的总NNK及/或结合基质的NNK含量及选择其中总NNK及/或结合基质的NNK含量相较步骤(a)中提供的第一干制烟草植物材料减少的干制烟草植物材料；(c)提供较步骤(b)中得到的第一干制烟草植物材料的总NNK及/或结合基质的NNK具有较高总NNK及/或结合基质的NNK含量的第二干制烟草植物材料，及任选地测量第二干制烟草植物材料中的总NNK及/或结合基质的NNK含量；(d)将自步骤(b)和(c)的第一及第二干制烟草植物材料掺合在一起，且任选地测量掺合烟草植物材料中的总NNK及/或结合基质的NNK含量；及(e)得到其中所述掺合烟草植物材料的所述总NNK及/或结合基质的NNK含量低于步骤(c)中提供的第二干制烟草植物材料的掺合烟草植物材料，任选地，其中步骤(a)和(b)在步骤(c)之后进行。

在另一个方面，提供了通过本文描述的方法得到或可得到的混合烟草植物材料。

上文讨论的实施例中的每一个作为本发明的方面中的每一个的实施例公开。预见到一个或多个实施例的组合。

附图说明

图1为说明游离的NNK、结合基质的NNK及干制白肋中脉或干制白肋茎秆中的木质化(L)及非木质化(NL)组织中的木质素的分布的图表。

图2为显示木质化(L)及非木质化(NL)组织的含水干制白肋茎秆的横截面图。使用间苯三酚将木质化组织染成红色。

图3为说明在使用亚硝酸钠溶液(通过摇晃在室温下1.5mL(水中10mg/mL)达4小时)亚硝化后游离的NNK、结合基质的NNK及绿色白肋中脉的木质化(L)及非木质化(NL)组织中的木质素的分布的图表。

图4为说明碾磨的冻干白肋烟草植物茎的部筛分部分中的游离的NNK及结合基质的NNK的图表。

图5为显示碾磨的冻干白肋烟草植物茎的筛分部分中的结合基质的NNK与木质素之间的关联的图表。

图6为显示在TN90的绿色中脉中亚硝化及洗涤后厚壁组织(S)中及中脉的外层(NS)中的结合基质的NNK的浓度(μg/g)的图表。还显示了假氧化尼古丁(PON)(μg/g)及尼古丁(μg/g)。还显示了商业干制白肋茎样本的木质化(CS)及非木质化(CNS)部分中的结合基质的NNK水平(ng/g)。还显示了NNN(ng/g)及尼古丁(μg/g)的水平。

定义

在本文中使用的技术术语和表达通常被赋予在植物和分子生物学的相关领域中经常应用于它们的含义。所有以下术语定义适用于本公开内容的整个内容。

词语“包括”不排除其它元件或步骤，且不定冠词“一(a)”或“一(an)”不排除多个/多种。

关于属性或值的术语“基本上”、“约”、“大约”等各自也特别地精确限定该属性或该值。

术语“植物”指处于其生命周期或发育的任何阶段的任何植物或其任何部分及其后代。在一个实施例中，植物是烟草植物，其指属于烟草属的植物。优选烟草植物种类在本文中描述。

“植物细胞”指植物的结构和生理单位。植物细胞可采取不含细胞壁的原生质体、经分离的单细胞或培养细胞的形式，或作为更高等组构单位的一部分，例如但不限于植物组织、植物器官或全植物。在一个实施例中，植物细胞为烟草植物细胞。

术语“植物材料”指植物的任何部分或植物的不同部分的混合物或不同植物的混合物，且包括但不限于烟草组织、散叶、绿散叶、茎、在植物加工过程中产生的尘和烟草叶初生薄片条及其组合。在某些实施例中，植物材料将包括植物部分或含有木质素的植物部分的混合物(诸如植物中脉或植物茎或植物茎秆)或其两种或两种以上的组合，由植物部分或含有木质素的植物部分的混合物(诸如植物中脉或植物茎或植物茎秆)或其两种或两种以上的组合组成或基本上由植物部分或含有木质素的植物部分的混合物(诸如植物中脉或植物茎或植物茎秆)或其两种或两种以上的组合组成。烟草植物材料可以具有经加工的烟草部分或块的形式、呈基本上天然的薄片或茎形式的干制的和老化的烟草、烟草提取物或前述物质的混合物，例如，将提取的烟草浆与造粒的干制的和老化的天然烟草薄片组合的混合物。植物材料可呈固体形式、呈液体形式、呈半固体形式、呈磨碎形式、呈压碎形式、呈筛滤形式或呈特定形式等或另外经处理以减少粒径。所述植物材料可以呈已经进行匀浆化(包括但不限于切割和碾磨或其组合)的匀浆物的形式。匀浆物可自全植物或自植物组分的混合物(诸如含有木质素的植物部分的混合物，例如，已经进行匀浆化的中脉或茎或茎秆或其两种或两种以上的组合)制得。所述植物材料可以呈浆的形式，包括植物材料或植物匀浆物在水性溶液或溶剂中的混悬液。所述浆可以是5％(w/v)、10％(w/v)、15％(w/v)、20％(w/v)或25％(w/v)或更高的植物材料在水性溶液或溶剂中的混合物。在一个实施例中，植物材料为包括木质素(诸如木质化组织)、由木质素(诸如木质化组织)组成或基本上由木质素(诸如木质化组织)组成的植物材料。在一个实施例中，植物材料为包括维管束、由维管束组成或基本上由维管束组成的植物材料。在一个实施例中，植物材料为包括木质部、由木质部组成或基本上由木质部组成的植物材料。在一个实施例中，植物材料为包括厚壁组织、由厚壁组织组成或基本上由厚壁组织组成的植物材料。在一个实施例中，植物材料包括植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上的组合、由植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上组成或基本上由植物中脉或植物茎或植物茎秆或其两种或两种以上组成。在一个实施例中，植物细胞为烟草植物材料。

术语“烟草产品”包括吸烟制品或可抽吸的制品以及无烟烟草产品。

术语“游离的NNK”指自通过在室温下使用含水缓冲剂提取所述植物材料制得的提取物的NNK含量计算的NNK浓度。可使用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)确定此提取物中的游离的NNK含量。

术语“总亚硝胺(NNK)”指在对提取混合物进行本文所述的方法(例如，通过加热至约130℃保持约4小时)及过滤提取物的等分试样以后计算的亚硝胺浓度。可使用UPLC-MS/MS确定此提取物中的总NNK含量。

如本文使用的术语“结合的NNK”或“结合基质的NNK”表示“总NNK”与“自由NNK”浓度之间的差异。

术语“减少的木质素含量”或“降低的木质素含量”或其“非木质化”语法变异指当与可比较对照植物中的木质素的量相较时植物中的木质素的量的可测量定量减少。可通过所述技术领域已知且包括克拉松(Klason)木质素试验(MethodinEnzymol.,161:87-101(1988))、乙酰溴试验(WoodSci.Technol.,22:271-2801988))或基于使用巯基乙酸的衍生化的光度法(J.Chem.Ecol.,28,2483-2501(2002))的试验容易地确定木质素的定量减少。在非木质化组织中，木质素的量相较可比较对照植物降低且可完全地、实持上或部分地去除木质素的量。在非木质化组织中，如果当与其中木质素的量已经减少的可比较对照相较时存在木质素的量的可测量定量减少，那么可存在木质素的可检测的量。在非木质化组织中，检测任何数量的木质素也许不可能。非木质化组织可含有植物或植物部分中的木质素的总干重的小于10％、9％,8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％，木质素自植物或植物部分去除。

“对照植物”或“对照植物细胞”指具有未经操作或修改的木质素含量和/或NNK含量的植物或植物细胞(诸如天然的或自然产生的植物或植物细胞)。对照植物材料包括得自、衍生自或可衍生自对照植物或对照植物细胞或其组合的植物材料。对照植物或对照植物细胞可为相同类型的植物或植物细胞，例如，与和其比较的植物或植物细胞相同物种的植物或植物细胞。对照植物或对照植物细胞可对应于野生型植物或野生型植物细胞。

术语“减少”或“降低”或其语法变异指自约10％至约99％的减少，或质量、数量或活性的至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的减少。

术语“抑制”或其语法变异指总量、数量或活性的自约98％至约100％的减少或至少98％、至少99％但尤其是100％的减少。

术语“增加”或其语法变异指总量、数量或活性的自约5％至约99％的增加，或者至少5％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少100％或更多的增加。

关于给定的数字值或范围的术语“约”指在给定的值或范围的20％内、10％内或5％内的值或范围。

术语“至少一部分”或其语法变异包括总量、数量或活性的至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。

具体实施方式

一般来说，本公开内容可应用于任何形式的烟草植物材料，其中NNK或其代谢物或其组合可形成或已形成。适当地，NNK的至少一部分呈结合形式。结合基质的形式的至少一部分与木质素(诸如木质化组织)共同定位。用于测量游离的亚硝胺和基质结合亚硝胺的方法是本领域众所周知的且在本文描述。简而言之，可提取烟草样品的等分试样，并可使用超高效液相色谱法-串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析其中的亚硝胺含量。通常，将一种或多种与要定量的亚硝胺对应的标准品掺入烟草样品的等分试样中。从提取物计算的样品浓度对应于样品中的“游离的NNK”浓度。用本文所述的方法处理提取混合物(例如，通过加热至约130℃保持约4小时)以后，再次通过UPLC-MS/MS测量亚硝胺浓度。可从这些值计算样本中的“总NNK”浓度。“基质结合的NNK”浓度是“总NNK”与“游离的NNK”浓度之间的差异。

已经对烟草进行了许多研究，特别是关于烟草特异性的亚硝胺。新鲜收获的烟叶被称作“绿烟草”，且认为不含有亚硝胺，但是绿烟草不适合用于人类消费。干制绿烟草的方法取决于收获的烟草的类型。例如，弗吉尼亚烟烤(淡色(bright))烟草通常是烟道烘烤的，而白肋烟草和某些深色品系经常是晾干的。与风干一至两个月相比，烟草的烟道烘烤通常在五至七天的时段内进行。许多重大的化学和生化变化在干制工艺过程中开始，且持续贯穿叶干燥的早期阶段。烟草从它的黄色至棕色的颜色转变通常导致亚硝胺(包括NNK)的形成和大量积累，以及增加的微生物含量。形成烟草特异性的亚硝胺(包括NNK)的确切机制不明，但是据信会被微生物活性增强，在干制工艺过程中在亚硝酸盐的产生中涉及微生物硝酸还原酶。

如上文所述，已发现基质结合的NNK与烟草植物中或烟草植物材料中的木质素共同定位。由于4-羟基苯丙酯类的氧化组合耦合，木质素为大批芳族聚合物的通用术语。这些聚合物主要沉积于次级厚的细胞(诸如纤维和管状分子)的墙里，使得其坚硬且不能渗透。木质素的机械刚度使得这些组织加强，以使得管状分子可在组织未解体的情况下承受蒸发产生的负压力。除提供机械强度外，木质素具有防护性功能。举例来说，木质素的物理韧性及化学耐久性可防止植食动物进食。木质化为传染或受伤的频率响应，其可提供物理势垒以阻断病原体的渗透。木质素的基本构件为羟基肉桂酰醇类(或单木纤维素)松柏醇及芥子醇，具有通常较小量的香豆醇。单木纤维素通过一般苯丙酸及单木纤维素特定的途径自苯丙氨酸合成。苯丙氨酸衍生自色素体中的莽草酸生物合成途径。木质素生物合成途径的某些酶(即细胞色素P450酶肉桂酸4-羟化酶(C4H)、香豆酸3-羟化酶(C3H)和阿魏酸盐5-羟化酶(F5H))为被认为在内质网的细胞溶质侧处为活性的膜蛋白。尽管已在苯丙氨酸解氨酶(PAL)与C4H之间显示代谢通道作用，但其它途径酶是否也为内质网处的代谢复合物的一部分仍保持为未知的。当并入木质素聚合物时由单木纤维素引起的单元被称为愈创木基(G)、紫丁香基(S)和氢氧苯乙酸(H)单元。

木质素通常发现于(例如)植物中脉、植物茎或植物茎秆中。因此，本公开内容中使用的材料可包括植物中脉或植物茎或植物茎秆或其混合物或其两种或两种以上的组合，且可经去除。木质素位于(例如)可发现于植物中脉、植物茎、植物茎秆等的烟草植物的维管束中。维管束由多个相对硬的纤维素构件构成，所述纤维素构件通过蔬菜纤维连接组织紧密固定在一起。在所述维管束周围是皮层，所述皮层由相对地海绵状的蔬菜组织形成或覆盖构件茎的大部分及其特征及特性接近烟叶的叶片的部分。木质素通常位于维管束中。维管束为维管植物中的输送系统的一部分。输送本身发生于维管组织中，其以两种形式存在，即木质部和韧皮部。这些组织两者均存在于维管束中，其另外将包括支撑及防护组织。在这些维管组织中，仅在木质部中发现木质素。

木质素的量可在植物中脉、植物茎或植物茎秆等或其两种或两种以上的混合物或组合中实质地减少。木质素可在植物中脉、植物茎或植物茎秆等或其两种或两种以上的混合物或组合中实质地去除。合适地，维管束或木质部或其组合在植物中脉、植物茎或植物茎秆等或其两种或两种以上的混合物或组合中实质地减少。合适地，维管束或木质部或其组合在植物中脉、植物茎或植物茎秆等或其两种或两种以上的混合物或组合中实质地去除。合适地，木质化厚壁组织可在植物中脉、植物茎或植物茎秆等或其两种或两种以上的混合物或组合中实质地去除。

由于木质素可容易地与植物的其它部分或其它植物组织分离，因此结合基质的NNK与木质素共同定位是有优势的。在一个实施例中，通过将木质化组织与非木质化组织分离减少木质素的量。举例来说，外皮层可容易地与含有木质素的维管束分离，因而得到具有减少的木质素水平的植物材料。含有减少水平的木质素或实质上不含木质素的植物材料可用于制造烟草材料或具有减少水平的结合基质的NNK的烟草产品，如本文所描述。任选地，可丢弃或以其它方法使用含有与结合基质的NNK共同定位的木质素的单独植物材料。

在一个方面，提供一种减少或降低干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量的方法，所述方法包括减少其中木质素的量。根据所述方法，提供一种干制烟草植物或干制烟草植物材料。干制烟草植物或干制烟草植物材料中的木质素的量减少。木质素可完全去除或部分去除。随后得到干制烟草植物或干制烟草植物材料，其中木质素的量减少且结合基质的NNK的量相较最初提供的干制烟草植物或干制烟草植物材料或相较对照也减少。

待完全或部分去除的木质素可位于维管束中。待完全或部分去除的木质素可特定地位于维管束中。待完全或部分去除的木质素可特定地位于维管束中且并非周围组织。因此，通过减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的维管束的量减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量。

待完全或部分去除的木质素可位于木质部中。待完全或部分去除的木质素可特定地位于木质部中。待完全或部分去除的木质素可特定地位于木质部中且并非周围组织。因此，通过减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的木质部的量减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量。

待完全或部分去除的木质素可位于木质化厚壁组织中。待完全或部分去除的木质素可特定地位于木质化厚壁组织中。待完全或部分去除的木质素可特定地位于木质化厚壁组织中且并非周围组织(诸如中脉的外层)。因此，通过减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的木质化厚壁组织的量减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量。

在另一方面，提供一种减少、降低、防止或抑制在烟草植物或烟草植物材料的干制过程中结合基质的NNK的形成的方法，所述方法包括在干制前减少其中的木质素的量。至少最初，烟草植物或烟草植物材料可为未干制的或实质上未干制的。所述方法可用于减少、降低、防止或抑制NNK与木质素的共同定位，其可能在随后的干制过程中以其它方式发生。根据本方面，提供未干制的烟草植物或未干制的烟草植物材料或实质上未干制的烟草植物或实质上未干制的烟草植物材料，且在干制前或干制过程中减少其中的木质素的量。木质素可完全去除或部分去除。木质素可位于维管束中。木质素可特定地位于维管束中。木质素可特定地位于维管束中且非周围组织。因此，维管束可完全去除或部分去除。木质素可位于木质部中。木质素可特定地位于木质部中。木质素可特定地位于木质部中且非周围组织。因此，木质部可完全去除或部分去除。木质素可位于木质化厚壁组织中。木质素可特定地位于木质化厚壁组织中。木质素可特定地位于木质化厚壁组织中且并非周围组织(诸如中脉的外层)。因此，木质化厚壁组织可完全去除或部分去除。木质素可完全去除或部分去除。在干制烟草植物或烟草植物材料后，使用所述领域众所周知的方法，可得到其中结合基质的NNK的量和木质素的量相较起始材料或相较对照减少的干制烟草植物或干制烟草植物材料。

使用所述领域众所周知的各种方法可减少烟草植物中或烟草植物材料中的木质素的量。在一个方法中，批量茎等可在流体(例如水)中浸湿或浸泡，其皮层软化及膨胀或隆起，同时使得木质素处于未膨胀状态。皮层可手动地(例如，用手)去除及保持，且含有木质素的维管束可丢弃或在别处使用。因此，皮层(例如，外皮层)可与木质化组织分离且保持，且丢弃未膨胀的木质化组织。随后可使用皮层以进行进一步烟草处理。还公开了植物皮层(例如，植物外皮层)或膨胀的植物皮层(例如，膨胀的植物外皮层)，其中结合基质的NNK的量低于可检测水平。因此，非木质化植物组织可膨胀以将木质化组织与非木质化组织分离。合适地，非木质化组织在木质化组织上方选择性地或优选地膨胀。

通过另一实例的方式，可使用合适的去皮机械分离木质素。去皮机为用于剥离树皮、木材和植物茎秆等的机器。

在另一方法中，可使用机械分离。举例来说，在冻干后进行批量茎等的浸泡。在另一实例中，在冻干、碾磨和过筛后进行批量茎等的浸泡。适当地，使用用于碾磨、研磨等的设备和技术，将烟草植物材料碾磨成粉末形式。适当地，在使用设备(诸如锤式研磨机、刀盘、气控研磨机等)碾磨或研磨的过程中，烟草植物材料是相对干燥的形式。

可使用本技术领域已知的各种方法减小植物材料的尺寸以形成颗粒或微粒物质。可通过尺寸分离颗粒或微粒物质以得到具有减少水平的木质素及减少水平的结合基质的NNK的部分。在一个合适方法中，通过压紧处理植物材料，诸如通过使用比待处理的植物材料更硬的一或多个物件的压紧。在一个实施例中，使用使用金属(诸如金属球)的压紧。可使用各种方法(诸如振动)实现压紧。举例来说，通过以300rpm振动15分钟使用钢球(2个钢球，直径2cm)来压紧植物材料。可使用振筛机通过尺寸将颗粒或微粒物质分离为具有不同粒径的部分。合适地，平均颗粒大于约0.5毫米，大于约0.85毫米或大于约1毫米。这些粒级可具有减少水平的木质素及减少水平的结合基质的NNK。

当植物材料的含水量小于约15重量％至小于约5重量％时，可以将其碾磨或研磨。可精细粉碎烟草植物材料。精细磨碎烟草材料通常具有约30-600微米的粒径。

在一个实施例中，所述方法包括膨胀，例如通过与液体接触(例如，通过水浸泡)，接着冻干，其将导致植物材料膨胀，所述植物材料不含有木质素或仅含有低水平的木质素。木质化植物材料较膨胀植物组织将保持较高密度、较高物理强度及较小粒径，由此允许通过尺寸分离。在另一实施例中，所述方法包括膨胀、随后冻干、随后碾磨(例如，通过如上文所述的压紧)、随后所得碎片的分类(例如，按尺寸分类)及具有减少水平的木质素及减少水平的结合基质的NNK的碎片的选择。针对此目的可使用筛分。在另一实施例中，所述方法包括膨胀，接着碾磨或压碎或其组合(例如，通过压紧，如上文所述)，接着按尺寸分类所得颗粒(例如使用筛分或基于密度及/或机械强度)及具有减少水平的木质素及减少水平的结合基质的NNK的颗粒的选择。不同尺寸的部分在其游离的NNK含量或其NNN含量或其尼古丁含量或其两种或两种以上的组合也不同。

在完全或部分去除木质素后，植物材料可任选地经进一步处理以用于烟草产品中。通过实例的方式，此材料可形成为水浆体。所得浆体可含有分散于其中的大部分胶状皮层颗粒。可使用合适类型的研磨机(诸如球磨机或胶体研磨机)完成烟草皮层至水浆体的转换。皮层及水浆体的进一步处理描述于本文中。

在某些实施例中，通过本文所述的方法得到或可得到的植物材料包括以下各者、由以下各者组成或基本上由以上各者组成：维管束周围的组织或木质部周围的组织或木质化厚壁组织周围的组织或具有维管束或木质部或木质化的厚部组织的其两种或两种以上的组合或实质上不存在的其两种或两种以上的组合。在某些实施例中，植物材料包括以下各者、由以下各者组成或基本上由以上各者组成：维管束或木质部或木质化厚壁组织周围的组织或其两种或两种以上的组合且实质上无维管束或无木质部或无木质化的厚部组织或其两种或两种以上的组合。在某些实施例中，植物材料包括以下各者、由以下各者组成或基本上由以上各者组成：维管束或木质部或木质化厚壁组织周围的组织或其两种或两种以上的组合且无维管束或无木质部或无木质化的厚部组织或其两种或两种以上的组合。在某些实施例中，植物材料包括外部烟草皮层、由外部烟草皮层组成或基本上由外部烟草皮层组成。在某些实施例中，植物材料包括植物中脉的外层、由植物中脉的外层组成或基本上由植物中脉的外层组成。

本文所述的方法可包括测量及任选地比较游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的水平的一或多个另外步骤。用于测量游离的NNK及结合基质的NNK的方法描述于本文中。在一个实施例中，在干制烟草植物中或干制烟草植物材料中确定游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的量。在减少干制烟草植物或干制烟草植物材料中的木质素的量之后，可再次测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的量。至少结合基质的NNK的水平可与初始起始材料作比较以确定是否已减少结合基质的NNK的水平。在此步骤中，可将先前测量的至少结合基质的NNK的水平与在减少木质素的量之后测量的NNK的水平作比较。与最初提供的烟草材料相较在木质素的量减少之后得到的烟草材料中的结合基质的NNK的量的减少指示结合基质的NNK的量已减少。

本文所述的方法可包括测量及任选地比较游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的水平的一或多个另外步骤。在一个实施例中，在未干制烟草植物中或未干制烟草植物材料中测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的量。任选地，在干制之前减少未干制烟草植物或未干制烟草植物材料中的木质素的量之后，可再次测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合的量。所述方法可包括一或多个比较步骤。通过实例的方式，所述方法可包括将如上文所述的最初测量的至少结合基质的NNK的水平与之后测量的NNK的水平比较的另一步骤，其中与最初提供的烟草材料相较烟草材料中的结合基质的NNK的量的减少指示烟草材料中的结合基质的NNK的量减少。

可在所述方法开始时和/或所述方法结束时和/或所述方法过程中测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合。可间断地或间隔地测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合。所述间隔可为固定间隔或随机间隔。可在所述方法结束时测量游离的NNK或结合基质的NNK或其组合核对游离的NNK或结合基质的NNK或其组合存在于所需量、浓度或范围内。

木质素可共价地或非共价地结合至木质素。描述包括共价地或非共价地结合至NNK的木质素的复合物。还公开了包括复合物的植物细胞、植物组织或植物或植物材料。本文还描述一种减少干制烟草植物中或干制烟草植物材料中的结合基质的NNK的量的方法，所述方法包括减少其中的复合物的量。

在另一方面，提供含有相较其中木质素的所述量已减少的对照植物材料的减少水平的木质素的干制植物组织，且其中结合基质的NNK的所述量为约3500ng/g或更少。结合基质的NNK的量可为约3000ng/g或更少、约2500ng/g或更少、约2000ng/g或更少、约1500ng/g或更少、约1000ng/g或更少或约500ng/g或更少。合适地，此干制植物组织的平均粒径可大于约0.5毫米，大于约0.85毫米或大于约1毫米。合适地，此干制植物组织中的游离的NNK的量可为约330ng/g或更少、约300ng/g或更少、约250ng/g或更少、约200ng/g或更少、约150ng/g或更少、约100ng/g或更少、约50ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的NNN的量可为约1700ng/g或更少、约1500ng/g或更少、约1300ng/g或更少、约1100ng/g或更少、约1000ng/g或更少或约500ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的尼古丁的量可为约2600μg或更少、约2300μg或更少或约2100μg或更少。合适的，此干制植物组织中的木质素的量可为干制植物组织的总干重含量的约6.5％或更少、干制植物组织的总干重含量的约6％、干制植物组织的总干重含量的约5％、干制植物组织的总干重含量的约4％或干制植物组织的总干重含量的约3％或更少。

在一个实施例中，提供含有相较其中木质素的量未减少的对照植物组织的减少水平的木质素的干制植物组织，且其中结合基质的NNK的量为约3500ng/g或更少，且平均粒径为约0.5mm或更大。合适地，游离的NNK的量为约300ng/g或更少。合适地，NNN的量为约1700ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约6.4％或更少。合适地，尼古丁的量为约2600μg或更少。

在另一实施例中，提供含有相较其中木质素的量未减少的对照植物组织的减少水平的木质素的干制植物组织，且其中结合基质的NNK的量为约1900ng/g或更少，且平均粒径为约0.85mm与约1mm之间。合适地，游离的NNK的量为约250ng/g或更少。合适地，NNN的量为约1270ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约4.4％或更少。合适地，尼古丁的量为约2300μg或更少。

在另一实施例中，提供含有相较其中木质素的量未减少的对照植物组织的减少水平的木质素的干制植物组织，且其中结合基质的NNK的量为约1600ng/g或更少，且平均粒径大于约1mm。合适地，游离的NNK的量为约200ng/g或更少。合适地，NNN的量为约1100ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约3％或更少。合适地，尼古丁的量为约2100μg或更少。

在本文描述的方法开始时使用的烟草植物或烟草植物材料可包括以下各者、由以下各者组成或基本上由以下各者组成：未干制烟草植物或未干制烟草植物材料或干制烟草植物或干制烟草植物材料。干制烟草(诸如烟叶，特别是绿烟叶)的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括(但不限于)风干、火烤、烟道烘烤和太阳晒。干制烟草的方法取决于收获的烟草的类型。例如，弗吉尼亚烟烤(淡色)烟草通常是烟道烘烤的，白肋烟草和某些深色品系通常是晾干的，且烟斗烟草、嚼烟和鼻烟通常是火烤的。尽管可以使用得自任何类型的烟草植物或烟草植物材料，但某些类型的烟草是优选的。特别优选的烟草材料选自由以下各者组成的群组：烟道烘烤的烟草、土耳其烟草、白肋烟草、弗吉尼亚烟草、马里兰烟草、香料烟草或其两种或更多种的任何组合。烟草材料的形状通常没有限制。它可以呈均质烟草材料的形式。烟草匀浆物(诸如但不限于干制的烟草匀浆物)可以使用本领域已知的多种方法从烟草材料制备，例如，烟草可以呈撕碎、研磨、造粒、细微粒或粉末形式。在某些实施例中，由于可用于分离木质素的某些机械分离方法可能需要研磨和/或筛分步骤，因此需要不起始于研磨或粉末形式的烟草材料。

使用的或获得的烟草材料可包括添加剂，所述添加剂包括(但不限于)以下组分中的一或多者及其组合：香料、有机填充物和无机填充物(例如，细粒、已加工细粒、疏松细粒、麦芽糊精、右旋糖、碳酸钙、磷酸钙、玉米淀粉、乳糖、甘露醇、木糖醇、山梨醇、精细粉碎的纤维素等)、粘合剂(例如，聚维酮、羧甲纤维素钠和其它改性的纤维质类型的粘合剂、海藻酸钠、黄原胶、基于淀粉的粘合剂、阿拉伯树胶、卵磷脂等)、着色剂(例如，染料和颜料，包括焦糖色和二氧化钛等)、保湿剂(例如，甘油、丙二醇等)、口腔护理添加剂、防腐剂(例如，山梨酸钾等)、糖浆(例如，蜂蜜、高果糖玉米糖浆等，用作香料)和崩解助剂(例如，微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、淀粉羟乙酸钠、预胶凝化玉米淀粉等)。此类添加剂是本领域技术人员已知的，且可以以本领域已知的量和形式存在。

烟草可形成为再生烟草。因此，在一个实施例中，本文所描述的方法可以用于制备再生烟草，诸如再生烟草(叶)片。这些片是可以用再循环的烟草碎料、烟草茎和“等级烟草”制成的纸样材料，所述“等级烟草”由在烟草加工的任何阶段收集的通常小于30目大小的烟草颗粒组成。提取烟草副产物中的可溶性化学物质，将得自提取的残余烟草纤维加工成纸，然后将呈浓缩形式的提取的材料重新施加于纸上来制得再生烟草。通常可以以多种方式形成再生烟草。例如，在一个实施例中，可以利用带浇铸来形成再生烟草。带浇铸通常采用精细粉碎的烟草部分和粘合剂的浆，所述浆涂布在钢带上，然后干燥。干燥以后，将片与天然烟草条掺合或撕碎并用在各种烟草产品中，包括作为香烟填充物。用于生产再生烟草的方法的一些例子描述在US3,353,541、US3,420,241、US3,386,449、US3,760,815和US4,674,519中。还可以通过造纸方法形成再生烟草。根据该方法用于形成再生烟草的方法的一些例子描述在US3,428,053、US3,415,253、US3,561,451、US3,467,109、US3,483,874、US3,860,012、US3,847,164、US4,182,349、US5,715,844、US5,724,998和US5,765,570中。例如，使用造纸技术的再生烟草的形成可包含以下步骤：将烟草与水混合、从其提取可溶性的成分、浓缩可溶性的成分、精制烟草、形成网、重新施加浓缩的可溶性的成分、干燥及捶打。可以将多种成分(诸如味道或颜色处理剂)施加于网。

可以将通过本文所述的方法得到的或可得到的烟草形成烟草片，诸如再生烟草片。根据所述实施例，所述方法可以包括以下步骤：(a)根据本文所述的方法得到烟草材料，诸如烟草匀浆物；(b)制备烟草匀浆物的浆；(c)浇铸烟草匀浆物的浆；和(d)干燥烟草匀浆物的浆以形成再生烟草片。根据另一个实施例，所述方法可以包括以下步骤：(a)根据本文所述的方法得到烟草材料(诸如烟草匀浆物)及制备烟草浆；(b)浇铸烟草匀浆物的浆；和(c)干燥烟草匀浆物的浆以形成烟草片。

使用本领域已知的任何浇铸或造纸方法，可以进行浇铸烟草匀浆物的浆的步骤。作为例子，浇铸方法描述在US5,724,998和US5,584,306中；造纸方法描述在US4,341,228、US5,584,306和US6,216,706中。浇铸方法通常包括将浆浇铸在连续不锈钢带上、干燥浇铸的浆以形成再生烟草片以及取下所述片。造纸方法通常包括将水性浆从头盒浇铸到网筛上用于形成期望的片。可以将水性浆分离成可溶性部分和纤维部分。将水从纤维部分排出，并随后处理和干燥如此形成的片。

烟草浆可以进一步包括一种或多种粘合剂，诸如树胶和果胶。如上所述，用于制备再生烟草片的烟草浆可以进一步包括常见的添加剂，所述添加剂包括(但不限于)以下组分中的一种或多种以及这些的组合：木纤维素纤维、气溶胶形成剂、糖以及香料和粘合剂。上述列表的添加剂是本领域技术人员已知的，且可以以本领域已知的量和形式存在于这些水性浆中。

制备后，可以以与完整叶烟草类似的方式切割本文描述的再生烟草片，以产生适合用于香烟和其它烟草产品的烟草填充物。可以将本文描述的再生烟草片用机械指进一步撕扯(trash)或剥离成类似于天然烟草薄片条的一定大小的块，或切割成在侧边为约50-100mm的菱形块。本文描述的再生烟草片块可以与其它烟草(诸如烟道烘烤的烟草、白肋烟草、马里兰烟草、东方烟草、稀有烟草、专门烟草、膨胀的烟草等)进一步掺合。用于制造特定香烟品牌的烟草混合物中的每类烟草的精确量随品牌而不同。参见，例如，TobaccoEncyclopaedia,Voges第44-45页(1984),Browne,TheDesignofCigarettes,第3版,第43页(1990)和TobaccoProduction,ChemistryandTechnology,Davis等人(编)第346页(1999)。然后可以将整个混合物撕碎成切割填充物并掺入烟草产品中。

根据另一方面，提供一种用于掺合其中掺合至少两种不同类型的烟草以形成烟草混合物的烟草的方法。各种烟草混合物具有用于掺合不同烟草类型的不同方法。通过实例的方式，烟草类型可为白肋烟草、烤烟、香料烟草、淡色烟草及再生烟草。白肋烟草、烤烟和香料烟草为特定类型的烟草，而淡色烟草为烤烟和香料烟草的预掺合。根据本发明，提供第一(种类型的)干制烟草植物材料，且减少其中的木质素的量。可使用本文所述的任何方法减少木质素的量。可测量第一干制烟草植物材料的总NNK及/或结合基质的NNK含量及可选择其中所述总NNK及/或结合基质的NNK含量相较最初提供的第一干制烟草植物材料减少的干制烟草植物材料以进一步使用。随后提供较第一干制烟草植物材料的总NNK及/或结合基质的NNK具有更高总及/或结合基质的NNK含量的第二干制烟草植物材料。在一些实施例中，可能已知此材料的总及/或结合基质的NNK含量，因此将不需要这些值的测量。在其它实施例中，此材料的总及/或结合基质的NNK含量可能未知，因此将需要测量。因此，在所述方法中，测量第二干制烟草植物材料中的总及/或结合基质的NNK含量为可选步骤。可使用所述领域中众所周知的方法将从这些步骤得到的第一及第二干制烟草植物材料掺合在一起。任选地，可测量最终掺合的烟草植物材料中的总及/或结合基质的NNK含量。根据所述方法，可得到其中最终掺合的烟草植物材料的总及/或结合基质的NNK含量低于第二干制烟草植物材料的掺合烟草植物材料。有利地，所述方法可用于提供烟草材料的混合物，其中所述混合物的总体NNK含量减少。基本上，其中木质素的量已经减少的烟草材料用于稀释或减少掺合烟草材料中的总体NNK含量。

根据本文公开内容得到的或可得到的烟草材料还可以用在烟草切割填充物中和用在从切割填充物的烟丝条形成的吸烟制品中。常规地，用于吸烟制品的切割填充物烟草产品主要从烟草叶的薄片部分形成，所述薄片部分在捶打过程中与叶的茎部分分离。在薄片已经除去和分离以后剩余的大多数茎部分没有使用。为了增加商业上可以使用的烟草材料的量，可以将一些烟草茎与薄片一起加回到切割填充物中。为了改善用在切割填充物中的烟草茎的味道和燃烧特征，经常首先对茎进行一种或多种处理操作，所述操作可以包括本文描述的操作。可以在已经经受本公开内容的方法的烟草茎上进行滚轧步骤。可以将茎滚轧至期望的厚度，诸如约0.6mm至0.8mm的平均厚度。在随后的加工和贮存步骤中，可以使茎膨胀至约0.8mm至约1.0mm的最终厚度。滚轧以后，将茎干燥并转移至烟草生产工厂，在此处将它们切割并加入烟草切割填充物中。在某些情况下，滚轧步骤可以可替换地作为切割填充物的在线生产方法的一部分而被包括。通常，在滚轧之前烟草茎的含水量是约28％至约34％烘箱挥发物，以便防止对茎的结构的损伤。如果必要的话，在滚轧之前可以调节烟草茎，以便将含水量增加至此水平。调节烟草茎的已知方法包含使所述茎与水、蒸汽、或水和蒸汽的混合物接触。在其中在线包括滚轧步骤和使用干燥的茎的方法中，调节步骤通常进行的更久，且可能需要浸泡步骤，在浸泡步骤中在滚轧之前将茎在水中浸泡数小时。可以使用一步滚轧法滚轧烟草茎，以将茎的厚度减小至期望的平均厚度。滚轧以后，可以将茎切成0.1mm至0.2mm的切割宽度。然后任选地使用已知的茎膨胀技术使经切割滚轧的茎膨胀，然后干燥。在将茎预滚轧和干燥的情况下，通常必须在切割之前调节茎，以便使烟草茎的含水量增加回28％至34％烘箱挥发物。这会增加烟草茎的柔软性，以便限制在切割过程中茎的损伤或断裂。最后，将经切割滚轧的茎与烟草切割薄片和任何另外的烟草材料组合，以便形成具有至少5重量％的经切割滚轧的烟草茎的切割填充物。

因而，在另一个方面，提供了用于制备用作烟草切割填充物的烟草的方法，所述方法包括下述步骤：(a)进行如本文所述的方法；和(b)轧制及切割烟草材料以用作烟草切割填充物。还描述了处理用在烟草切割填充物中的烟草材料(诸如烟草茎)的方法，所述方法包括下述步骤：(a)进行如本文所述的方法；(b)轧制烟草材料；(c)切割轧制的烟草材料；和(d)任选地干燥切割的轧制茎。可以将经滚轧的烟草茎与烟草薄片组合，使得所述步骤在组合的烟草茎和薄片上进行。所述切割步骤可以包括将经滚轧的茎切割成约0.3mm至1.3mm的切割宽度。从烟草叶除去茎；将所述茎切割成约15mm至80mm的平均长度；和将所述茎滚轧成0.1mm至0.5mm的厚度。还提供了产生包括滚轧烟草茎的切割填充生的方法，所术方法包括：使用本文描述的方法处理烟草茎；和将经处理的茎与烟草薄片、膨胀的烟草或再生烟草中的至少一类掺合以产生切割填充物。

通过该方法得到的或可得到的烟草切割填充物可以包含至少60重量％且优选至少80重量％的烟草薄片，所述烟草薄片具有0.8mm至1.1mm(适当地，约0.9mm)的平均切割宽度和约0.2mm的平均厚度。烟草切割填充物可以包含至多95重量％的烟草薄片，所述烟草薄片具有约0.8mm至1.1mm、更适当地约0.9mm的平均切割宽度和约0.2mm的平均厚度。因此，切割填充物中的烟草薄片的颗粒具有与烟草茎的颗粒类似的尺寸。这样，烟草茎在视觉上不会不同于烟草薄片，甚至在高包含比率下。另外，可以有利地运输和有效地加工烟草茎和薄片的混合物，而没有茎的显著沉降。适当地，经切割滚轧的烟草茎的平均切割宽度是在切割填充物内的烟草薄片的平均厚度的约0.1mm内，更适当地在约0.05mm内。可以将切割填充物掺入多种吸烟制品中。例如，可以将切割填充物用在可燃烧的吸烟制品(诸如过滤嘴香烟、小雪茄或雪茄)的烟丝条中。可替换地，可以使用切割填充物来在基于蒸馏的吸烟制品或电加热吸烟系统中提供烟草气溶胶生成基质。可替换地，可以将切割填充物用作自卷(roll-your-own)产品，或松烟产品，例如，用在烟斗中。

烟草材料可以掺入多种可消费的产品(诸如烟草产品)中。还包括用于制备这样的烟草产品的方法。烟草产品包括(但不限于)吸烟制品或可抽吸的制品和无烟烟草产品，包括非燃烧的产品、加热的产品和产生气溶胶的产品。吸烟制品或可抽吸的制品的非限制性例子包括香烟、小雪茄、雪茄和烟斗烟草。无烟烟草产品的非限制性例子包括嚼烟、鼻烟和用在产生气溶胶的产品中的基质。无烟烟草产品可以包括任意形式的烟草，包括作为干燥的颗粒、碎片、微粒、粉末或浆，沉积在其它成分上、混合在其它成分中、被其它成分包围或以其它方式与其它成分组合，所述其它成分呈任意形式，诸如薄片、膜、突片、泡沫或珠子。可以将无烟烟草产品的液体内容物包含在装置中或包封在诸如珠子等形式中，以阻碍与水溶性包装纸的相互作用。所述包装纸可以成形为袋以部分地或完全地包封包含烟草的组合物或作为粘合剂起作用以将烟草的多个突片、珠子或薄片保持在一起。示例性的用于构造包装纸的材料包括膜组合物，其包括HPMC、CMC、果胶、海藻酸盐、普鲁兰糖和其它商业可得到的、可食用的成膜用聚合物。其它包装材料可以包括从明胶、HPMC、淀粉/角叉菜胶或其它商购可得的材料生产的预形成的胶囊。这样的包装材料可以包括烟草作为成分。不可经口崩解的包装纸可以由织造的或非织造的编织物组成，由包被的或未包被的纸组成，或由穿孔的或以其它方式具有多孔的塑料膜组成。包装纸可以包含矫味剂或着色剂。利用商业包装领域的技术人员已知的任何方法，包括诸如泡罩包装(其中小包可以用垂直成形/填充/密封包装机形成)等方法，可以将无烟产品与包装纸装配在一起。

当与源自对照烟草植物材料的可消费产品相比较时，在这些可抽吸物品和无烟产品及其气雾中的结合基质的NNK量可低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％，例如低约200％或300％。游离的NNK的量可能基本上未改变。

这些可抽吸制品、无烟产品和气溶胶等中的结合基质的NNK的量可为约3500ng/g或更少、或约3000ng/g或更少、或约2500ng/g或更少、或约2000ng/g或更少、或约1500ng/g或更少、或约1000ng/g或更少、或约500ng/g或更少。

这些可抽吸制品和无烟产品等中的游离的NNK的量可为约330ng/g或更少、约300ng/g或更少、约250ng/g或更少、约200ng/g或更少、约150ng/g或更少、约100ng/g或更少或约50ng/g或更少。

这些可抽吸制品、无烟产品和气溶胶等中的NNN的量可为约1700ng/g或更少、约1500ng/g或更少、约1300ng/g或更少、约1100ng/g或更少、约1000ng/g或更少或约500ng/g或更少。

这些可抽吸制品和无烟产品等中的尼古丁的量可为约2600ng/g或更少、约2300ng/g或更少、或约2100ng/g或更少、或约2000ng/g或更少或约1900ng/g或更少，或约1800ng/g或更少。

这些可抽吸制品和无烟产品等中的木质素的量可为干制植物组织的总干重的约6.5％或更少、干制植物组织的总干重的约6％、干制植物组织的总干重的约5％、干制植物组织的总干重的约4％或干制植物组织的总干重的约3％或更少。

在一个实施例中，这些可抽吸制品和无烟产品等中的结合基质的NNK的量为约3500ng/g或更少，游离的NNK的量为约300ng/g或更少，NNN的量为约1700ng/g或更少，木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约6.4％或更少，且尼古丁的量为约2600μg或更少。

在一个实施例中，可抽吸制品或无烟产品等包括约3500ng/g或更少的结合基质的NNK。合适地，游离的NNK的量为约300ng/g或更少。合适地，NNN的量为约1700ng/g或更少。合适地，木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约6.4％或更少。合适地，尼古丁的量为约2600μg或更少。合适地，平均粒径为约0.5mm或更大。

在另一实施例中，可抽吸制品或无烟产品等包括约1900ng/g或更少的结合基质的NNK。合适地，游离的NNK的量为约250ng/g或更少。合适地，NNN的量为约1270ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约4.4％或更少。合适地，尼古丁的量为约2300μg或更少。合适地，平均粒径在约0.85mm与约1mm之间。

在另一实施例中，可抽吸制品或无烟产品等包括约1600ng/g或更少的结合基质的NNK。合适地，游离的NNK的量为约200ng/g或更少。合适地，NNN的量为约1100ng/g或更少。合适地，此干制植物组织中的木质素的量为干制植物组织的总干重含量的约3％或更少。合适地，尼古丁的量为约2100μg或更少。合适地，平均颗粒大于约1mm。

烟草材料可以源自烟草植物，所述烟草植物包括烟草属的植物，烟草属的不同种，包括黄花烟草(N.rustica)和普通烟草(N.tabacum)。烟草材料可以源自烟草属种的品种，通常被称作烟道品种或浅色(bright)品种、白肋烟草品种、深色品种和香料烟草/土耳其烟草品种。在一些实施例中，所述烟草材料源自白肋烟草、弗吉尼亚烟草、烟道烘烤的烟草、晾干的烟草、火烤的烟草、香料烟草或深色烟草植物。在一些实施例中，所述烟草材料源自例如下述品种中的一种或多种：普通烟草AA37-1、普通烟草B13P、普通烟草Xanthi(Mitchell-Mor)、普通烟草KTD#3杂种107、普通烟草Bel-W3、普通烟草79-615、普通烟草SamsunHolmesNN、得自杂交普通烟草BU21x普通烟草HojaParado的F4、第97系、普通烟草KTRDC#2杂种49、普通烟草KTRDC#4杂种110、普通烟草白肋烟草21、普通烟草PM016、普通烟草KTRDC#5KY160SI、普通烟草KTRDC#7FCA、普通烟草KTRDC#6TN86SI、普通烟草PM021、普通烟草K149、普通烟草K326、普通烟草K346、普通烟草K358、普通烟草K394、普通烟草K399、普通烟草K730、普通烟草KY10、普通烟草KY14、普通烟草KY160、普通烟草KY17、普通烟草KY8959、普通烟草KY9、普通烟草KY907、普通烟草MD609、普通烟草McNair373、普通烟草NC2000、普通烟草PG01、普通烟草PG04、普通烟草P01、普通烟草P02、普通烟草P03、普通烟草RG11、普通烟草RG17、普通烟草RG8、普通烟草SpeightG-28、普通烟草TN86、普通烟草TN90、普通烟草VA509、普通烟草AS44、普通烟草BanketA1、普通烟草BasmaDramaB84/31、普通烟草BasmaIZichnaZP4/B、普通烟草BasmaXanthiBX2A、普通烟草Batek、普通烟草BesukiJember、普通烟草C104、普通烟草Coker319、普通烟草Coker347、普通烟草CriolloMisionero、普通烟草PM092、普通烟草Delcrest、普通烟草Djebel81、普通烟草DVH405、普通烟草GalpaoComum、普通烟草HB04P、普通烟草HicksBroadleaf、普通烟草KabakulakElassona、普通烟草PM102、普通烟草KutsageE1、普通烟草KY14xL8、普通烟草KY171、普通烟草LABU21、普通烟草McNair944、普通烟草NC2326、普通烟草NC71、普通烟草NC297、普通烟草NC3、普通烟草PVH03、普通烟草PVH09、普通烟草PVH19、普通烟草PVH2110、普通烟草RedRussian、普通烟草Samsun、普通烟草Saplak、普通烟草immaba、普通烟草Talgar28、普通烟草PM132、普通烟草Wislica、普通烟草Yayaldag、普通烟草NC4、普通烟草TRMadole、普通烟草PrilepHC-72、普通烟草PrilepP23、普通烟草PrilepPB156/1、普通烟草PrilepP12-2/1、普通烟草YakaJK-48、普通烟草YakaJB125/3、普通烟草TI-1068、普通烟草KDH-960、普通烟草TI-1070、普通烟草TW136、普通烟草PM204、普通烟草PM205、普通烟草Basma、普通烟草TKF4028、普通烟草L8、普通烟草TKF2002、普通烟草TN90、普通烟草GR141、普通烟草Basmaxanthi、普通烟草GR149、普通烟草GR153和普通烟草PetitHavana。所公开的组合物和方法可应用于烟草属的任何物种，包括黄花烟草和普通烟草(例如LAB21、LNKY171、TI1406、巴斯玛、Galpao、Perique、Beinhart1000-1和Petico)。其他物种包括无茎烟草(N.acaulis)、尖叶烟草(N.acuminata)、尖叶多花烟草(N.acuminatavar.multiflora)、非洲烟草(N.africana)、花叶烟草(N.alata)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(N.arentsii)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、贝纳莫特氏烟草(N.benavidesii)、本赛姆氏烟草(N.benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N.cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(N.debneyi)、木丝烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、杂交烟草(N.hybrid)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N.knightiana)、郎氏烟草(N.langsdorffii)、渐尖叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.longiflora)、海滨烟草(N.maritima)、特大管烟草(N.megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctiflora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布斯特烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(N.occidentalissubsp.hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆锥烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、波缘烟草(N.repanda)、莲座烟草(N.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草(N.rosulatasubsp.ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setchellii)、拟似烟草(N.simulans)、茄叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(N.spegazzinii)、斯托可通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草(N.sylvestris)、拟穗状烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N.tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、波叶烟草(N.undulata)、颤毛烟草(N.velutina)、序叶烟草(N.wigandioides)和花烟草(N.xsanderae)。

本文还考虑使用烟草栽培变种和优良烟草栽培变种。特别有用的普通烟草品种包括白肋烟型、深型、烤烟型和东方型烟草。品种或栽培变种的非限制性例子是：品种或栽培变种的非限制性例子是BD64、CC101、CC200、CC27、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CD263、DF911、DT538LCGalpao烟草、GL26H、GL350、GL600、GL737、GL939、GL973、HB04P、HB04PLC、HB3307PLC、杂交403LC、杂交404LC、杂交501LC、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、LittleCrittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、窄叶Madole、窄叶MadoleLC、NBH98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NCBH129、NC2002、NealSmithMadole、OXFORD207、PD7302LC、PD7309LC、PD7312LC‘'Periq’e'烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-11、R7-12、RG17、RG81、RGH51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、SpeightG-28、SpeightG-70、SpeightH-6、SpeightH20、SpeightNF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN97、TN97LC、TND94、TND950、TR(TomRosson)Madole、VA309、VA359、AA37-1、B13P、Xanthi(Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、SamsunHolmesNN、KTRDC2号杂交49、白肋21、KY8959、KY9、MD609、PG01、PG04、PO1、PO2、PO3、RG11、RG8、VA509、AS44、BanketA1、巴斯玛DramaB84/31、巴斯玛IZichnaZP4/B、巴斯玛XanthiBX2A、Batek、BesukiJember、C104、Coker347、CriolloMisionero、Delcrest、Djebel81、DVH405、Comum、HB04P、希克斯阔叶、KabakulakElassona、KutsageE1、LABU21、NC2326、NC297、PVH2110、红色俄罗斯、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar28、Wislica、Yayaldag、PrilepHC-72、PrilepP23、PrilepPB156/1、PrilepP12-2/1、YakaJK-48、YakaJB125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、巴斯玛、TKF4028、L8、TKF2002、GR141、巴斯玛xanthi、GR149、GR153、PetitHavana。即使本文未特别指明，也考虑上述的低转化亚变种。

提供以下实施例作为例证，而不是作为限制。除非另有说明，本发明采用分子生物学和植物生物学的常规技术和方法。

实施例

实施例1

用于分析烟草中的游离的和基质结合的NNK的方法

通过在大约室温下摇动约1小时，用约30mLTris-HCl缓冲液(50mM；pH7.4)提取烟草样品的等分试样(例如，约750mg)。加入内部标准品(100ng/mLNNK-d4)。使用0.2μM过滤器过滤提取物的样品(0.4mL)，并使用超高效液相色谱法-串联质谱法(UPLC-MS/MS)分析NNK含量。从这些提取物浓度计算的样品浓度对应于样品中的“游离的NNK”浓度。处理提取混合物(例如，通过加热至约130℃保持约4小时)和过滤提取物的等分试样以后，再次通过UPLC-MS/MS测量NNK浓度。“基质结合的NNK”浓度是“总NNK”和“游离的NNK”浓度之间的差异。

“总NNK”提取的一种替代方法包括用浓HCl酸化提取混合物(例如，3mL37％HCl加入30mL中)和在80℃下温育48小时。在过滤及UPLC分析前通过将NaOH溶液(6N，40μL)及氢氧化镁悬浮液(10％；40μL)添加至320μL的提取物中和酸性提取物。

实施例2

UPLC分析

使用的柱是WatersAcquityBEHC18,1.7μm,2.1×50mm。使用的洗脱液是：(A)碳酸氢铵(10mM；用氨调至pH9.8)+2％(v/v)乙腈；(B)乙腈。使用的梯度是0min-5％B；0.5min-5％B；3.3min-18.3％B。使用的流量是0.5mL/min。使用的柱温是50℃。

实施例3

MS/MS方法学

使用下述MRM转变，在WatersTQ波谱仪上进行此分析：NNK：208.2→122.2；停留时间100ms；NNK-d4：212.2→126.2；停留时间100ms；毛细管电压：0.6kV；锥电压：25V；碰撞能：11eV；源温度：120℃；去溶剂化温度：400℃；去溶剂化气流：800L/h。

实施例4

白肋茎的木质化和非木质化组织中的结合基质的NNK的分布

约2克干制白肋烟草的中脉通过手分离为内部木质化组织(总干重的36％)和外部非木质化组织(总干重的64％)。在这些样本中的每一个中，通过UPLC-MS分析游离的NNK和总NNK的浓度，如上文所述。结合基质的NNK计算为游离的NNK与总NNK浓度之间的差异。基于使用巯基乙酸的衍生化使用光度法量化木质素含量(见Brinkmann等人的(2002)J.Chem.Ecol.,28,2483-2501)。

图1的结果显示游离的NNK、结合基质的NNK和干制白肋茎的木质化(L)和非木质化(NL)组织中的木质素的分布。图2为显示木质化(L)及非木质化(NL)组织的含水干制白肋茎秆的横截面图。使用间苯三酚将木质化组织染成红色。图3中的结果显示在使用亚硝酸钠溶液进行亚硝基化之后绿色中脉的木质化和非木质化组织的结合基质的NNK含量。

这些结果显示结合基质的NNK主要分布于白肋烟草茎和中脉的木质化组织中。

实施例5

通过冻干、研磨和尺寸分离的自白肋茎的具有低结合的NNK含量的部分的富集

白肋茎(52g)的样本使用水(350mL)加湿且冻干。所得材料(12g)的一部分通过使用钢球(2个球，直径为2cm；300rpm；15min)的振动进行研磨，且使用振筛机分离为具有大于1mm至小于0.25mm的不同粒径的碎片。

图4和表1显示研磨冻干白肋茎的筛分部分中的游离的和结合基质的NNK、NNN、木质素和尼古丁水平。图5和表1中游离和结合基质的NNK的分析指示木质素含量(作为每一部分的％干重)和结合基质的NNK含量两者在具有大于0.5的粒径的部分中减少，包括具有0.5mm至0.85mm、0.85mm至1mm及大于1mm的粒径的部分。图5显示木质素含量与结合基质的NNK很好关联，因此确定木质素和结合基质的NNK的共同定位。

实施例6

绿色TN90中脉和白肋茎中的结合基质的NNK前体的定位

在TN90中脉的厚壁和非厚壁组织中测量结合基质的NNK的相对分布。预测结合基质的NNK结合至木质素预测木质化厚壁组织中的此前体的更高浓度。在第二实验中，研究游离的和结合基质的NNK在(干制)白肋茎的厚壁和非厚壁组织中的相对分布。

材料与方法

绿色中脉

15片成熟的TN90叶子的中脉(只有主要部分)手动地在厚壁组织(S)(中脉的“中心”)和非厚壁组织(NS)中分离。两者均冻干及很好地研磨。通过使用40mL甲醇/水(1:3)提取1g达三次(室温下达1小时)及在冻干后对不可溶的材料(指定为SW和NSW)进行称重来确定两种材料的不溶于水的部分。使用以下方法来测量S和NS(n＝5)的假氧化尼古丁(PON)和尼古丁分析。通过在室温下使用含有作为内部标准(200ng/mL)的PON-methyl-d₃的甲醇/水(4:1)振动45分钟来提取精细粉末状的植物材料(～20mg)。在过滤(0.2μm)样本经受LC-MS分析后，使用以下条件：色谱柱超高效液相色谱仪BEHC18色谱柱(1.7μm，50×2.1mm；水)；色谱柱温度：50℃；洗脱剂使用具有乙腈的NH₃(98:2，v/v；洗脱剂A)将含水碳酸氨铵调整至pH9.8；乙腈(洗脱剂B)；梯度：0min–0％B，0.5mL/min；0.5min–0％B，0.5mL/min；6min–30％B，0.5mL/min；MS检测:PONm/z179.2àm/z106.1；PON-甲基-d₃m/z182.2àm/z106.1；UV检测：260nm。分别在2.6分钟和4.1分钟后洗脱PON和尼古丁。针对尼古丁的量化，使用260nm处的峰值和外部校准。为了估计S、NS、SW和NSW中的结合基质的NNK前体的含量，通过使用10mL水振动、离心和洗涤/离心四次在室温下于NaNO2溶液(1.5mL(在水中10mg/mL))中培养4小时亚硝化这些材料的等分试样(～20mg；n＝5)。接着，使用本文所述的方法，每一亚硝化样本的离心沉积物在4mLTris-HCl缓冲液(50mMpH7.5；100ng/mL下具有NNK-d4和NNN-d4)中占据，经热压处理(130℃下进行4小时)及分析NNK含量。

干制白肋茎

白肋茎样本(2g＝约5cm四片)手动地分离为外部(非木质化)组织(CNS)和内部(木质化)部分(CS)。两个样本在混合磨中精细研磨(莱驰(Retsch)“Tissuelyzer”达2.5分钟，50s-1)。此举导致CNS和CS粉末分别为1183mg和651mg。在室温下使用1.5mL三羟甲基氨基甲烷缓冲液(+IS)提取约50mg等分试样(n＝5)达1小时后确定两个样本中的游离的NNK。在5mL三羟甲基氨基甲烷缓冲液(+IS)中的约50mg等分试样(n＝5)的高压釜提取(130℃下进行4小时)后确定总NNK。

结果

此实验的结果显示于表2和图6中。在亚硝化和洗涤之后，相较中脉的外层(NS)，高7倍的结合基质的NNK的浓度发现于厚壁组织(S)中。PON和尼古丁两者在NS中较在S中高两倍。这些人工亚硝化实验的结果通过商用干制白肋茎样本的木质化(CS)和非木质化(CNS)部分中的结合的NNK水平证实。由于游离的NNK在CS中高两倍，结合基质的NNK在CS中高7倍。尼古丁和NNN水平在CS中较CNS高且小于NNK。

结论

绿色中脉的木质化厚壁组织中存在高浓度结合基质的NNK前体，这表明结合基质的NNK共价地或非共价地链接至木质素。

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表1

表2