一种含有猪殃殃的弯孢霉培养基及其制备方法

摘要

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种含有猪殃殃的弯孢霉培养基及其制备方法。配制1000ml培养基的配方如下：猪殃殃20?160g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，琼脂15?20g，蒸馏水加至1000 mL，调节pH为6.5?8.0。本发明降低了弯孢霉培养成本，通过在培养基中添加田间常见杂草，研究出广泛用于弯孢霉优良培养基。

说明书

技术领域

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种含有猪殃殃的弯孢霉培养基及其制备方法。

背景技术

弯孢霉属是1933年由Boedijn提出的。其主要特点为：分生孢子具3个或4个横隔膜，中间细胞通常不对称膨大致使孢子看起来明显弯曲。弯孢霉属是重要的植物病原菌，该属菌主要寄生在玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、水稻、高粱、甘蔗等禾本科作物以及草坪草等，引起植物形成叶斑、菌枯、籽粒变色等症状。弯孢霉能够引起玉米黄斑病，病残体内的病菌分生孢子能在地表越冬，并作为翌年的初侵染源。新月弯孢霉菌(Curvularialunata)可感染用于草坪的高羊茅，外源水杨酸能诱发该草对新月弯孢霉的抗性。Kim报道了不等弯孢霉(C.inaequalis)产生的两种毒素，棘壳孢素PyrenocineA和PyrenocineB，可导致叶片尖端枯萎。利用隔弯孢霉(C.intermedia)生物防治马唐已经在美国获得专利。朱云枝（2003）认为画眉草弯孢霉菌株QZ-2000对马唐具有专化性和致病性，具有开发利用价值。姜述君等人从画眉草弯孢霉菌株QZ-2000培养滤液中提取得到了2种非寄主专化毒素，前者是一种具有除草剂活性的毒素，能够抑制胚根伸长和种子萌发，干扰有丝分裂，对马唐的生长具有极强的限制作用；后者可引起马唐叶片产生较大的病斑。更有研究表明马唐叶表面的蜡质可以刺激画眉草弯孢霉菌株QZ-2000分泌酯酶，进而分解马唐的蜡质并同时促进孢子萌发管的延伸。

弯孢霉属病原菌的模式种即为新月弯孢(C.lunata)。新月弯孢霉是一种常见的寄生兼营腐生的真菌。属于真菌门(Fungi)，半知菌类(Fungiimperfestrainrti)，从梗孢目(Moniliales)，暗梗孢科(Dematiaceae)，多抱亚科(phragmosporoideae)，弯孢霉属(CurvlariaBoedijn)，新月弯孢霉。新月弯孢菌的形态特点为:分生抱子常具3个横隔膜，第三细胞(自基部起)特大而色深，弯曲。一直以来对它的研究主要集中于生物合成皮质激素药物氢化可的松、做絮凝剂和致病性等。新月弯孢霉可以将化合物RSA经生物转化生产氢化可的松，氢化可的松是重要的皮质激素药物，在临床上主要用于治疗骨胶原疾病，如风湿热等。新月弯孢霉可做絮凝剂，该菌株在高氏培养基和一定条件下（pH值7.0，200r/min，水浴温度为35℃）能产生高效絮凝剂，对高岭土悬浊液的絮凝率高达97%以上。据报道，新月弯孢霉不仅能够在植物上引起弯孢菌叶斑病，并且也能够引起如真菌性角膜炎、足菌肿、鼻中隔混合性侵染性感染、鼻窦炎、腹膜炎和应变性支气管肺泡病等人类疾病。近几年研究发现新月弯孢霉还可胞外分泌漆酶。漆酶现广泛应用于环保、食品工业、造纸、生物监测、新能源、有机合成、纺织业等工业生产。由于新月弯孢霉菌株生长迅速、周期短，在实际生产应用中更具优势，为工业化生产了奠定基础。

我国田间杂草资源丰富，但是利用率却很低。在经过了初期的化学防治之后，剩余的杂草多被浪费在田间地头。这对于含有大量生物质资源的杂草群体来说，无疑是巨大的浪费。因此，研究以杂草为基础的微生物发酵培养基，最大化的开发杂草资源，较少浪费，对于优化微生物培养基组成，降低配制成本都有重要的意义。

本发明所提供培养基以杂草猪殃殃为主要的培养基碳、氮源和无机盐类物质提供者，并辅助以蛋白胨、葡萄糖、七水硫酸镁和磷酸二氢钾等物质，成本便宜。以本发明所提供培养基开展弯孢霉的培养，所培养菌株产孢迅速且产孢量极大。

发明内容

本发明目的是针对现有培养基的缺点，提供了一种适用于弯孢霉培养的优良培养基，采用本培养基能够快速有效的得到孢子。本发明降低了弯孢霉培养成本，通过在培养基中添加田间常见杂草，研究出广泛用于弯孢霉的优良培养基。

本发明采用了如下技术方案：

一种含有猪殃殃的弯孢霉培养基，配制1000ml培养基的配方如下：猪殃殃20-160g，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，琼脂15-20g，蒸馏水加至1000mL，调节pH为6.5-8.0。

优选的猪殃殃20g。

优选的pH调节为6.5-7.5。

更优选的pH调节为7.5。

一种含有猪殃殃的弯孢霉培养基的制备方法，包括以下步骤：

将猪殃殃去除根部洗净，进行人工切碎，茎叶片段小于3厘米，加入蒸馏水，煮沸30分钟，纱布过滤，收集过滤后所获得汁液；

加入蛋白胨、葡萄糖、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂；

加蒸馏水，调节pH，定容；

将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。

一种含有猪殃殃的弯孢霉培养基的应用：

将该培养基灭菌后倒入培养皿内，待培养基凝固后，接入相应弯孢霉菌株；培养温度为22-34℃，培养3-10天。

优选的培养温度为25-28℃

更优选的培养温度为28℃。

本发明的有益之处是：

1.以杂草为基础材料，成本便宜，原材料极易获得；

2.配方简单，配制方法简便，操作简便，不需要特殊设备要求；

3.本培养基可被广泛应用于弯孢霉的培养；

4.弯孢霉培养效果优良，采用该培养基能够快速和大量的培养制备弯孢霉分生孢子；

5.该培养基可被广泛应用于生防菌的培养，真菌营养生理、生化特征和遗传功能基因方面的研究。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明不应解释为局限于这些实施例。

本发明所用菌株的具体培养和性状测定方法如下：

PDA培养基活化保存的新月弯孢霉菌株，5天后，在菌落的边缘打取直径为5mm的菌饼，接种到各供试培养基上。将接种菌块的培养基放置到培养箱内，并将培养条件设定为28℃，黑暗培养。

8天后测量菌落直径；6mL无菌水清洗菌落表面孢子，双层擦镜纸过滤收集分生孢子，血球计数板计数，计算产孢量。

实施例1本发明所提供培养基的配制

取20g猪殃殃去根洗净，人工切碎，切碎至茎叶片段小于3厘米，沸水煮猪殃殃茎叶30分钟，纱布过滤掉杂草茎叶。在过滤获得的猪殃殃汁液中加入蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000mL，调节pH为6.5-8.0，添加琼脂15-20g。将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。根据组成成分，将该培养基定名为猪殃殃弯孢霉培养基（Bedstrawcurvulariamedium，BSC）。

实施例2本发明BSC培养基和其他含有杂草培养基的比较

本实施例中同时采用稗草、马唐、狗尾草、播娘蒿和铁苋菜作为添加杂草，与添加猪殃殃的培养基进行横向比较。本实施例所用培养菌株为弯孢霉内的模式菌株：新月弯孢霉。

表1添加不同杂草培养基的培养结果

培养基菌落直径（cm）产孢量（10⁹）CK4.7±0.2^c0.7±0.1^c猪殃殃5.7±0.1^a33.9±1.6^a稗草5.4±0.1^ab11.3±3.6^b马唐5.1±0.1^b10.7±0.9^b狗尾草5.6±0.5^a8.9±1.1^b播娘蒿2.9±0.4^d0.2^d铁苋菜2.8±0.2^d0^e

注：表中数值为平均值±标准误（n=4），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差异显著。

综合以上分析结果，由表1提供的数据可以看出，通过在基础培养基（CK，蛋白胨1.0g，葡萄糖1.0g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾0.5g，蒸馏水加至1000mL，调节pH为7.5，添加琼脂15-20g。将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用）内添加相同含量的6种田间最常见杂草，根据本发明提供的测定方法，进行统计，发现添加猪殃殃的培养基在直径生长和分生孢子产孢量方面有显著优于添加其它杂草的培养基。

实施例3本发明BSC培养基和其他常用培养基的比较

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）：土豆200g，人工切成约2×2厘米的土豆块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g葡萄糖和20g琼脂，并定容至1000ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。

胡萝卜培养基（CA）：胡萝卜200g，人工切成约2×2厘米的胡萝卜块，沸水煮30分钟，纱布过滤，留取汁液。在过滤获得汁液中加入20g琼脂，并定容至1000ml。将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。

玉米淀粉培养基（CS）：玉米淀粉3g、七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾1.0g，琼脂15-20g，蒸馏水加至1000ml，调节pH为6.0-8.0。将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。

水琼脂培养基（WA）：琼脂20g，水定容至1000mL，将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下灭菌锅灭菌20分钟，灭菌后备用。

表2弯孢霉菌株在不同培养基上的生长速率

项目BSCPDACACSWA菌落直径（cm）6.1±0.2^a6.3±0.3^a5.9±0.2^a3.8±0.3^b0^c产孢量(10⁹)35.3±3.7^a20.9±4.6^b17.1±1.9^c3.3±0.2^d0^e

注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差异显著。

由表2可以看出，本发明所提供的培养基（BSC），相较于目前在弯孢霉培养中应用比较广泛的培养基，在分生孢子产孢量方面有较为显著的优势。

实施例4本发明BSC培养基中猪殃殃含量梯度实验

以本发明所提供的BSC培养基为基础，对培养基内的材料猪殃殃含量进行梯度筛选，在保证对菌株高效培养前提下尽量降低所用材料量，降低成本。参照实施例1中的配制方法，将猪殃殃梯度设为0、5、10、20、40、80和160g等七个梯度。参照本发明中所提到的测定方法对不同配比下弯孢霉生长情况进行测定。

表3弯孢霉菌株LD-1在不同配比培养基上的产孢量

猪殃殃（g）0510204080160产孢量(10⁹)0.9±0.3^c>3.1±0.2^b13.7±1.5^b36.9±4.3^a39.2±4.4^a35.8±6.8^a40.1±5.7^a

注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差异显著。

综合以上分析结果，通过对本发明所提供的培养基（BSC）内猪殃殃添加量进行对比实验，计算不同对比下弯孢霉的分生孢子产生量，可以得出，本发明所提供培养基内猪殃殃含量为每升20-160g为佳，考虑降低成本因素，优选为每升20g。

实施例5本发明中所培养菌株最优培养温度的优化

所设温度为19、22、25、28、31和34℃等六个梯度。

表4不同培养温度对菌株LD-1的影响

温度 ℃192225283134菌落直径（cm）3.3±0.4^b5.6±0.2^a5.5±0.3^a5.9±0.3^a6.0±0.3^a5.7±0.5^a产孢量(10⁹)0.9±0.2^e13.7±0.6^d32.1±1.4^b39.8±4.7^a22.6±0.9^c20.3±3.3^c

注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差异显著。

综合以上分析结果，本发明培养基内弯孢霉菌落生长最佳培养温度范围22-34℃，分生孢子产生最佳培养温度范围为25-28℃，结合分生孢子产量和菌落生长速度等因素确认优选培养温度为28℃。

实施例6本发明BSC培养基菌株不同pH的对比实验

结合实施例1中本发明培养基的具体配置方法，经过多次测定，培养基pH范围在6.7-7.8之间。进行本发明培养基内弯孢霉最优培养pH值的筛选。所设pH值为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5和9.5等六个梯度。

表6pH值对菌株LD-1生长的影响

pH4.55.56.57.58.59.5菌落直径（cm）0^e1.8±0.3^c5.7±0.4^a5.9±0.1^a3.9±0.4^b0.6±0.1^d产孢量(10⁹)0^e23.1±2.8^d31.1±2.3^b41.2±4.7^a10.6±1.2^d0^e

注：表中数值为平均值±标准误（n=3），同行数据后的字母不同表示在0.05水平上差异显著。

综合以上分析结果，本发明培养基内弯孢霉菌落生长最佳培养pH范围6.5-7.5，结合分生孢子产量分析确认最佳培养pH为7.5。