铜绿假单胞菌在降解伏马菌素中的应用

摘要

本发明公开了一种铜绿假单胞菌的新用途，即铜绿假单胞菌在降解伏马菌素中的应用。本发明通过实验证明铜绿假单胞菌可高效降解伏马菌素，铜绿假单胞菌作为伏马菌素降解的生物材料，在开发新的生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种铜绿假单胞菌的新用途，即铜绿假单胞菌在降解伏马菌素中的应 用。

背景技术

伏马菌素是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，根据 结构差异，伏马菌素被分为4族：A、B、C和G，B族伏马菌素(FB)毒性最强。伏马菌素主要由串 珠镰刀菌(Fusariumverticillioides)在玉米、小麦、高粱、大豆及某些饲料中生长代谢产 生。伏马菌素可引起多种动物疾病，如马脑白质软化病(equineleukoencephalomalacia， ELEM)、猪肺水肿综合征(porcinepulmonaryedema，PPE)、实验性大鼠肾癌和肝癌等，并被 认为与人类食管癌和神经管缺陷病高发有关。伏马菌素污染对人类和动物健康及食品安全 构成了严重威胁，与疯牛病病毒、二噁英、O-157大肠杆菌和氯丙醇五种污染物被当今世界 认为危机人类食品安全的五大热点。因此，开展伏马菌素抑制与去除技术研究，对于保护人 类和动物健康，确保国家食品安全和粮食安全具有重大的意义。

伏马菌素去毒方法可分为物理、化学和生物三大类，其中生物法因具有效率高、特 异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，利用生物手段进行伏马菌素的降解则成 为近年来伏马菌素毒素降解研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌的新用途，即铜绿假单胞菌在降解伏马菌 素中的应用。

本发明保护铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢产 物在降解伏马菌素中的应用。

本发明还保护铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或铜绿假单胞菌代谢 产物在制备产品中的应用；所述产品的用途为降解伏马菌素。

本发明还保护一种降解伏马菌素的方法，为使用铜绿假单胞菌对伏马菌素进行降 解处理。

所述方法中，降解处理的方式为将铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液和/或 铜绿假单胞菌代谢产物与含有伏马菌素的样品混合。

本发明还保护一种产品，其活性成分为铜绿假单胞菌和/或铜绿假单胞菌发酵液 和/或铜绿假单胞菌代谢产物；所述产品的用途为降解伏马菌素。

以上任一所述铜绿假单胞菌，具体为保藏编号为：CGMCCNo.8511的铜绿假单胞菌 N17-1。

以上任一所述伏马菌素，具体可为B族伏马菌素。所述B族伏马菌素具体可为伏马 菌素B₁。

本发明通过实验证明，铜绿假单胞菌可高效降解伏马菌素，铜绿假单胞菌作为伏 马菌素降解的生物材料，在开发新的生物降解菌剂和生物降解无菌制剂方面都具有很好的 应用前景。

附图说明

图1为实施例1中LC/MS/MS检测结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。

铜绿假单胞菌N17-1(Pseudomonasaeruginosa)：保藏编号：CGMCCNo.8511。记载 并保护“铜绿假单胞菌N17-1”的专利的申请号为：201410001212.1，授权公告号为CN 103710292B(授权公告日为2016.01.20)。

ppm：mg/L。

伏马菌素B1(FB1)标准品：Sigma-Aldrich，产品编号：32936。

伏马菌素免疫亲和柱：美国VICAM公司，产品编号：G1008。

1×0.1％TweenPBS缓冲液：美国VICAM公司，产品编号：G1112。

伏马菌素B₁的结构式如下：

实施例1、铜绿假单胞菌N17-1对伏马菌素B₁的降解作用

NB液体培养基：由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白 胨在NB液体培养基中的浓度为1g/100ml，牛肉膏在NB液体培养基中的浓度为0.3g/100ml， NaCl在NB液体培养基中的浓度为0.5g/100ml。

1、将铜绿假单胞菌N17-1接种于液体NB培养基中至初始OD_600nm＝0.05，37℃条件 下，200rpm(旋转半径20mm)震荡培养24h，收集全部菌液(即含有菌体和上清在内的整个培 养体系)。

2、将1mg伏马菌素B₁(FB1)标准品溶解于10ml色谱纯甲醇中获得浓度为100ppm的 伏马菌素B₁溶液。

3、制备实验组溶液：

取0.5ml步骤1收集的菌液，置于1.5ml离心管中，向离心管中加入5μL步骤2得到的 伏马菌素B₁溶液，充分混匀后37℃静置72h，然后10000g离心10min并收集上清，得到实验组 溶液。

4、制备对照组溶液：

按照步骤3的方法，取0.5ml液体NB培养基替代0.5ml步骤1收集的菌液，其余操作 不变，得到对照组溶液。

5、效果检测：

实验组溶液和对照组溶液分别作为待测溶液，进行如下步骤：

1、向4体积份待测溶液中加入1体积份无水甲醇，室温振荡提取5分钟，12000r/min 离心5分钟，取上清液用于下一步净化操作。

2、取步骤1得到的上清液，使用伏马菌素免疫亲和柱进行除杂，具体操作过程如 下：

取步骤1得到上清液，使其通过伏马菌素免疫亲和柱，调节流速为1-2滴/s，直至空 气完全通过免疫亲和柱。然后用10ml的1×0.1％TweenPBS缓冲液以1-2滴/s的流速通过亲 和柱，对亲和柱进行清洗，然后重复清洗1次。最后用1ml无水甲醇以1-2滴/s的流速淋洗亲 和柱，将此洗脱液收集于1.5ml的离心管中，用0.22μm有机相尼龙膜过滤后，将滤液装入2ml 色谱进样小瓶中，得到样品液。

3、取步骤2得到的样品液，进行LC/MS/MS(液相色谱串联质谱)。

液相色谱相关参数：

仪器：agilent6460LC/MS/MS；

色谱柱：agilentXDB-SB-C18(2.1x50mm，1.8μm)；

上样体积：2μL；

柱温：30℃；

洗脱过程(梯度洗脱)：第0-1min，A液在洗脱液中所占的体积百分含量为80％；第 1-5min，A液在洗脱液中所占的体积百分含量为10％；第5-6min，A液在洗脱液中所占的体积 百分含量为80％；后运行7min，后运行过程继续保持A液在洗脱液中所占的体积百分含量为 80％；流速为0.3mL/min；洗脱液由A液和B液组成，A液为体积百分含量为0.1％的甲酸水溶 液，B液为体积百分含量为0.1％的乙腈水溶液。

质谱相关参数：ESI+MRM(多反应监测)；雾化气温度为300℃，雾化气流速为6L/ min；气帘气温度为350℃，气帘气流速为10L/min，气帘气压力为45psi；电力电压为4000v； 检测离子对：722＞334，722＞352；碰撞电压均为30ev。

用伏马菌素B1(FB1)标准品的梯度稀释液代替样品液进行上述步骤。

计算伏马菌素B1(FB1)降解率，计算方法为：

FB1降解率(％)＝(对照组FB1含量-实验组FB₁含量)/对照组FB₁含量×100。

实验重复五次，结果取平均值。

LC/MS/MS检测结果如图1所示。图1中，A为伏马菌素B₁标准品的分析结果，B为对照 组溶液的分析结果，C为实验组溶液的分析结果。结果表明，铜绿假单胞菌N17-1对伏马菌素 B₁有较好的降解效果，经过统计降解率为80.1±4.5％。