一种基于对称构象免疫原的艾滋病疫苗及其制备方法

摘要

本发明属于疫苗领域，涉及一种基于对称构象免疫原的艾滋病疫苗以及其制备方法。本发明根据HIV-1跨膜蛋白gp41的近膜区MPE保守表位的免疫原特征，通过蛋白结构模拟技术设计含有长序列的新型对称构象免疫原；实验结果显示在该免疫原中MPER表位形成稳定的螺旋结构，与识别该表位的人源广谱中和抗体10E8的结合能力显著高于未设计的MPER免疫原，其免疫动物后所产生的血清及抗体可更强结合HIV-1包膜蛋白Env的天然构象，免疫产生的抗体在细胞模型上可高效抑制HIV-1病毒对靶细胞的感染，同时可诱导的抗体能介导显著的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用；本发明的对称构象免疫原4sMPER作为艾滋病疫苗能克服原有表位的近膜构象缺陷，具有显著的优势。

说明书

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种基于对称构象免疫原的艾滋病疫苗以及其制备方法。

背景技术

现有技术公开了艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染后引起的获得性免疫缺陷综合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)。从1981年发现首例艾滋病(AIDS)病例来，至今30多年间，艾滋病迅速在全球范围内蔓延扩散。该疾患已经成为全球的健康危机，也是全球所面临的重大挑战之一；其严重危害社会进步和经济增长。据报道，目前，全球大约6000多万人被HIV感染，其中3000万人死于艾滋病以及由艾滋病引发的相关疾病。鉴于此，如何有效防止HIV-1感染，降低发病率和死亡率是我国乃至全球面临的紧迫任务。研究显示，疫苗是控制HIV-1传播和感染的有效手段，然而，艾滋病疫苗研制过程中碰到一个难以克服的困难—即HIV-1具有高度变异性；很多疫苗所选择的位点主要是自然感染中优势抗原表位，而这些表位大多是HIV-1变异频率最高的位点。因此，利用这些抗原构建疫苗很难够克服同时存在的HIV-1亚型。如何利用和选择HIV-1的保守区域设计疫苗成为艾滋病疫苗研究领域中存在的一个重要的问题。

MPER即HIV-1gp41近膜区(氨基酸序列号：660-683；参考株为HXB2)是gp41上一段富含色氨酸的保守区域。MPER在病毒膜融合的过程中起重要的作用(1)。有研究实验表明MPER缺失的HIV毒株丧失感染靶细胞的能力。很多广谱中和抗体如10E8，4E10，2F5等均识别这个位点，其中，10E8是第二代从病人体内分离出来的广谱中和抗体，其晶体结构显示MPER区的结合构象是螺旋构象(2)，进一步暗示MPER区天然构象可能为螺旋构象，这跟之前研究结果相一致，所以，这提示MPER作为免疫原来设计疫苗是一个很好的选择。然而，根据MPER区作为抗原来设计疫苗面临很大的挑战。研究表明，天然状态下MPER呈螺旋结构且富含色氨酸以及其他许多疏水氨基酸，MPER区的很多重要的广谱中和抗体识别氨基酸由于疏水作用均埋在细胞膜中，如L669，W670，W672，F673，I675，W678，L679，Y681，I682和K683等(3)。这也可能是导致MPER区作为免疫原免疫原性较弱的原因之一。所以，目前利用MPER作为抗原设计的疫苗很难诱导出中和抗体。然而，有研究表明利用MPER区作为抗原在猴子上免疫取得保护性，但亦未能够诱导出识别MPER区的中和抗体。分析发现，MPER区诱导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(Antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,以下简称ADCC)作用是产生保护效果的主要原因。所以能否诱导更强的ADCC作用在疫苗设计中也很关键。综上所述，如何根据MPER区设计免疫原，使其能够模拟天然构象并且让其主要氨基酸位点在细胞膜环境中外露，从而更好的产生抗体，形成中和作用和ADCC作用，是利用MPER区设计HIV疫苗的一个关键技术问题。本申请的发明人为了解决以上的技术难点，通过蛋白结构模拟技术，设计了含有长序列的新型对称构象免疫原4sMPER，实验结果显示该抗原更接近天然的螺旋构象，关键的疏水氨基酸朝向不同的方向，从而使其部分外露出膜，以其为基础的HIV疫苗诱导了更多的识别天然构象的抗体，以及增强了中和作用和ADCC作用。

与本发明相关的现有技术有：

1.Apellániz,B.,E.Rujas,P.Carravilla,J.Requejo-Isidro,N.Huarte,C.Domene,andJ.L.Nieva.2014.Cholesterol-dependentmembranefusioninducedbytheGp41MPER-TMDconnectionsuggestsamechanismforbroadHIV-1neutralization.JVirol.15；88(22):13367-77..

2.JingheHuang,G.O.,LeoLaub,MarkK.Louder,NicoleA.Doria-Rose,NancyS.Longo,HiromiImamichi,,B.C.RobertT.Bailer,ShailendraK.Sharma,S.MunirAlam,TaoWang,YongpingYang,BaoshanZhang,,andR.W.StephenA.Migueles,BartonF.Haynes,PeterD.Kwong,JohnR.Mascola&MarkConnors.2012.BroadandpotentneutralizationofHIV-1byagp41-specifichumanantibody.Nature15；491(7424):406-12.

3.Sun,Z.-Y.J.,K.J.Oh,M.Kim,J.Yu,V.Brusic,L.Song,Z.Qiao,J.-h.Wang,G.Wagner,andE.L.Reinherz.2008.HIV-1broadlyneutralizingantibodyextractsitsepitopefromakinkedgp41ectodomainregionontheviralmembrane.Immunity28:52-63.。

发明内容

本发明的目的是为了解决MPER多肽由于构象问题而导致诱导识别天然构象抗体能力弱的问题，提供一种基于对称构象免疫原的艾滋病疫苗以及其制备方法。具体涉及一种氨基酸序列可作为免疫原，所述氨基酸序列中包括HIV-1gp41中近膜区(Membraneproximalexternalregion,MPER),氨基酸序列号为660-683(HXB2为参考株)的4重复序列，其能够更好的模拟HIV-1病毒gp41上MPER区融合前的天然状态。HIV-1MPER区非常保守，这与其参与膜融合过程并起到重要作用有密切关系(1)；可识别该表位的广谱中和抗体2F5能够中和大约67％左右的病毒，而另外一株识别该表位的广谱中和抗体10E8能以很低的浓度中和98％的临床株(2)，提示该区域是很好的疫苗设计靶点；但MPER区免疫原性相对较弱，特别是以全病毒作为免疫原免疫；因此利用假病毒或者VLP诱导出识别MPER区的特异性抗体较难。此外，MPER的天然构象为螺旋结构(2)，而合成和表达的MPER表位单体基本上为无规则卷曲。加之天然构象的MPER区抗原中的很多关键表位由于疏水作用而插入到细胞膜中，给MPER区作为免疫原设计疫苗增加了很多困难。为解决MPER免疫原性较弱以及构象问题，本发明利用蛋白结构模拟技术设计了串联型长表位MPER新免疫原4sMPER，该免疫原具有对称构象特征，计算机模拟显示该抗原具有螺旋构象，使其表位的关键氨基酸(W672和F673)位于不同的方向(如图1所示)，由此可解决上述所提到的MPER区与膜脂结合后重要氨基酸隐藏到细胞膜的关键问题，实验结果也证明该设计的4sMPER免疫原具有螺旋结构(如图2，图3所示)，能够更好的与广谱中和抗体结合(图4)，同时其在细胞膜上也可更好的暴露出之前隐藏的10E8抗体关键结合位点(图5)，并可诱导出更多的识别天然构象的特异性抗体(图6)，这些抗体具有中和活性及ADCC效应(表1，图7)。

本发明包括下述技术方案：

1.构象模拟技术所获得的4sMPER免疫原结构，

利用计算机模拟技术对MPER区抗原进行模拟，选择具有中心对称构象为螺旋构象的模拟体；

2.圆二色光谱仪检测4sMPER的二级结构

利用圆二色光谱仪(J-815型，JascoInc,Japan)通过圆二色谱法测定4sMPER抗原，和MPER单体肽的二级结构；

3.圆二色光谱仪检测4sMPER的热稳定性分析

热变性分析(Tm值)用以评价4sMPER抗原的热稳定性；

4.针对MPER区表位的广谱中和抗体10E8和4E10对4sMPER结合能力检测

本发明利用10E8、4E10单抗检测4sMPER的构象；

5.高内涵检测4sMPER的关键氨基酸位点能更容易暴露于细胞膜外面；

流式细胞仪检测Ab-4sMPER(4sMPER抗原免疫动物后纯化的对4sMPER特异性抗体)更容易识别天然HIV-1包膜蛋白Env；

10Ab-4sMPER诱导抗体介导的细胞毒(ADCC)作用；

7.测Ab-4sMPER和Ab-MPER对假病毒的抑制活性。

在本发明的一个实施方式中，上述4sMPER多肽免疫原可直接或以组合免疫原中一部分的形式，作为蛋白疫苗用于诱导可识别病毒MPER区保守表位天然构象的抗体，从而以中和病毒和ADCC效应达到艾滋病防治的目的。

在本发明另一个实施方式中，编码4sMPER免疫原的DNA序列可以进一步克隆至其他载体中，如AAV、vacciniavirus,ALVAC,MVA,Ad5作为疫苗以增强其免疫原性。

本发明所述的该HIV疫苗可进一步跟佐剂配合使用，佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、MF59、AS02A，QA-21,短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子或明矾、以及油佐剂或者水型佐剂。

发明的HIV疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、鼻腔给药、口腔给药。本领域技术人员可以利用本领域公知的技术队其进行配方，以使其适合相应的给药方式。

附图说明

图1.构象模拟技术所获得的4sMPER免疫原结构。

图2.圆二色光谱仪检测4sMPER的二级结构。

图3.圆二色光谱仪检测4sMPER的热稳定性分析。

图4.10E8(A)、4E10(B)对4sMPER结合能力的检测。

图5.高内涵检测4sMPER的关键氨基酸位点能更容易暴露于细胞膜外面，其中，图5A为荧光图像结果，图5B为高内涵荧光定量结果。

图6.流式细胞仪检测Ab-4sMPER(4sMPER抗原免疫动物后纯化的对4sMPER特异性抗体)更容易识别HIV-1天然构象的包膜蛋白Env。

图7.Ab-4sMPER能够更好的介导ADCC作用。

具体实施方式

实施例1

构象模拟技术所获得的4sMPER免疫原结构：

利用计算机模拟技术对MPER区抗原进行模拟，选择具有中心对称构象为螺旋构象的模拟体；如图1所示，本发明设计的抗原4sMPER为螺旋构象，其中关键疏水氨基酸位点672W为绿色，673F为粉红色，。但由所设计抗原具有中心对称结构，关键疏水氨基酸672W和673F的方向各不相同，以此解决MPER区抗原关键位点埋入到细胞膜中的问题；

圆二色光谱仪检测4sMPER的二级结构：

利用圆二色光谱仪(J-815型，JascoInc,Japan)通过圆二色谱法测定4sMPER抗原，和MPER单体肽的二级结构(如图2所示)，4sMPER抗原和MPER单体肽均用50mM的pH7.2的PBS稀释至终浓度为10μM备用，在0.1cm的石英样品杯中加入PBS做空白对照，样品检测使用下列参数设置：检测温度4℃，带宽5nm,解析度0.1nm,光径0.1cm，反应时间4.0s,扫描速度50nm/min，波长范围从190nm到280nm，最后使用仪器自带的软件，将CD信号根据样品中的氨基酸摩尔浓度转换为摩尔椭变率(molarellipticity,[θ])，结果显示4sMPER抗原在208和222nM有强的吸收峰，具有显著的螺旋结构，而MPER抗原为无规则卷曲；

圆二色光谱仪检测4sMPER的热稳定性分析：

热变性分析(Tm值)用以评价4sMPER抗原的热稳定性，圆二色光谱仪(J-815型，JascoInc,Japan)上检测222nm的吸光度，以5℃/min的温度梯度变化检测多肽的热变性，温度设置范围从4℃扫描到99℃，使用软件计算热解离转变中点温度，即Tm值；结果显示，4sMPER抗原具有很稳定的螺旋结构(如图3所示),其Tm值约为95℃；

针对MPER区表位的广谱中和抗体10E8和4E10对4sMPER结合能力的检测：

本发明利用10E8、4E10单抗检测4sMPER的构象，利用5μg/ml的MPER多肽和4sMPER多肽进行包被，4℃过夜，2％的脱脂奶粉封闭2个小时，封闭后，加入起始浓度为20μg/ml4倍稀释系列的10E8和4E10，37℃温育一个小时，利用含有0.05％吐温20的PBS洗3遍，然后加入羊抗人HRP标记的二抗(1:3000稀释)，37℃温育一个小时，利用TMB进行显色，测其OD450，结果显示随着10E8和4E10抗体浓度的提高，OD450的值也随之升高，10E8能在很低浓度下识别4sMPER肽，对MPER识别却需要较高的浓度(如图4A所示)，表明10E8对4sMPER的结合能力更强；4E10抗体显示类似的结果(如图4B所示)；结果表明，对称表位的构象更容易被结合天然构象的10E8和4E10单抗识别，提示其构象更接近于天然构象；

高内涵检测4sMPER的关键氨基酸位点能更容易暴露于细胞膜外面：

利用高内涵检测4sMPER抗原在细胞膜环境中关键氨基酸是否能够暴露于细胞膜外面，20μg/ml的4sMPER和MPER跟细胞在37℃温育1小时，然后加入5μg/ml的识别MPER区表位的广谱中和抗体10E8(含有1％BSA)室温温育30分钟，用PBS洗2遍，然后加入二抗山羊抗人IgG-FITC(10μg/ml)室温温育40分钟，用PBS洗2遍，然后用高内涵(Opera，PE)进行拍照，并计算定量的荧光值(如图5B所示)，如图5A所示，在细胞膜环境下，MPER很难被10E8识别，而4sMPER与10E8的结合能力显著提高，其中细胞对照(Cell)只加二抗，细胞抗体组对照(Cell-Ab)分别加入等量的10E8和二抗做平行对照，图5B为高内涵仪器可定量计算单个细胞的荧光强度，结果显示，相对于MPER单表位，10E8对对称抗原4sMPER具有更强的结合，两者具有显著性差异(P＝0.012<0.05)；

流式细胞仪检测Ab-4sMPER(4sMPER抗原免疫动物后纯化的对4sMPER特异性抗体)更容易识别天然HIV-1包膜蛋白Env：

10μg/ml的Ab-4sMPER和Ab-MPER(1％的BSA)跟稳定表达HIV-1包膜蛋白Env的H9/IIIB细胞在室温温育30分钟，用PBS洗两遍，然后加入10μg/ml的山羊抗兔-FITC(含有1％BSA)室温温育30分钟，用PBS洗2遍，用PBS洗2遍，然后用流式细胞仪(AccuriC6，BD)进行检测，如图6所示，Ab-4sMPER对H9IIIB表面表达的天然构象Env具有更好的结合(30％)，而Ab-MPER的结合相对较弱(18％)；

Ab-4sMPER能够更好的诱导抗体介导的细胞毒(ADCC)作用：

将25μl的H9IIIB(2.5×10⁴个)细胞铺至96孔板，然后将Ab-4sMPER和Ab-MPER梯度稀释，加入到稳定表达HIV包膜蛋白的H9/IIIB细胞中(50μl)，然后将ADCC效应细胞(promega)25μl(1.5×10⁵个)加入到H9/IIIB中，37℃温育24h后测其luciferase，结果如图7所示，Ab-4sMPER相对于Ab-MPER显示了更强ADCC效果；

Ab-4sMPER和Ab-MPER对假病毒的抑制活性：

利用设计的构象对称抗原4sMPER肽和MPER肽免疫新西兰大耳兔，经过4免后，测抗体滴度，然后利用特异性偶联柱材分别将抗4sMPER的抗体(Ab-4sMPER)和抗MPER的抗体(Ab-MPER)进行纯化，利用假病毒测Ab-4sMPER和Ab-MPER的效果，具体包括：按照每孔8000个U87细胞，100μl体系进行铺板，将病毒跟系列稀释的抗体各50μl体系进行混合，放至37℃，孵育30分钟，孵育后，将其加入U87细胞中，37℃温育72h后，测其luciferase，实验结果如表1所示，Ab-MPER-4对假病毒SC422661.8、ZM109F.PB4、AE03、SC19-15具有显著的抑制活性，其IC0分别为14.64±3.31、5.69±2.10、50.78±4.13、31.92±6.19(μg/ml)，而抗体Ab-MPER对所有假病毒均没有明显的抑制活性。

表1是Ab-4sMPER和Ab-MPER(MPER肽免疫动物后纯化的对MPER特意性抗体)对假病毒的抑制活性。

表1

SEQUENCELISTING

<110>复旦大学

<120>一种基于对称构象免疫原的艾滋病疫苗及其制备方法

<130>20141124

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>66

<212>PRT

<213>HIV

<400>1

AlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIle

151015

LysSerLeuTrpAsnTrpPheAsnIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIle

202530

LysSerLeuTrpAsnTrpPheAsnIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIle

354045

LysSerLeuTrpAsnTrpPheAsnIleThrAsnTrpLeuTrpTyrIle

505560

LysGly

65