全能干细胞的诱导方法、及用该方法制备的全能干细胞

摘要

本发明涉及一种用于诱导定制的全能干细胞的方法、通过该方法制备的全能干细胞及包含所述全能干细胞的组合物，其中，所述定制的全能干细胞是通过利用莽草酸、包含莽草酸的植物提取物或植物干细胞以及再分化的植物干细胞(愈伤组织)的提取物来重新编程分化的成体细胞而诱导。根据本发明，由于没有用卵子来制备具有与胚胎干细胞相同能力的全能干细胞，因而可以解决道德问题。最重要的是，通过使用已被证明对人无害的植物干细胞提取物，可以制备安全得到保障的全能干细胞。此外，本发明可用来研发专给受试者定制的免疫相容的细胞治疗剂。此外，通过诱导来自身患疾病的受试者体内的全能干细胞，本发明可非常有助于研究治疗方法的和诊断病因。此外，本发明涉及一种包含莽草酸或含有莽草酸的植物提取物的组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱导全能干细胞的方法、用该方法制备的全能干细胞和包含该全能干细胞的组合物，其中，所述方法是通过对分化的成体细胞进行重新编程和/或去分化来诱导全能干细胞的。

本发明还涉及包含全能干细胞的药物组合物或化妆品组合物。

本发明还涉及用于激活干细胞、增殖皮肤细胞、再生皮肤或抗老化的组合物。

背景技术

干细胞为未分化细胞，其可以分化成各种类型的组成生物组织的细胞，且可以从胚胎、胎儿和成体组织中获得。在所述干细胞的不同细胞类型中，所述全能干细胞(pluripotentstemcell)是指那些可以分化成三种胚层，即内胚层、中胚层和外胚层中的任一种的干细胞。

所述干细胞可根据以下内容进行分类：解剖部位、细胞功能、表现在细胞表面上的抗原、转录因子、由细胞产生的蛋白质和源自所述干细胞的特定细胞类型。

作为比较明确的分类标准，所述干细胞可基于其起源进行分类。胚胎干细胞(ES细胞)是从胚胎中分离出来的，且成体干细胞是从成体组织中分离出来的。

或者，所述干细胞可以根据它们分化成专用细胞的种类的能力而分成全能干细胞(pluripotency)、多能干细胞(multipotency)和单能干细胞(unipotent)。通常，胚胎干细胞(ES细胞)可被分作全能干细胞，且成体干细胞被分作全能干细胞和单能干细胞。

源自早期胚胎，即囊胚的内细胞团中的胚胎干细胞(ES细胞)为全能干细胞，全能干细胞可以分化成能够组成成熟身体的所有组织。也就是说，所述胚胎干细胞为未分化的细胞，这种未分化的细胞可不受限地进行增殖且可以分化成所有的细胞类型。不像所述成体干细胞，所述胚胎干细胞由于可以形成生殖细胞，因此它们可以遗传给下一代。

然而，所述全能干细胞由于在其制备过程中要破坏胚胎而引起了严重的宗教及伦理问题。此外，由于它们源自受限的胚胎，且个体之间缺乏免疫相容性，因而无法避免免疫排斥。为了克服这些问题，人们尝试各种方法来人工制备全能干细胞，如通过使用源自成体的细胞的诱导的胚胎干细胞或如同胚胎干细胞具有全能性的细胞。

代表性例子包括体细胞核移植(SCNT)、与胚胎干细胞的融合和通过限定因子的重新编程(reprogrammingbydefinedfactors)。所述体细胞核移植的效率极低且由于需要大量的卵子而存在伦理上的问题。所述与胚胎干细胞的融合由于诱导的细胞另外具有两对基因而存在细胞稳定性方面的严重问题。所述通过限定因子的重新编程由于使用了含有致癌基因的病毒而牵涉到致癌的严重问题。

因此，为了研发细胞治疗剂，人们需要一种用于制备诱导的全能干细胞的方法，该方法能够确保稳定性和安全性且不会引起道德问题。

为了满足上述需求，研究人员对通过体细胞导入四种基因而去分化来诱导全能干细胞的方法做过研究(TakahashiK,YamanakaS(2006)，Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell126:663-676)。该方法由于使用了成体细胞而不会违背道德，且因为使用了自体细胞而解决了免疫排斥的问题。

本发明的发明人是从源自动物的诱导的全能干细胞(iPSC)的提取物中获得去分化的干细胞的，当其中存在几个限制。

第一、该方法需要大量(20mg或以上)的iPSC提取物。因此，使用成本高且需要很多劳动力的人源去分化干细胞的提取物来诱导去分化并没有得到成功。例如，为了制备人源去分化干细胞以获得20mg提取物，一名专家需要卖力工作至少3个月，这成本非常高。

第二、当动物干细胞或去分化的干细胞的提取物处理待诱导的体细胞时，如果所述细胞在所述提取物中未被完全地破坏而存活下来时，从所述存活下来的去分化干细胞中不容易将去分化诱导的细胞区分开来，因而需要基因组DNA的分析，这成本很高且耗费时间。

第三、由于使用蛋白的人源去分化干细胞的制备几乎无法成功，因此必需要使用利用病毒制得的人源去分化干细胞的提取物。由于所得细胞可包含源自所述病毒的致癌物质，因此难以将所得细胞应用在临床上。

发明内容

技术问题

在一方面，为了解决相关领域中存在的问题，本发明在于提供一种全能干细胞的制备方法，所述全能干细胞的稳定性和安全性得到了保障且不会引起道德问题。本发明还在于提供一种用于诱导人源去分化干细胞的方法，该方法几乎没有得到实现。

本发明的发明人已研发出一种通过使用源自成体(adult)的细胞来诱导全能干细胞的方法，从而所述全能干细胞与成体具有相同的遗传背景。根据本发明，具有各种遗传背景的源自成体的细胞中可以获得相同的结果。因此，本发明的方法适于全能干细胞的制备。

技术方案

在一方面，本发明提供一种用于诱导干细胞的方法，该方法包括：用莽草酸、含莽草酸的植物提取物、含莽草酸的植物干细胞提取物、或含有它们的组合物处理源自成体的细胞。

具体地，在一方面，本发明提供一种用于制备诱导的全能干细胞的方法，该方法包括：从植物干细胞或通过各种方法诱导的任何种类的诱导的全能植物干细胞中提取包含活性成分的提取物；向源自成体的细胞中注入所述提取物；及通过培养注入有所述提取物的所述细胞，来制备全能细胞，如胚胎干细胞。

在另一方面，本发明提供一种用于制备干细胞的方法，该方法进一步包括：向源自成体的细胞中注入莽草酸、含莽草酸的植物提取物、含莽草酸的植物干细胞提取物、或含有它们的组合物；及培养注入有所述莽草酸、所述提取物或所述组合物的所述细胞。

所述提取物可以为愈伤组织提取物。

在本发明的一示例性实施例中，所述方法可进一步包括：在注入所述提取物前，用细胞膜渗透剂处理所述源自成体的细胞。所述细胞膜渗透剂可以包含链球菌溶血素O和洋地黄，而且只要所述细胞膜渗透剂能易于将本发明的莽草酸或提取物注入进细胞膜内就不限于此。

在本发明的另一示例性实施例中，所述方法进一步包括：待转移至饲养细胞层后，培养那些注入有所述提取物的源自成体的细胞。所述饲养细胞层可以包含STO细胞，但不限于此。

在另一方面，本发明提供一种用于制备诱导的全能干细胞的方法，该方法包括：从植物干细胞、愈伤组织或通过各种方法诱导的任何种类的诱导的全能植物干细胞中提取含有活性成分的提取物；向源自成体的细胞中注入所述提取物；通过使用常规的细胞培养基，培养注入有所述提取物的细胞；及待转移至饲养细胞层后，通过使用胚胎干细胞培养基进一步培养所述细胞。

在另一方面，本发明提供通过上述方法制得的组合物。

在另一方面，本发明提供包含所述干细胞的组合物。在另一方面，本发明提供一种用于诱导可诱导的全能干细胞(iPSC)的方法、使用该方法制备的全能干细胞及包含该全能干细胞的细胞治疗剂，其中，该方法是通过利用莽草酸、或包含莽草酸的植物提取物或植物干细胞提取物来诱导去分化成体细胞的重新编程和/或去分化。

在本发明中使用的包含莽草酸的植物提取物或植物干细胞提取物可以进一步包含选自红杉(巨杉)、黄菖蒲、菊芋、蓝杉(Piceapungens)、白云杉(Piceaglauca)、银顶桉(Eucalyptussieberiana)、王桉(Eucalyptusregnans)、北美乔柏(Thujaplicata)、海枣(Phoenixdactylifera)、Dahliavariabilis、山荆子(Malusbaccata)、西洋梨(Pyruscommunis)、小麦、赤松(Pinusdensiflora)、黑松(Pinusthunbergii)、日本莽草(Illiciumanisatum)、荷花玉兰(Magnoliagrandiflora)、鱼腥草(Houttuyniacordata)、虎耳草(Saxifragastolonifera)、阿江榄仁(Terminaliaarjuna)、乳香黄连木(Pistacialentiscus)、金茶藨子(Ribesaureum)、聚合草(Symphytumofficinalis)、白类叶升麻(Actaeapachypoda)、土坛树(Alangiumsalvifollium)、银杏叶(Gingkobiloba)、绿藜芦(Veratrumviride)、川续断(Dipsacuslaciniatus)、藿香(Agastacheurticifolia)、土木香(Inulahelenium)、金丝桃(Hypericumspp.)、饭包草(Commelinabengalensis)、武靴叶(Gymnemasylvestris)、诃子(Terminaliachebula)、Illiciumfloridanum、Illiciumdiffengri、红茴香(Illiciumhenryi)、八角茴香(Illiciumverum)、Illiciumlancealatum、短梗八角(Illiciumpachyphyllum)、日本莽草(Illiciumanisatum)、东毒茴(Illiciumreligiosum)、Hemidesmusindicus、百瑞木(Cistusincanus)，黄花稔(Sidaacuta)、圆椎花南蛇藤(Celastruspaniculata)、Glycosmismuricata、白花除虫菊(Tanacetumparthenium)、小麦(Triticumaestivum)、Hypericumdolabriforme、Dipsacuspilosus、红花金丝桃(Triadenumwalteri)、Hypericumflondosum和Terminaliapallid(DenisV.Bochkovet.al.,Shikimicacid:reviewofitsanalytical,isolation,andpurificationtechniquesfromplantandmicrobialsources,JChem.Biol.(2012)5；5-17)中的一种或多种的提取物。

在另一方面，本发明提供用于激活干细胞、再生皮肤或抗老化的组合物，该组合物包含通过上述方法制得的干细胞，或者提供包含该干细胞的药物组合物或化妆品组合物。

有益效果

根据本发明，可以使用植物干细胞提取物或通过各种方法诱导的任何种类的诱导的全能植物干细胞提取物、莽草酸、包含莽草酸的植物提取物，或者使用包含它们的组合物来制备干细胞。本发明的方法可应用于具有各种遗传背景的所有物种的细胞，其中也包括人。此外，本发明的方法不会产生道德问题，因为该方法使用源自植物的干细胞提取物，且能制备安全性得到保障的诱导的全能干细胞。

附图说明

图1为描述了本发明的诱导全能干细胞的实验过程的示意图。

图2展示了用植物干细胞提取物处理之后的第五天时观察到的诱导的全能干细胞。

图3展示了用植物干细胞提取物处理之后的第八天且转移至饲养细胞层之后第二天时观察到的诱导的全能干细胞。

图4A展示了用植物干细胞提取物处理之后的第32天且待转移至饲养细胞层后进行次代培养4次之后观察到的诱导的全能干细胞。图4B展示了典型的胚胎干细胞。

图5展示了用植物干细胞提取物处理之后的第32天且待转移至饲养细胞层后进行次代培养4次之后观察到的诱导的全能干细胞的碱性磷酸酶染色的结果。

图6A展示了用植物干细胞提取物处理之后的第50天且待转移至饲养细胞层后进行次代培养7次之后观察到的诱导的全能干细胞、及该干细胞的碱性磷酸酶染色的结果。图6B展示了通过使用Yamanaka的四因子病毒(fourfactorvirusesofYamanaka)来诱导人全能干细胞及该干细胞的碱性磷酸酶染色的结果。

图7展示了根据本发明所诱导的全能干细胞中的基因表达。

图8展示了本发明的红杉愈伤组织提取物的HPLC结果。莽草酸具有化学式1的结构。

图9为描述了通过使用本发明的莽草酸或包含莽草酸的植物干细胞提取物来诱导全能干细胞的实验过程的示意图。

图10展示了用莽草酸或红杉愈伤组织提取物处理之后HDF中的Oct3/4基因的表达。

图11展示了用不同浓度的莽草酸处理之后HDF中的Oct3/4基因的表达。

图12展示了用莽草酸或红杉愈伤组织提取物处理之后ALP表达有增加。

图13展示了用不同浓度的莽草酸处理之后ALP表达有增加。

图14展示了用莽草酸或红杉愈伤组织提取物处理之后真皮细胞的集落形成能力。

图15展示了用莽草酸或红杉愈伤组织提取物处理之后真皮细胞的集落形成能力。

图16展示了用不同浓度的莽草酸处理之后真皮细胞的集落形成能力。

图17展示了用不同浓度的莽草酸处理之后真皮细胞的集落形成能力。

图18展示了用莽草酸或红杉愈伤组织提取物处理之后真皮细胞的增殖能力有增加。

具体实施方式

在本文中为了各种目的引入于2013年10月17日提交的韩国专利申请号10-2013-0123860的所有内容。此外，本申请对韩国专利申请号10-2013-0123860请求优先权及由此产生的所有权益，其所有内容通过引用结合到本文中。

在一方面，本发明提供一种用于制备诱导的全能干细胞的方法，该方法包括：

a)从植物干细胞或诱导的全能植物干细胞中提取含有活性成分的提取物的步骤；

b)向源自成体的细胞中注入所述提取物的步骤；和

c)通过培养注入有所述提取物的所述细胞来制备如胚胎干细胞的全能干细胞的步骤。

在另一方面，本发明提供一种用于制备干细胞的方法，该方法包括：通过使用莽草酸、包含莽草酸的植物提取物、包含莽草酸的植物干细胞提取物或包含它们的组合物，来处理源自成体的细胞。

在另一方面，本发明提供一种用于制备干细胞的方法，该方法包括：向源自成体的细胞注入莽草酸、包含莽草酸的植物提取物、包含莽草酸的植物干细胞提取物或包含它们的组合物；及培养所述细胞，该细胞内注入有所述莽草酸、所述提取物或所述组合物。

在本发明中，所述提取物可以为愈伤组织提取物。

在本发明的另一方面，所述植物提取物或所述植物干细胞提取物可以包含莽草酸、咖啡酸和阿魏酸。

在本发明中，“莽草酸”可用化学式1表示且使用的为广义上的概念，包括莽草酸的前体、衍生物等。所述莽草酸可以具有174.15g/mol的分子量。

【化学式1】

在本发明中，“咖啡酸”可以用化学式2表示，且使用的为广义上的概念，包括咖啡酸的前体、衍生物等。所述咖啡酸可以具有180.16g/mol的分子量。咖啡酸为酚类化合物，且包含在咖啡豆，包括梨在内的水果，以及如罗勒、百里香、香蕉、龙蒿、牛至、蒲公英等的药用植物中。

【化学式2】

在本发明中。“阿魏酸”可以用化学式3表示，且是的为广义上的概念，包括阿魏酸的前体、衍生物等。所述咖啡酸可以具有191.18g/mol的分子量。阿魏酸为组成植物细胞壁的木质素的前体且在植物细胞壁中含量丰富。可以在小麦、燕麦、咖啡、苹果、桔子、花生等中的植物籽中发现有阿魏酸。

【化学式3】

在本发明中，术语“干细胞”是指，可以不受限制地增殖的主细胞以形成针对于各种组织和器官的细胞。所述干细胞为可发展的全能或全能细胞。一个干细胞可以分裂成两个女儿干细胞、或一个女儿干细胞和一个转运细胞(transitcell)。

在本发明中，术语“胚胎干细胞”是指，从受精后进行培养的早期胚胎，即囊胚的内细胞团中分离出来的全能细胞。

在本发明中，术语“去分化的干细胞或诱导的全能干细胞(iPS)提取物”是指，在试管内利用物理/化学方法将通过使用各种方法诱导并培养的去分化的干细胞或诱导的全能干细胞(iPS)切细后、通过离心等分离来获得的物质。

在本发明中，术语“植物干细胞”是指，源自形成层中的植物干细胞。尤其，所述植物干细胞包括夹在木质部与韧皮部之间的边界上的形成层中所发现的物理上完整无缺的、纯的形成层分生细胞(CMC，cambialmeristematiccell)。在本发明中，术语“植物干细胞”使用广义上的概念，包括通过各种方法诱导的任何种类的诱导的全能干细胞。

在本发明中，术语“愈伤组织”是指无组织的薄壁细胞团，代表性例子为由围绕在植物伤口的分生组织形成的肿瘤组织。所述植物组织大致分为显示细胞分裂的分生组织和未能细胞分裂的永久组织。将分生组织的细胞在营养培养基内进行培养时，起初会形成愈伤组织。然后形成不定胚，接着被分化成植物器官。所述愈伤组织通常被称为“植物干细胞”。在本发明中使用的愈伤组织的种类不受限制。

在本发明中，术语“全能干细胞”是指，具有能够分化成生物的任何三胚层，如内胚层、中胚层和外胚层的多功能性的干细胞。在传统上，胚胎干细胞为属于该范畴内的干细胞。

在本发明中，术语“诱导的全能干细胞”是指，与用来制备所述诱导的全能干细胞的供体细胞在基因上完全相同的全能干细胞。

在本发明中，术语“诱导的全能干细胞”、“去分化的干细胞”和“可诱导的全能干细胞”可以互换使用。

在本发明中，术语“源自成体的细胞”是指源自存活的成体中的细胞，这与胚胎细胞正相反。

在本发明中，术语“分化”是指，在细胞分裂及增殖时使细胞的形态或功能特化的过程。所述细胞的形态或功能会得到改变，以实现生物的细胞、组织等的特异性功能。通常，分化是指，相对简单的系统被分裂成两种或更多在质上不同的子系统的现象。也就是说，将以下现象称作分化，即生物的本质上相同的部分产生差异或作为结果被分裂成在质上不同的系统，如在个体发育期间由卵形成头部或体部，又或肌肉细胞、神经细胞等的区分。

在本发明的一方面，所述植物可以为红杉。

在本发明的一方面，所述植物干细胞可以为愈伤组织。

在本发明的一方面，所述植物干细胞可以为红杉干细胞。

在本发明的一方面，所述植物干细胞提取物可以为愈伤组织提取物。

在本发明的一方面，所述提取物可以为红杉愈伤组织提取物。

在本发明的一方面，所述红杉可以为巨杉(Sequoiadendrongiganteum)。

在本发明的一方面，所述提取物或所述组合物可以包含莽草酸。

在本发明的一方面，所述组合物可以包含基于所述组合物总体积的浓度为10μM-30mM的莽草酸。在本发明的另一方面，所述组合物可以包含以下基于所述组合物总体积的浓度的所述莽草酸、所述植物提取物或所述植物干细胞：10μM或以上、20μM或以上、30μM或以上、50μM或以上、100μM或以上、1mM或以上、5mM或以上、10mM或以上、20mM或以上、或者30mM或以上、且1M或以下、或者100M或以下。当包含于所述组合物中的莽草酸的含量为10μM或以下时，难以获得本发明的效果。而且，当所述莽草酸的含量为30mM或以上时，可以引起皮肤刺激。具体地，可以包含以下基于所述组合物总体积的浓度的所述莽草酸：0.1mM或以上、0.5mM或以上、0.6mM或以上、0.7mM或以上、0.8mM或以上、或者0.9mM或以上、且5mM或以下、4mM或以下、3mM或以下、2mM或以下、1.5mM或以下、1.4mM或以下、1.3mM或以下、1.2mM或以下、或者1.1mM或以下。更具体地，可以包含基于所述组合物总体积的浓度为0.8-1.2mM的莽草酸。最具体地，可以包含基于所述组合物总体积的浓度为1mM的莽草酸。

在本发明的另一方面，所述植物提取物或植物干细胞提取物可以包含基于所述提取物总体积的浓度为0.0001-45％(w/v)的莽草酸。当包含上述范围内的莽草酸时，可以获得优异的Oct3/4基因表达效果、ALP表达效果和成纤维细胞增殖促进效果。鉴于此，在本发明中，所述植物提取物或植物干细胞提取物可以包含基于所述提取物总体积的以下浓度的莽草酸：0.001％(w/v)或以上、0.01％(w/v或以上、0.1％(w/v)或以上、1％(w/v)或以上、5％(w/v)或以上、10％(w/v)或以上、15％(w/v)或以上、20％(w/v)或以上、25％(w/v)或以上、或者30％(w/v)或以上、且45％(w/v)或以下、40％(w/v)或以下、38％(w/v)或以下、36％(w/v)或以下、34％(w/v)或以下、33％(w/v)或以下、或者32％(w/v)或以下。具体地，在本发明中，所述植物提取物或植物干细胞提取物可以包含基于所述提取物总体积的浓度为32-34％(w/v)，更具体为32.75％(w/v)的莽草酸。

在本发明中，所述组合物可以包含这样的基于所述组合物总体积的浓度的植物提取物或植物干细胞提取物：所述提取物中含有的莽草酸的浓度为如上所述的浓度。例如，所述组合物可以包含以下的基于所述组合物总体积的浓度的植物提取物或植物干细胞提取物：0.001μg/mL或以上、0.01μg/mL或以上、0.1μg/mL或以上、1μg/mL或以上、10μg/mL或以上、50μg/mL或以上、100μg/mL或以上、0.3mg/mL或以上、0.4mg/mL或以上、0.5mg/mL或以上、0.6mg/mL或以上、0.7mg/mL或以上、1mg/mL或以上、1.5mg/mL或以上、2mg/mL或以上、5mg/mL或以上、10mg/mL或以上、20mg/mL或以上、或者50mg/mL或以上、且1g/mL或以下、或者10g/mL或以下。

在本发明中，可以通过使用溶剂A(水，含0.1％TFA)和溶剂B(乙腈，含含0.1％TFA)作为流动相的Waters1525μBinaryHPLC泵和Gemini5uC18110A柱(5μm，4.60mmx250nm，Phenomenex)测量所述植物提取物或植物干细胞提取物中含有的莽草酸的浓度。

在本发明中，“红杉”包括红木(北美红杉，Sequoiasempervirens)、巨大红杉(巨杉，Sequoiadendrongiganteum)或水杉(Metasequoiaglyptostroboides)。

红木(北美红杉)为属柏科、松目的树。它只生长于美国的加州西北沿岸和俄勒冈州西南部沿海地区、以及新西兰。它能活约2500-3000年，是世上最高的树，高达112m。红木的直径为2.5-4.5m、高度为50-100m，树皮很厚达到20-30cm。树叶与紫衫的叶子相似，长达1-3cm，具有尖头和清晰的主脉。叶子的上面为黑绿色，底面为发白的颜色。

巨大红杉(巨杉，Sequoiadendrongiganteum)为巨杉属唯一存活的物种。它生长于加州内华达山脉的海拔在1500-2500m的西坡上。它的直径达到3.5-6m、高度达到60-90m，且根部附近的直径为约10m。树叶与雪松的树叶相似。树叶长达1cm、螺旋排列。然而，成熟树枝上的树叶呈鳞片状。

水杉(Metasequoiaglyptostroboides)为水杉属、柏科的唯一存活的物种。它生长的高度达35m。灰褐色的树皮垂直裂开。树枝侧向展开，但树叶相反，树叶的长度为10-23mm、宽度为1.5-2mm。在秋季，尖叶变成淡红色。2月至3月将盛开雌雄同体的鲜花。雄花会以总状花序挂在树枝的腋尖上，具有20枚雄蕊。雌花挂在枝头的尖端，且在三月绽放。球果为球形，长达18-25mm。它们成熟后变成棕色，并产生带翅膀的椭圆形种子。落叶针叶树原产于中国的四川省和湖北省，且分布于韩国、中国等。主要作为园林树木进行种植。

愈伤组织是指未分化的、无组织的薄壁细胞团，代表性例子为由围绕在植物伤口的分生组织形成的肿瘤组织。所述植物组织大致分为显示细胞分裂的分生组织和未能细胞分裂的永久组织。将分生组织的细胞在营养培养基内进行培养时，起初会形成愈伤组织。然后形成不定胚，接着被分化成植物器官。所述愈伤组织通常被称为“植物干细胞”。

在本发明中，所述“提取物”包括从自然产物中提取的任何物质，而不考虑提取方法、提取溶剂、提取成分或提取类型。“提取物”使用广义的概念，包括通过用不同方法对所述提取物进行加工或处理来获得的物质。

在本发明中，所述红杉可以提取物、植物的粉碎产物或植物的干燥粉碎产物的形式进行使用，但不限于此。此外，本发明所用的红杉的取得方式不受限制。它可以是培植的或购买得到的，且可以为红杉的地上部分、地下部分或两者均包括在内。所述地上部分可以包括红杉的果实、叶子和茎部，且所述地下部分可以包括根部，但不限于此。

在本发明中，所述“植物提取物”包括如红杉的植物中提取物的任何物质，而不考虑提取方法、提取溶剂、提取成分或提取类型。所述“植物提取物”使用广义上的概念，包括通过用热、酸、碱、酶等来处理而提取的物质。此外，所述“植物提取物”还包括通过用不同方法对所述提取物进行加工或处理来获得的物质。

在本发明中，所述“植物干细胞提取物”包括通过培养红杉的植物干细胞并提取活性成分而获得的任何物质，而不考虑提取方法、提取溶剂、提取成分或提取类型。所述“植物干细胞提取物”用在广义上的概念，包括通过用热、酸、碱、酶等来处理而提取红杉等的植物干细胞的活性成分而提取的任何物质。此外，“植物干细胞提取物”还包括通过用不同方法对所述提取物进行加工或处理来获得的物质。

本发明的方法包括通过本领域所知的方法进行的步骤：培养植物干细胞或通过各种方法诱导出来的诱导的全能植物干细胞，然后从中制备提取物。例如，待培养植物干细胞或通过各种方法诱导出来的诱导的全能植物干细胞后，可以用蛋白酶进行处理，而后可以收集上清液。或者，可以在65℃下孵化植物干细胞2小时，然后过滤，来提取源自每个细胞的蛋白或莽草酸。在本发明的一个示例性实施例中，可以使用愈伤组织粉末。

在本发明中，所述红杉愈伤组织提取物可以通过以下步骤获得：i)从红杉诱导出愈伤组织的步骤；ii)通过在固体培养基内培养所述愈伤组织来建立干细胞株的步骤；iii)通过悬浮培养所述细胞株来生成大量的活性成分的步骤；和iv)提取所生成的活性成分的步骤。

在本发明中，来自所述红杉愈伤组织的活性成分的提取可以通过如韩国专利公布号2007-0113193中所述的培养源自所述植物的组织块的细胞株来进行。具体地，来自红杉的稳定的植物细胞株可以通过使用C₅或低级醇的混合物来进行提取，但不限于此。

或者，可以从市场上购买本发明中使用的红杉愈伤组织提取物或红杉愈伤组织粉末。

在本发明中，所述红杉愈伤组织提取物可以通过将红杉愈伤组织粉末溶解于溶剂中来制得。所述溶剂可以包括选自水、有机溶剂、及水和有机溶剂的混合物中的一种或多种物质。所述水可以包括蒸馏水或纯净水，所述有机溶剂可以包括选自如C₁-C₅低级醇的醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、二乙醚、甲基乙基酮和氯仿中的一种或多种与正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、丁二醇(BG)和乙醇(EtOH)的混合溶剂，二甲亚砜(DMSO)等，但不限于此。

本领域的技术人员将容易理解，可使用现有的蛋白提取方法来制备高浓度的蛋白提取物。来自植物的莽草酸或蛋白提取物的基于包含所述提取物的组合物总体积的浓度可以具体为10μg/mL-1mg/mL，更具体为约500μg/mL。当所述蛋白提取物的浓度超过上述范围时，所述诱导的全能干细胞的诱导效率可能会下降，或用所述提取物处理的细胞可能会死亡。

本发明的方法包括如下步骤：将分离自植物干细胞或通过各种方法诱导出来的诱导的全能植物干细胞的蛋白提取物注入源自成体的细胞内。

所述源自成体的细胞可以包括人皮肤成纤维细胞或人新生儿皮肤成纤维细胞。

为了所述注入，可以通过用细胞膜渗透剂(如，链球菌溶血素O或洋地黄)进行处理来对所述细胞进行透化处理，从而可将所述提取物导入所述细胞内。在所述透化处理之后，将所述莽草酸、所述植物提取物、所述植物干细胞提取物、所述诱导的全能植物干细胞或所述组合物通过乳化注入所述源自成体的细胞内。

在本发明的一方面，用于制备全能干细胞的方法可以包括：

1.制备本发明的莽草酸、包含莽草酸的植物提取物、植物干细胞提取物或包含它们的组合物的步骤。

2.将所述莽草酸、所述提取物或所述组合物注入源自成体的细胞的步骤。

3.通过使用普通的培养基培养所述源自成体的细胞的步骤。

4.将所述细胞转移至饲养细胞层后进一步培养的步骤。

5.回收所培养的全能干细胞的步骤。

具体地，将所述莽草酸、所述提取物或所述组合物注入所述源自成体的细胞的步骤可以包括：

1.将源自成体的细胞分离为单独的细胞且将它们进行再悬浮之后转移至管内的步骤；

2.离心分离所述细胞，并在水浴中将所得的细胞沉淀物进行再悬浮的步骤；

3.加入细胞膜渗透剂的步骤；

4.在水浴内上下混合样本而进行反应的步骤；

5.离心分离所述样本的步骤；

6.通过使用莽草酸、所述提取物或所述组合物对所述细胞沉淀物进行再悬浮的步骤；

7.通过ATP再生系统在水浴内上下混合所述样本来进行反应的步骤；

8.加入ES培养基并在孵化器内进行孵化的步骤；及

9.清洗并将所述细胞沉淀物再悬浮在胚胎干细胞培养基内且接种于皿上的步骤。

本发明的方法包括，通过培养注入有所述莽草酸、所述提取物或所述组合物的细胞来制备如胚胎干细胞的全能细胞的步骤。

本发明的方法可以进一步包括，待通过使用普通的细胞培养基培养注入有所述莽草酸、所述提取物或所述组合物的的源自成体的细胞之后转移至饲养细胞层上并进一步培养的步骤。

更为具体地，待注入所述莽草酸、所述提取物或所述组合物后，可通过使用普通细胞培养基(DMEM、5-15％FBS、10-100U/mL青霉素、20-80mg/mL链霉素)培养所述源自成体的细胞，直至形成集落。待形成所述集落后，将所述细胞转移至饲养细胞层上，然后每隔5-8天在胚胎干细胞培养基内进行次代培养且每天更换所述培养基。本发明中所用的饲养细胞可包括STO细胞，但不限于此。

由所述提取物诱导的所述全能干细胞可在DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)/F12内进行培养，在所述DMEM/F12中加入15-25％KSR(knockout血清替代品)、1-42mML-谷氨酰胺、0.05-0.2mM非必需氨基酸、0.05-0.2mMβ-巯基乙醇、30-70U/ml青霉素、30-70mg/mL链霉素和1-30μg/mLbFGF。本领域的技术人员可容易地意识到所述DMEM中加入的化合物的浓度可以根据能够取得本发明的效果的范围内进行变化。

本发明还提供用于诱导诱导的全能干细胞的方法，包括：

a)从植物干细胞或通过各种方法诱导出来的诱导的全能植物干细胞中分离蛋白来制备提取物的步骤；

b)用细胞膜渗透剂处理源自成体的细胞后将所述提取物注入所述源自成体的细胞内的步骤；及

c)在普通的细胞培养基内培养所述提取物注入的细胞后转移至饲养细胞层上并在胚胎干细胞培养基内进行培养的步骤。

本发明的方法，其特征在于，可以通过使用莽草酸、植物提取物、植物干细胞、通过各种方法诱导出来的诱导的全能植物干细胞的提取物或包含它们的组合物来由源自成体的细胞制备几乎与胚胎干细胞没有区别的全能干细胞。

本发明的发明人已经确认，全能干细胞是通过本发明的方法诱导出来的。

具体地，通过本发明的方法诱导的全能干细胞在形状上几乎与胚胎干细胞相一致(见图4)。此外，通过研究对胚胎干细胞(Nanog，Oct4)具有特异性的基因的表达后发现，如在所述胚胎干细胞一样，所述基因也在通过本发明的方法诱导的所述全能干细胞内进行表达(见图7和10)。

在另一方面，本发明提供通过本发明一方面的方法诱导出来的诱导的全能干细胞。

本发明的发明人已通过使用本发明的方法进行次代培养8-12次后确认了作为干细胞的特征的自我更新(见图6)。

在另一方面，本发明提供含有通过本发明一方面的方法制得的全能干细胞的组合物。

在一方面，本发明提供包含作为活性成分、莽草酸、含有莽草酸的植物提取物和含有莽草酸的植物干细胞提取物中一种或多种物质的组合物。

在本发明的一方面，所述组合物可以为药物组合物、食品组合物或化妆品组合物。

在本发明的一方面，所述组合物可以为用于激活干细胞、再生皮肤或抗老化的组合物。

在一方面，本发明可以涉及一种用于激活干细胞的方法，该方法包括，向需要激活干细胞的个体给药莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物的步骤。可根据本发明中所述的给药方法或给药剂量进行所述给药。

在一方面，本发明可以涉及一种用于再生皮肤的方法，该方法包括，向需要皮肤再生的个体进行莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物的给药的步骤。

在一方面，本发明可以涉及一种用于抗老化的方法，该方法包括，向需要抗老化的个体进行莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物的给药的步骤。

在一方面，本发明可涉及莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物对激活干细胞、皮肤再生或抗老化的用途。

在一方面，本发明可涉及一种用于激活干细胞、皮肤再生或抗老化的组合物，该组合物包含莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物。

在本发明的一方面，所述组合物可以为细胞治疗剂。

具体地，所述细胞治疗剂可用于肝细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经元、心肌细胞、血管内皮细胞等的形成。

在一方面，本发明可以涉及一种用于细胞治疗的方法，该方法包括，向需要细胞治疗的个体进行莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物的给药的步骤。

在一方面，本发明可以涉及莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物对细胞治疗的用途。

在一方面，本发明涉及一种用于细胞治疗的组合物，该组合物包含莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物或包含这些物质中的一种或多种的组合物。

如在本发明中的使用，术语“细胞治疗剂”是指，为了用于治疗，诊断和预防，从人体分离并通过培养和特定操作制成的作为药品的细胞或组织(USFDA规定)。生物治疗剂通过在体外增殖和筛选活自体的同源或异源细胞，或通过改变所述细胞的生物特性，以恢复细胞或组织的功能，而用于治疗，诊断和预防的目的。所述细胞治疗剂会根据所述细胞的分化程度大致分为体细胞治疗剂和干细胞治疗剂。具体地，本发明涉及所述干细胞治疗剂。

在一方面，本发明提供一种食品组合物，该食品组合物包含本发明一方面的莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物。在本发明的一方面，所述组合物可以包含其他成分，该其他成分不会对本发明所预期的主要效果产生负面影响。例如，为了改善物理特性，可进一步包含添加剂，如香料、着色剂、杀菌剂、抗氧化剂、防腐剂、保湿剂、增稠剂、矿物质、乳化剂、合成聚合物等。此外，可以进一步包含其他辅助成分，如水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多糖、海藻提取物等。根据剂型类型或使用目的，本领域的技术人员可适当地选取这些成分，且其添加量可以在不违背本发明的目的和效果的范围内进行确定。例如，这些成分的添加量可以为占所述组合物总重量的0.01-5wt％，更具体为0.01-3wt％。在本发明的一方面，所述食品组合物可以包括保健食品组合物、功能性食品组合物、营养补充组合物、加工食品组合物、食品添加剂组合物等，但不限于此。

在一方面，本发明提供一种化妆品组合物，该化妆品组合物包含本发明一方面的莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物。所述化妆品组合物包含化妆品学上或皮肤学上可接受的介质或基质。所述化妆品组合物可以为适用于局部的任一种形式，如乳液、凝胶、固体、无水膏、水包油乳液、油包水乳液、复乳剂、悬浮液、微乳液、微胶囊、离子(脂质体)或非离子型囊泡分散体、泡沫、进一步包含压缩的推进剂气溶胶或贴剂。这些组合物可以根据本领域常用的方法制备。

除了上述物质之外，所述化妆品组合物可以进一步包含其他成分，所述其他成分在对主要效果不产生负面影响的范围内向所述主效果提供协同效果。本领域的技术人员可根据剂型类型或使用目的容易地选取所述其他成分。例如，除了上述活性成分外，本发明的化妆品组合物可以包含通常混合在化妆品组合物中的其他成分。具体例子包括，脂肪、油、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机或无机着色剂、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、灭菌剂、抗氧化剂、稳定剂、增稠剂、甘油、pH调节剂、醇、着色剂、芳香剂、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂、纯净水等。然而，包含在所述化妆品组合物的所述其他成分可以不限于此，且其含量在不违背本发明的目的和效果的范围内进行确定。

所述化妆品组合物的剂型种类不受特别限制，可根据目的适当选取。例如，所述化妆品组合物可被制成选自柔肤水、滋润化妆水、精华液、营养霜、按摩霜、面膜、凝胶、底妆、粉底、粉、口红、贴剂、喷雾剂、眼霜、眼部精华、清洁霜、洁面泡沫、清洗水、清洁剂、洗发剂、护发素、护发产品、头发精华素、洗发剂、头皮和头发滋养剂、头皮精华素、头发凝胶、头发喷雾剂、发膜、身体洗剂、身体霜、身体油和身体精华素，但不限于此。

在一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含本发明一方面的莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物。除了所述活性成分之外，所述药物组合物可进一步包含药物佐剂或其他有助于治疗的物质，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于控制渗透压的盐和/或缓冲液、稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素或甘氨酸)、润滑剂(例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其镁盐或钙盐、或聚乙二醇)、粘合剂(例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或聚乙烯吡咯烷酮)等。在一些情况下，所述药物组合物可进一步包含如崩解剂的其他药物添加剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐、吸收剂、着色剂、调味剂、甜味剂等。

所述药物组合物可根据常用的方法制成用于口服给药或肠胃外给药的剂型。

用于口服给药的剂型可包括，例如，片剂、填充剂、硬/软胶囊、液体、悬浮液、乳剂、糖浆、粉末、细粉、微粒剂，颗粒剂，丸剂等。除了上述活性成分之外，这些剂型可包含表面活性剂、稀释剂(例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸及其镁盐或钙盐、以及聚乙二醇)。片剂可包含粘合剂，如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮，且在一些情况可进一步包含药物添加剂，例如，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐的崩解剂、吸收剂、着色剂、调味剂、甜味剂等。所述片剂可通过常用的混合、制粒或包衣等方法被制成。

用于肠胃外给药的剂型可包括，例如，注射剂、滴剂、软膏、洗剂、凝胶、霜剂、喷雾剂、悬浮液、乳剂、栓剂、贴剂等，但不限于此。

本发明一方面的药物组合物可以肠胃外给药，例如，直肠给药、局部给药、经皮给药、皮下给药等。所述组合物被制成适合于各给药方法的剂型。尤其，用于静脉注射的组合物通过排除不适合的添加剂被制成极高纯度。

所述活性成分的给药剂量会根据待治疗的受试者的年龄、性别、体重、待治疗的具体疾病或病理状态、给药途径或诊断而有所不同。基于这些因素的给药剂量的确定在本领域的技术人员的水平之内。具体地，通常的给药剂量为30μg/mL-1mg/mL，但不限于此。

具体地，在本发明的一方面，包含通过本发明的方法制得的全能干细胞的药物组合物可用作注射剂。与肉毒杆菌(Botox)相似，可将通过本发明的方法制得的全能干细胞注射到皮肤中，用来去除皱纹、激活皮肤干细胞和促进皮肤细胞的增殖，从而产生皮肤再生、抗老化、改善皮肤弹性和改善皱纹的效果。

在另一方面，本发明提供用于实验的试剂或培养基，该试剂或培养基包含本发明一方面的莽草酸、含有莽草酸的植物提取物、含有莽草酸的植物干细胞提取物。

下面，通过实施例详细地说明本发明。然而，以下实施例仅用作说明为目的来使用，且对本领域技术人员显而易见的是，所述实施例不会限制本发明的范围。

【实施例1】向源自成体的细胞内注入植物细胞提取物

将愈伤组织粉末用作来自植物的干细胞提取物。本发明中可使用的愈伤组织粉末不受特别限制，且还可以使用可购买的愈伤组织粉末。

从红杉的叶子中诱导出愈伤组织，在固体培养基中培养所述愈伤组织来建立干细胞株，且通过悬浮培养来产生大量的活性成分，然后进行提取，来获得红杉愈伤组织提取物。来自所述红杉愈伤组织的活性成分的提取可以如在韩国专利公布号2007-0113193中所述的通过培养来自所述植物的组织块的细胞株来进行。具体地，可通过溶解于C₅或低级醇来对源自红杉的稳定的植物细胞株进行提取，但不限于此。

在该实施例中，使用从BIO-FD&C中购买的红杉愈伤组织粉末。具体地，通过使用胰蛋白酶-EDTA将人皮肤成纤维细胞分离成单独的细胞，然后用冷PBS(磷酸盐缓冲液)进行清洗。将所得细胞沉淀物再悬浮在冷的不含Ca²⁺-和Mg²⁺-的HBSS(Hank氏平衡盐溶液)中，形成100,000细胞/100μL，然后转移至1.5mL管内。在4℃下使用横向水平转子离心120g并进行5分钟后，弃上清液，将所剩的细胞沉淀物在97.7μL的冷HBSS中进行再悬浮后，然后在37℃的水浴中孵化2分钟。然后，加入2.3μL链球菌溶血素O(SLO，在冷HBSS中以1:10稀释的100g/mL原液)(最终的SLO浓度为230ng/mL)。或者，代替所述SLO可以加入毛地黄皂苷(20μg/mL)和200μL载液(110mM乙酸钾、5mM乙酸钠、2mM乙酸镁、1mMEGTA、2mMDTT、蛋白酶抑制剂混合物、20mMHEPES，pH值为7.3)。在37℃的水浴中孵化所述样本50分钟，同时每隔10分钟进行上下混合。孵化后，将所述样本置于冰上，在加入200μL冷HBSS后，在4℃下使用横向水平转子离心120g并进行5分钟。在该透化过程后，将所得细胞沉淀物再悬浮于200μL植物干细胞提取物中，形成1000细胞/1μL。愈伤组织用作所述植物干细胞提取物(500μg/mL)。然后，在所悬浮的细胞沉淀物中加入1mM核苷三磷酸和ATP再生系统(10mM磷酸肌酸和25g/mL肌酸激酶)后，在37℃的水浴中孵化1小时，同时每隔10分钟进行上下混合。待孵化后，加入含有2mMCaCl₂的ES培养基，并在37℃的水浴中孵化2小时以进行质膜的重建。用PBS清洗后，将所述细胞沉淀物再悬浮在胚胎干细胞培养基中，然后接种于涂有0.1％明胶的皿上。

【实施例2】通过培养注入有提取物的细胞制备如胚胎干细胞的全能细胞

在维持37℃和5％CO₂的孵化器内，将所述注入有提取物的细胞培养在DMEM中添加有10％FBS、50U/mL青霉素和50mg/mL链霉素的普通细胞培养基内。在涂有0.1％明胶的皿上培养源自成体的细胞(人源真皮成纤维细胞)，所述源自成体的细胞内注入有所述植物干细胞提取物(愈伤组织粉末)。待经过头两天后，更换所述培养基。待培养10天并每天更换培养基后，将所述细胞以1:2比例转移至经过丝裂霉素(MMC)的处理的饲养细胞(STO细胞)层上。然后，每隔7天将所述细胞转移至新的饲养细胞层上，同时每天更换添加有20％KSR(knockout血清替代品)、2mML-谷氨酰胺、0.01mM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、50U/ml青霉素、50mg/mL链霉素和10μg/mLbFGF的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)/F1。要培养出分析所需的诱导的干细胞平均需要约21天。

图1为描述了根据本发明的方法诱导全能干细胞的实验过程的示意图。图2-4分别展示了用植物干细胞提取物处理之后的第5天、第10天和第32天时观察到的诱导的全能干细胞。而且，图5和6分别展示了待培养后的第32天和第50天的碱性磷酸酶染色的结果。通过使用常用的染色试剂盒进行所述碱性磷酸酶染色。

如图6所示，根据本发明的方法诱导出来的所述全能干细胞展示出作为胚胎干细胞的特征的对于所述碱性磷酸酶染色的阳性结果(紫罗兰色)。

【实施例3】诱导的全能干细胞的特征(基因表达分析)

回收所培养的细胞，然后通过使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离出所有的RNA。待通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)合成cDNA后，利用Nanog基因、Oct3/4基因和作为对照基因的GAPDH基因的特异性引物进行PCR。通过在琼脂糖凝胶上上对PCR产物进行电泳来分析这些基因的表达。其结果在图7中展示。

如图7所示，根据本发明的方法诱导出来的所述全能干细胞(hiPS)展示出作为胚胎干细胞(hES)的特征的Nanog和Oct3/4基因的表达。

【实施例4】包含莽草酸的红杉(Sequoiadendrongiganteum)愈伤组织提取物的制备

在1mLDMSO溶剂中溶解20mg实施例1的红杉愈伤组织粉末。类似地，在10mL的BG和EtOH的混合溶剂中溶解1g所述红杉愈伤组织粉末，以制备包含莽草酸的红杉愈伤组织提取物。所制得的提取物在以下测试实施例中用作样本。

【测试实施例1】红杉愈伤组织提取物的组成分析

在实施例4中制得的红杉提取物中，利用HPLC对通过使用BG和EtOH的混合溶剂制得的红杉愈伤组织提取物进行组成分析。

通过使用Waters1525μBinaryHPLC泵和Gemini5uC18110A柱((5μm,4.6mmx250nm,Phenomenex)进行所述提取物的组成分析。溶剂A(水，包含0.1％TFA)和溶剂B(乙腈，包含0.1％TFA)用作流动相，且使用230-nmUV灯。以流速1mL/min进行测量，运行时间为46分钟，且提取物注入体积为20μL。

在图8中展示了所述红杉提取物的LC色谱，其结果在表1中展示。在表1中，面积％表示所述红杉提取物中含有的物质的百分比(％,w/v)。由此可见，在包含莽草酸的红杉愈伤组织提取物中比起任何其他物质含有大量的莽草酸。由此可知，除了所述莽草酸之外，所述红杉愈伤组织提取物包含咖啡酸和阿魏酸。

【表1】

RT面积面积％高度13.58924137797.911225482(莽草酸)4.248999013732.75633894317.11526608958.721462434(咖啡酸)18.666725228323.783630515(阿魏酸)21.672522547317.13320196622.41127753029.10159198728.0441830490.6015075

【测试实施例2-1】Oct3/4表达的增加

用透化缓冲液及10μg/mL毛地黄皂苷处理5x10⁵人新生儿真皮成纤维细胞(NHDF-Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA)，然后分别用20μg/mL实施例4的红杉愈伤组织提取物(BG和EtOH的混合溶剂)或5μg/mL莽草酸处理。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。在处理后的第三天，将所述细胞(5,000细胞)贴在4室玻片上。次日，即第四天，用PBS中的3.8％甲醛(稀释有38％多聚甲醛)固定所述细胞，然后在室温下静置10分钟。然后，通过使用Oct3/4抗体(Genetex,GTX100622,x200)和Alexa488羊抗兔IgG进行免疫组化，而后用CarlZeiss共聚焦显微镜LSM510获得400倍的图像。所得图片在图10中展示。Oct3/4阳性细胞的比例可通过分析从所述Oct3/4ICC实验中获得的CarlZeiss共聚焦显微镜图像来测定，每个样本分析4张或以上，平均分析5张。其结果在表2中展示。

【表2】

如图10所示，用实施例4的红杉愈伤组织提取物处理的HDF比普通的HDF(阴性对照组)展示出所述Oct3/4基因的表达有增加，且与用莽草酸处理相比表达更高。

此外，从表2中可知，对Oct3/4基因呈阳性的细胞百分数为在用BG(丁二醇)和EtOH的混合溶剂提取所述红杉愈伤组织提取物时最高，达到33％，这比用莽草酸提取更高。

【测试实施例2-2】Oct3/4表达的增加

分别用10μM或10mM莽草酸处理1x10⁶人新生儿真皮成纤维细胞(NHDF-Neonatal)(CC-2509,Lonza,USA)。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。在处理后的第5天，将所述细胞(5,000细胞)贴在4室玻片上。经过三天后，即第8天，用PBS中的3.8％甲醛(稀释有38％多聚甲醛)固定所述细胞，然后在室温下静置10分钟。然后，通过使用Oct3/4抗体(Genetex,GTX100622,x200)和Alexa488羊抗兔IgG进行免疫组化，而后用CarlZeiss共聚焦显微镜LSM510获得400倍的图像。所得图片在图11中展示。Oct3/4阳性细胞的比例可通过分析从所述Oct3/4ICC实验中获得的CarlZeiss共聚焦显微镜图像来测定，每个样本分析4张或以上，平均分析5张。其结果在表3中展示。

【表3】

如图11中所示，用莽草酸处理的HDF与未处理的普通HDF(阴性对照组)相比展示出所述Oct3/4基因的表达有增加。所述Oct3/4基因的表达随着与用莽草酸的浓度增加。

此外，从表3中可知，在水中用莽草酸处理时对Oct3/4基因呈阳性的细胞百分数为平均27-29％。该值明显高于所述未处理组。

从上述结果可知，可以确认的是，作为所述红杉愈伤组织提取物的主要成分的莽草酸能够有效地增加在诱导的全能干细胞的诱导中起核心作用的Oct3/4基因的表达。因此，通过向体细胞内注入本发明的莽草酸或包含莽草酸的提取物来使Oct3/4基因进行表达，从而可以诱导所述诱导的全能干细胞。

【测试实施例3-1】干细胞标记碱性磷酸酶(ALP)的表达的增加

用透化缓冲液和10μg/mL毛地黄皂苷处理5x10⁵NHDF-Neonatal(CC-2509,Lonza,USA)，然后分别用20μg/mL实施例4的红杉愈伤组织提取物(BG和EtOH的混合溶剂)或5μg/mL莽草酸进行处理。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。在处理后的第6天，将所述细胞(5,000细胞)贴在12孔板上。经过五天后，即第11天，用PBS中的3.8％甲醛固定所述细胞，然后在室温下静置15分钟。然后，用稀释于10mLALP缓冲液中的200μLALP基质溶液处理所述细胞，每次处理0.5mL。待20小时后，在OlympusCKX41光学显微镜下放大40倍来观察所述细胞。其结果在图12中展示。

如图12所示，用所述红杉愈伤组织提取物处理过的HDF比普通的HDF展示出更大的染区，这表明ALP的表达有明显增加。此外，由此可知，用述红杉愈伤组织提取物处理过的细胞比用所述莽草酸处理过的细胞展示出更高的ALP表达。

当成纤维细胞转化成诱导的全能干细胞的过程中，如Oct4的基因在细胞中表达3天后ALP开始表达。已知，ALP为在去分化的干细胞的形成早期起重要作用的标记。因此，将本发明的红杉愈伤组织提取物注入于体细胞内时，ALP的表达有显著增加且会表达Oct4基因。因此，可以诱导出诱导的全能干细胞。

从该实验结果可确定，本发明的红杉愈伤组织提取物展示出通过促进所述干细胞标记ALP的表达的激活干细胞的显著效果。

【测试实施例3-2】干细胞标记碱性磷酸酶(ALP)的表达的增加

分别用10μM或10mM的莽草酸处理1x10⁶NHDF-Neonatal(CC-2509,Lonza,USA)。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。在处理后的第5天，将所述细胞(100,000细胞)贴在6孔板上。经过7天后，即第12天，用PBS中的3.8％甲醛固定所述细胞，然后在室温下静置15分钟。然后，用稀释于10mLALP缓冲液中的200μLALP基质溶液处理所述细胞，每次处理0.5mL。待20小时后，在OlympusCKX41光学显微镜下放大40倍来观察所述细胞。其结果在图13中展示。

如图13所示，用所述莽草酸处理过的HDF比普通的HDF展示出更大的深蓝色染区，这表明ALP的表达有明显增加。此外，由此可知，ALP的表达会随着所述莽草酸的浓度而增加。

当成纤维细胞转化成诱导的全能干细胞的过程中，如Oct4的基因在细胞中表达3天后ALP开始表达。已知，ALP为在去分化的干细胞的形成早期起重要作用的标记。因此，将本发明的莽草酸和包含莽草酸的植物提取物注入于体细胞内时，ALP的表达有显著增加且会表达Oct4基因。因此，可以诱导出诱导的全能干细胞。

从该实验结果可确定，本发明的莽草酸和包含莽草酸的植物提取物展示出通过促进所述干细胞标记ALP的表达来激活干细胞的显著效果。

【测试实施例4-1】真皮细胞的集落形成能力的增加

用透化缓冲液和10μg/mL毛地黄皂苷处理5x10⁵NHDF-Neonatal(CC-2509,Lonza,USA)，然后分别用100ppm或200ppm的已用0.4μm过滤器过滤的实施例4的红杉愈伤组织提取物(BG和EtOH的混合溶剂)和20ppmDMSO溶液进行处理。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。在处理后的第10天，将所述细胞(200细胞)贴在60-mm板上。第23天，用冰冷的PBS清洗所述细胞，然后用保存于-20℃的冰冷的甲醇进行固定10分钟。用实验溶液(workingsolution)处理5-10分钟来对所述细胞进行染色，所述实验溶液是将乙醇原液中的结晶紫用PBS稀释成1/10来制得，用PBS清洗4次，然后拍照。为了进行定量分析，通过用由50％乙醇、40％DW和10％乙酸组成的洗脱缓冲液进行处理，来洗脱所述细胞5分钟。然后，将200μL所述细胞转移至96孔板上后，在580nm下测量吸光度。所获得的照片图14中展示。而且，相对于所述阴性对照组的吸光度测量的结果在图15中展示。

如图14所示，用所述红杉愈伤组织提取物处理过的细胞比阴性对照组NHDF-Neonatal展示出更大的染区，这表明表皮细胞的分化活跃，并形成大的集落。

此外，如图15所示，用所述红杉愈伤组织提取物处理过的细胞的集落形成能力比阴性对照组增加约2.6倍，这在统计学上是显著的。用所述莽草酸处理过的细胞比所述阴性对照组增加约3.8倍。

由此可知，本发明的红杉愈伤组织提取物通过显著促进成纤维细胞的增殖来促进皮肤再生。

此外可知，本发明的红杉愈伤组织提取物是通过显著促进成纤维细胞的增殖来展示促进皮肤再生的效果。

【测试实施例4-2】真皮细胞的集落形成能力的增加

分别用10μM、50μM、100μM、1mM或10mM的莽草酸处理1x10⁶NHDF-Neonatal(CC-2509,Lonza,USA)。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。在进行次代培养后的第5天，将所述细胞(200细胞)贴在60-mm板上。第17天，用冰冷的PBS清洗所述细胞，然后用保存在-20℃的冰冷的甲醇进行固定10分钟。用实验溶液(workingsolution)处理5-10分钟来对所述细胞进行染色，所述实验溶液是将乙醇原液中的结晶紫用PBS稀释成1/10来制得，用PBS清洗4次，然后拍照。为了进行定量分析，通过用由50％乙醇、40％DW和10％乙酸组成的洗脱缓冲液进行处理，来洗脱所述细胞5分钟。然后，将200μL所述细胞转移至96孔板上后，在580nm下测量吸光度。所获得的照片在图16中展示。而且，相对于所述阴性对照组的吸光度测量的结果在图17中展示。

如图16所示，用所述莽草酸处理过的细胞比阴性对照组NHDF-Neonatal展示出更大的染区，这表明表皮细胞的分化活跃，并形成大的集落。

此外，如图17所示，用所述述莽草酸处理过的细胞的集落形成能力比阴性对照组增加约21.27-5.06倍，这在统计学上是显著的。尤其，用1mM莽草酸处理的细胞展示出最高的集落形成能力。因此可知，1mM莽草酸的处理能够最大程度地促进细胞增殖。

由此可知，本发明的莽草酸能够显著地促进成纤维细胞的增殖。

此外可知，本发明的莽草酸能够通过显著促进成纤维细胞的增殖来促进皮肤再生。

【测试实施例5】真皮细胞的增殖能力的增加

将2,000NHDF-Neonatal(CC-2509,Lonza,USA)贴在96孔板上。次日，用20μg/mL实施例4的红杉愈伤组织提取物(BG和EtOH的混合溶剂)和5μg/mL莽草酸进行处理。将未处理的NHDF-Neonatal用作阴性对照组。然后，进行次代培养7天(在第7天，汇合变成90％或以下)。经过6天后，处理10μL的WST-1，然后在450nm测量吸光度。相对于所述阴性对照组的结果在图18中展示。

如图18所示，与所述阴性对照组相比，用本发明的红杉愈伤组织提取物的处理让细胞分裂增加了1.5倍或以上，这在统计学上是显著的。而且，与普通的对照组相比，所述莽草酸让细胞分裂增加了2倍。

由此可知，本发明的红杉愈伤组织提取物能够明显地促进成纤维细胞的细胞分裂。

此外可知，本发明的红杉愈伤组织提取物能够通过显著促进成纤维细胞的细胞分裂来促进皮肤再生。

本发明的上述说明仅作为说明而使用，且本领域的技术人员理解，在不脱离本发明的技术精神和范围内可以容易地对此进行改变。因此，上述实施例应解释为具有示例性。

下面，将描述所述组合物的剂型实施例。然而，以下剂型实施例仅用于说明的目的。

【剂型实施例1】软胶囊

根据常用方法，混合40μg莽草酸或实施例4的红杉愈伤组织提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、2mg棕榈油、8mg氢化植物油、4mg黄色蜂蜡和9mg卵磷脂。除此之外，使用明胶66重量份、甘油24重量份和山梨糖醇液10重量份来制备软胶囊片，其中填充上述混合物来制备包含有400mg本发明的组合物的软胶囊。

【剂型实施例2】片剂

混合40μg莽草酸或实施例4的红杉愈伤组织提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、200mg低聚半乳糖、60mg乳糖和140mg麦芽糖，并用流化床干燥机进行制粒。待加入6mg糖酯后，通过常用方法将500mg所得组合物制成片剂。

【剂型实施例3】饮剂

混合40μg莽草酸或实施例4的红杉愈伤组织提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、10g葡萄糖、0.6g柠檬酸和25g寡糖糖浆，待加入300mL纯净水后，每瓶中填充200mL所得混合物，并在130℃下灭菌4-5秒。

【剂型实施例4】颗粒剂

混合40μg莽草酸或实施例4的红杉愈伤组织提取物、9mg维生素E、9mg维生素C、250mg无水结晶葡萄糖和550mg淀粉，并通过使用流化床干燥机进行制粒，然后装袋。

【剂型实施例5】注射剂

如表4中的描述，通过常用方法制备注射剂(2mL安瓿)。

【表4】

成分含量实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物40μg灭菌的用于注射的蒸馏水适量pH调节剂适量

【剂型实施例6】柔肤水(皮肤化妆水)

如表5中的描述，通过常用方法制备柔肤水。

【表5】

成分含量(wt％)实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物0.2甘油3.0丁二醇2.0丙二醇2.0聚羧乙烯0.1PEG-12壬基苯基醚0.2聚山梨酯800.4乙醇10.0三乙醇胺0.1防腐剂、着色剂和香料适量纯净水余量

【剂型实施例7】滋养化妆水

如表6中的描述，通过常用方法制备滋养化妆水。

【表6】

成分含量(wt％)实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物1.0甘油3.0丁二醇3.0丙二醇3.0聚羧乙烯0.1蜂蜡4.0聚山梨酯601.5辛酸/癸酸甘油三酯5.0角鲨烷5.0失水山梨醇倍半油酸酯1.5液体石蜡0.5鲸蜡硬脂醇1.0三乙醇胺0.2防腐剂、着色剂和香料适量纯净水余量

【剂型实施例8】营养霜

如表7中的描述，通过常用方法制备营养霜。

【表7】

成分含量(wt％)实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物2.0甘油3.0丁二醇3.0液体石蜡7.0β-葡聚糖7.0卡波姆0.1辛酸/癸酸甘油三酯3.0角鲨烷5.0鲸蜡硬脂基葡糖苷1.5山梨坦硬脂酸酯0.4聚山梨酯601.2三乙醇胺0.1防腐剂、着色剂和香料适量纯净水余量

【剂型实施例9】按摩霜

如表8中的描述，通过常用方法制备按摩霜。

【表8】

成分含量(wt％)实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物2.0甘油8.0丁二醇4.0液体石蜡45.0β-葡聚糖7.0卡波姆0.1辛酸/癸酸甘油三酯3.0蜂蜡4.0鲸蜡硬脂基葡糖苷1.5失水山梨醇倍半油酸酯0.9矿脂3.0石蜡1.5防腐剂、着色剂和香料适量纯净水余量

【剂型实施例10】面膜

如表9中的描述，通过常用方法制备面膜。

【表9】

成分含量(wt％)实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物0.2甘油4.0聚乙烯醇15.0玻尿酸提取物5.0β-葡聚糖7.0尿囊素0.1壬基苯基醚0.4聚山梨酯601.2乙醇6.0防腐剂、着色剂和香料适量纯净水余量

【剂型实施例11】保健食品

如表10中的描述，通过常用方法制保健食品。

【表10】

成分含量实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物20μg维生素A醋酸酯70μg维生素E1.0mg维生素B₁0.13mg维生素B₂0.15mg维生素B₆0.5mg维生素B₁₂0.2μg维生素C10mg生物素10μg烟酰胺1.7mg叶酸50μg泛酸钙0.5mg硫酸亚铁1.75mg氧化锌0.82mg碳酸镁25.3mg磷酸二氢钾15mg磷酸氢钙55mg柠檬酸钾90mg碳酸钙100mg氯化镁24.8mg

上述的维生素和矿物质的混合物的组成仅作为示例展出，根据需要可以进行改变。

【剂型实施例12】保健饮料

如表11中的描述，通过常用方法制保健饮料。

【表11】

成分含量实施例4的莽草酸或红杉愈伤组织提取物20μg柠檬酸1000mg寡糖100g牛磺酸1g纯净水余量

根据常用的保健饮料制备方法，混合上述成分，并在85℃下搅拌加热约1小时。所得溶液被过滤并灭菌。

【剂型实施例13】包含全能干细胞的注射剂

如表12中的描述，通过常用方法制包含全能干细胞的注射剂。

【表12】

成分含量实施例2的全能干细胞40μg用于注射的灭菌蒸馏水适量pH调节剂适量

虽然已展示并说明了所述示例性实施例，本领域的技术人员理解的是，在不脱离本发明的权利要求中所限定的精神和范围内，可以在形式和细节上对所述示例性实施例做各种改变。