调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法

摘要

本发明公开了一种调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，向排酸后的畜禽肌肉中添加一定比例的食盐，腌制后可不同程度降低蛋白质的磷酸化水平。本发明通过添加肉制品中常用的食盐来调控蛋白质的磷酸化，添加量在适当范围内，食盐安全无毒，在利用该方法调控蛋白质磷酸化的同时还可以改善肉的品质。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法。

背景技术

蛋白质常见的修饰方式有磷酸化、乙酰化、泛素化、甲基化等，在众多的蛋白质修饰中，磷酸化修饰是最常见、最重要的一种，肌肉中的大部分肌浆蛋白和肌原纤维蛋白受蛋白质磷酸化和去磷酸化过程的影响。目前常用的调控磷酸化的方法有酶法、化学法，但是酶法改性成本高，不适宜大批量的生产；而化学改性常用的磷酸化改性试剂有磷酰氯、五氧化二磷和磷酸盐等，但是修饰后的蛋白质的安全问题有待进一步确证，因此寻求一种安全无毒的磷酸化改性试剂非常有必要。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，其通过添加肉制品中常用的食盐来调控蛋白质的磷酸化，在适当范围内，食盐安全无毒，利用该方法调控磷酸化的同时改善肉的品质。

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，向排酸后的畜禽肌肉中添加一定比例的食盐，腌制后检测肌肉肌原纤维蛋白磷酸化水平。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，食盐的添加量为不大于畜禽肌肉重量的5％。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，食盐的添加量为畜禽肌肉重量的3％。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，腌制的条件为：常压，4℃，8～16h。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，腌制的条件为：常压，4℃，16h。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，腌制的条件为：脉动真空，1.5～4.5h。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，向畜禽肌肉中添加食盐腌制前，先将畜禽肌肉绞碎。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，肌肉腌制后若不能及时处理样品，需将样品液氮速冻后保存在-79℃±1℃环境中。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，畜禽为反刍动物。

优选的是，所述的调控肌肉蛋白质磷酸化水平的方法，反刍动物为羊。

本发明至少包括以下有益效果：

第一、本发明针对畜禽动物宰后肌肉中蛋白质磷酸化水平的调控，主要通过添加无毒无害的试剂食盐，进行调控肌肉蛋白质的磷酸化水平，经过反复试验证明，添加食盐可以显著降低肌肉蛋白质的磷酸化水平，重复性好，实验所得磷酸化电泳图谱条带清晰，食盐在安全范围内对人体无毒无害，可直接应用于羊及其他反刍动物的磷酸化改性研究；

第二、由于腌制后取样，包括制备提取蛋白的液体都需要时间，不能即刻提取蛋白，所以食盐腌制后速冻保存，保证腌制终止，液氮速冻是为了立即终止腌制过程，食盐的添加量为畜禽肌肉重量的3％时，肌肉蛋白质的磷酸化水平最低，根据文献报道，磷酸化水平低的肉嫩度高，从而有利于肉品质的改善；脉动真空腌制1.5～4.5h有利于提高肉的保水性，有利于肉品质的改善；

第三、本发明可以通过调控蛋白质的磷酸化水平，进而调控肉的品质，尤其适用于羊肉，操作方法简单、效果显著，便于工业化生产，有很广的市场前景和应用价值。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例1不同腌制时间的磷酸化肌原纤维蛋白电泳图谱；

图2为本发明实施例1不同腌制时间的肌原纤维全蛋白电泳图谱；

图3为本发明实施例1不同腌制时间的蛋白质磷酸化水平变化；

图4为本发明实施例2～6及对比例1不同食盐添加量的磷酸化肌原纤维蛋白电泳图谱；

图5为本发明实施例2～6及对比例1不同食盐添加量的肌原纤维全蛋白电泳图谱；

图6为本发明食盐添加量的不同食盐添加量的蛋白质磷酸化水平变化；

图7为本发明不同腌制方法下肉的保水性的变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实施例1>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)添加后腿肉样品质量的2％的食盐生产中常用，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)并分别于腌制0h，2h，4h，6h，8h，16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<实施例2>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)添加后腿肉样品质量的1％的食盐，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)于腌制16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<实施例3>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)添加后腿肉样品质量的2％的食盐，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)于腌制16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<实施例4>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)添加后腿肉样品质量的3％的食盐，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)于腌制16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<实施例5>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)添加后腿肉样品质量的4％的食盐，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)于腌制16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<实施例6>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)添加后腿肉样品质量的5％的食盐，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)于腌制16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<对比例1>

a)于屠宰场采集羊肉样品，0～4℃排酸24h后，于-79℃±1℃条件下保存备用，取出-79℃±1℃条件下保存的后腿肉样品，于室温下解冻后，用绞碎机绞碎；

b)不添加食盐(添加0％的食盐含量)，在4℃恒温条件下腌制16h；

c)于腌制16h后进行取样，液氮速冻后，于-79℃±1℃超低温冰箱中保存备用。

<磷酸化水平测定试验>

蛋白质磷酸化水平的测定采用荧光试剂染色的方法，下述试验均采用himacCR22GII高效冷冻离心机和Bio-Rad单向电泳系统。

分别取实施例1～6，对比例1的-80℃-79℃±1℃下保存的肌肉样品，冷冻状态下称取1.0g，装至离心管中，加入6ml预冷的缓冲液(100mMTris(pH8.3),10mMDTT，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂)，冰上匀浆30s，于25,000×g低温4℃离心机中离心20min，倒掉上清液，将沉淀溶解于5％SDS溶液(60℃)中，并匀浆30s，匀浆液在80℃条件下加热20min，制备肌原纤维蛋白溶液；

(1)蛋白质定量：采用BCA法测定蛋白浓度；

(2)SDS-PAGE电泳：采用12％的分离胶和4％的浓缩胶(Acr：Bis＝37.5:1)，每个泳道均加入5μg蛋白样品；电泳初始电压设置为70V，当蛋白条带完全进入浓缩胶后将电压设置为110V，直至溴酚蓝染料迁移至胶底边缘后结束电泳；

(3)染色：电泳结束后卸下胶板，取出胶进行染色，用PRO-QDiamond染液特异性染色磷酸化蛋白质，SYPRORuby染液识别全蛋白，染色全过程如图1所示，染色后使用ChemiDoc^TMMP成像系统(BIO-RAD,USA)对染色后的凝胶进行拍照。

表1SDS-PAGE电泳凝胶荧光染色全过程

如图1所示，实施例1不同腌制时间的磷酸化肌原纤维蛋白电泳图谱，通过使用PRO-Q荧光染液特异性识别磷酸化的肌原纤维蛋白质，图中显示的条带即为磷酸化的肌原纤维蛋白质，电泳图中能看到清晰的磷酸化肌原纤维蛋白质条带。

如图2所示，实施例1不同腌制时间的肌原纤维全蛋白电泳图谱，通过使用RUBY荧光染液识别肌原纤维全蛋白，图中显示的条带即为肌原纤维全蛋白。

如图3所示，实施例1的2％食盐(生产中常规的食盐添加量)腌制过程中肌原纤维蛋白质的整体磷酸化水平的变化趋势，通过quantityone软件分析条带灰度值，样品的整体蛋白质磷酸化水平为该泳道所有条带的Pro-QDiamond染色的条带光密度值(P)之和与SYPRORuby染色的条带光密度值(T)值之和的比值(P/T值)，代表肌原纤维蛋白质的整体磷酸化水平。腌制过程中肌原纤维蛋白质整体磷酸化水平呈现下降趋势，8h和16h的P/T值均与0h有显著差异，在腌制16h时达到最低，因此腌制8h和16h均能达到降低蛋白质磷酸化水平的效果。实施例1通过采用常规的食盐添加量做定量，不同腌制时间做变量，得到最佳腌制时间16h，为确定最佳食盐添加量提供基础。

如图4所示，实施例2～6以及对比例1不同食盐添加量的磷酸化肌原纤维蛋白电泳图谱，通过使用PRO-Q荧光染液特异性识别磷酸化的肌原纤维蛋白质，图中显示的条带即为磷酸化的肌原纤维蛋白质，电泳图中能看到清晰的磷酸化肌原纤维蛋白质条带。

如图5所示，实施例2～6以及对比例1不同食盐添加量的肌原纤维全蛋白电泳图谱，通过使用RUBY荧光染液识别肌原纤维全蛋白，图中显示的条带即为肌原纤维全蛋白。

如图6所示，实施例2～6以及对比例1的不同食盐添加量腌制条件下肌原纤维蛋白质的整体磷酸化水平，实施例2～6以及对比例1通过采用最佳腌制时间做定量，不同食盐添加量做变量，实施例2～6肌原纤维蛋白质的整体磷酸化水平显著低于不添加食盐的对照组1，尤其是添加量为3％的食盐的实施例4达到最低，说明添加量为3％的食盐显著降低了蛋白质磷酸化水平，能够有效的起到调控蛋白质磷酸化的作用，食盐可以作为一种安全无毒的调控蛋白质磷酸化的试剂。

<腌制条件测定试验>

<对比例2>

a)于屠宰场采集羊背最长肌样品，0～4℃排酸24h后，切成3cm×3cm×2cm的块状；

b)在15％的NaCl(w/w)溶液中腌制，采用脉动真空腌制的方式进行腌制，脉动真空腌制的条件设置为：先真空-70kPa下15min，然后常压101kPa下15min，循环进行；

c)分别于腌制0，1.5，3，4.5h时取样，测定肉的持水力。

<对比例3>

a)于屠宰场采集羊背最长肌样品，0～4℃排酸24h后，切成3cm×3cm×2cm的块状；

b)在15％的NaCl(w/w)溶液中腌制，采用常压腌制的方式进行腌制，常压101kPa；

c)分别于腌制0，1.5，3，4.5h时取样，测定肉的持水力。

如图7所示，在脉动真空腌制和常压腌制1.5h时，羊肉的保水性都出现了大幅上升，在1.5h到6h过程中较为稳定，说明食盐腌制提高了肉的保水性。而在腌制4.5h之前，脉动真空腌制的保水性高于常压腌制，说明脉动真空腌制1.5～4.5h有利于提高肉的保水性，有利于肉品质的改善。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。