一种小RNA分子及其在抗病毒中的应用

摘要

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种小RNA分子及其在抗病毒中的应用。小RNA分子具有下列序列：5’?UUCCGGGUGUUUUCGUGUCUUU?3’。本发明小RNA分子注射鱼类后能够显著提高鱼类抗病毒免疫基因表达以及抑制病毒复制。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种小RNA分子及其在 抗病毒中的应用。

背景技术

非编码小RNA在动物和植物的生命过程中起重要作用。这些小 RNA调控转录后基因表达，其通常作用机制是通过与靶mRNA特异性 结合，阻止mRNA的翻译，从而调控发育、免疫、细胞凋亡、病原与 宿主相互作用等各种生命活动。研究表明，许多病毒利用小RNA操纵 宿主的基因表达以促进病毒侵染；与病毒蛋白相比，小RNA分子小， 没有免疫原性，容易规避宿主的免疫防御。对宿主而言，许多动物能 够合成病毒基因靶向性的小RNA，这些小RNA特异性识别并结合病毒 靶mRNA，干扰病毒基因的表达，导致病毒复制被抑制。因此，小RNA 在病毒病的免疫防御中具有巨大的应用潜能。

发明内容

本发明目的在于提供一种小RNA分子及其在抗病毒中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种小RNA分子，小RNA分子具有下列序列： 5’-UUCCGGGUGUUUUCGUGUCUUU-3’

一种小RNA分子的应用，所述小RNA分子可应用于制备刺激抗病 毒免疫基因表达或抑制病毒复制的制剂。

所述病毒为细胞肿大病毒。

本发明具有如下优点：本发明的小RNA分子注射鱼类后能够显著 抑制病毒复制和提升鱼类抗病毒免疫基因表达。

附图说明

图1为本发明实施例提供的小RNA分子731A刺激牙鲆抗病毒免 疫基因IFN、ISG15、Mx和viperin的表达(**P<0.01；*P<0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进 行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

实施例1

小RNA分子731A刺激抗病毒免疫基因表达

步骤1)小RNA分子稀释液制备

本发明的小RNA分子731A的序列为 5’-UUCCGGGUGUUUUCGUGUCUUU-3’。小RNA分子731A由上海 Genepharma公司合成。731A在PBS中稀释至200ug/ml，即为小RNA 分子稀释液。

所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl, 0.358％Na₂HPO₄.12H₂O,0.024％NaH₂PO₄，余量为水。

步骤2)病毒悬液制备

将细胞肿大病毒RBIV-C1(具体制备方法见ZhangM,XiaoZ,Hu Y,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfromcultured rockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck&Schlege),in China.AquacRes.2012；43:556–64)于PBS中稀释至10⁶copies/ml， 即为病毒悬液。

步骤3)小RNA分子混合液和对照混合液的制备

将上述步骤1的小RNA分子稀释液与步骤2的病毒悬液等体积混 合，即为小RNA分子混合液；将PBS与步骤2的病毒悬液等体积混合， 即为对照混合液。

步骤4)注射鱼类

将10条牙鲆(重约12.2g)随机分为2组，每组5条。将这2组 分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul步骤3)的小 RNA分子混合液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul步骤3) 的对照混合液。

步骤5)基因表达检测

在上述步骤4)注射后第4天，取鱼脾脏组织。利用EZNATotalRNA 试剂盒(购于OmegaBio-tek,Doraville,美国)提取总RNA，用于 cDNA制备和绝对荧光定量PCR(qRT-PCR)检测抗病毒相关免疫基因 表达。具体参见文献ZhengWJ,SunL.Evaluationofhousekeeping genesasreferencesforquantitativerealtimeRT-PCRanalysis ofgeneexpressioninJapaneseflounder(Paralichthys olivaceus).FishShellfishImmunol.2011；30:638–45。所检测 的抗病毒相关免疫基因为：typeIinterferon(IFN)，ISG15，Mx 和viperin。结果表明，A组鱼的基因表达水平显著(P<0.01,P< 0.05)高于对照组(见图1)。这些结果表明，小RNA分子731A能 显著刺激抗病毒相关免疫基因表达。

实施例2

小RNA分子731A的抗病毒作用

1)小RNA分子混合液和对照混合液的制备

将上述实施例1步骤1的小RNA分子稀释液与上述实施例1步骤 2的病毒悬液等体积混合，即为小RNA分子混合液；将PBS与步骤2 的病毒悬液等体积混合，即为对照混合液。

2)注射鱼类

将10条牙鲆(重约12.2g)随机分为2组，每组5条。将这2组 分别命名为A和B。将A组的每条鱼分别注射100ul步骤3)的小 RNA分子混合液，将B组(对照组)的每条鱼分别注射100ul步骤3) 的对照混合液。

步骤3)病毒复制检测

在上述步骤4注射后第4天，取鱼脾脏组织。利用DNA提取试剂 盒(购于天根生化科技(北京)有限公司”)从组织中提取DNA，用绝 对定量PCR法检测组织中病毒含量。具体方法见参考文献ZhangM, XiaoZ,HuY,SunL.Characterizationofamegalocytivirusfrom culturedrockbream,Oplegnathusfasciatus(Temminck& Schlege),inChina.AquacRes.2012；43:556–64。结果表明，A 组鱼脾脏的病毒数(9.5x10³)显著(P<0.01)低于B组鱼脾脏的病 毒数(2.7x10⁴)。这些结果表明，小RNA分子731A能够显著抑制病 毒复制。