一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法

摘要

本发明提供了一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法，分别以待鉴定甘蔗和“POJ2878”的基因组DNA为模板，利用引物1和引物2进行扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，与抗褐锈病甘蔗品种POJ2878的酶切产物进行比较，来判断所待鉴定甘蔗的抗病性。本发明方法可用于甘蔗抗褐锈病基因的图位克隆和分子标记辅助选择，通过检测抗褐锈病基因位点来预测待鉴定甘蔗对褐锈病的抗性，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率，进而加速甘蔗抗褐锈病育种进程。

说明书

技术领域

本发明属于甘蔗分子生物学及甘蔗抗性鉴定技术领域。更具体涉及一个与甘蔗抗 褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记鉴定方法，同时还涉及该分子标记在甘蔗抗褐锈病育 种中的应用。

背景技术

甘蔗是世界上最重要的糖料作物和重要的低碳经济作物，蔗糖长期占世界食糖总 产72%以上，其光合效率为C4作物之首，具有高光效特性、生长巨型性、可多年宿根栽培和大 量固定CO₂等特性，在适宜条件下亩产糖可高达1吨以上，也是迄今生物量最高的栽培作物。 我国为世界第三产糖国和第二食糖消费国，蔗糖占我国食糖总产92%以上，甘蔗对保证我国 食糖安全和发展低碳经济有不可替代的作用。根据ISSCT统计，甘蔗品种改良的科技贡献率 高达60%。但是，随着甘蔗褐锈病的爆发和流行，致使一些丰产高糖当家品种如Co475、 T34362和CP78-1247被淘汰，极大地影响了蔗糖产业的持续稳定发展。

由黑顶柄锈菌(PuccinamelanocephalaH.Sydow＆P.Sydow)引起的甘蔗褐 锈病是一种重要的世界性甘蔗病害，严重危害甘蔗生长，对蔗农造成巨大的经济损失。该病 自1890年在爪哇首次被发现以来，随后迅速扩散到世界上多数植蔗国家和地区，在古巴、牙 买加、澳大利亚、美国、墨西哥、印度、泰国和毛里求斯等植蔗国家和地区普遍发生，并多次 暴发流行。我国台湾1977年首次发生甘蔗锈病，1982年首次在中国大陆云南甘蔗种植区发 现该病害，之后在福建、广东、四川、江西和广西等蔗区先后报道。目前，该病在国内蔗区普 遍发生和蔓延危害，造成甘蔗种质退化、产量降低。发病田块一般减产15％～30％，严重地 块减产幅度可达40％以上，蔗糖含量降低10％～36％。尤其近年，我国蔗区主栽的一批丰产 高糖品种如“桂糖15”、“桂糖17”、“桂引9号”和主推品种“粤糖60号”和“德蔗03-83”等也因 高度感染锈病而面临淘汰。

甘蔗锈病的流行与品种抗病性密切相关，大面积种植感病品种是病害流行的重要 原因，选育和种植抗病品种是防治该病最经济有效的措施。而抗病种质资源的发掘利用是 抗病育种的基础和关键。目前，我国对甘蔗锈病抗病资源的筛选鉴定和评价还停留在人工 接种表型观察选择，尚未开展抗锈病基因标记选择研究。传统的人工接种表型选择抗病性 的方法耗时、低效，鉴定结果易受病原和环境因素影响，难以满足育种家对抗病育种要求。 因此，为了保证国家的甘蔗产业可持续健康发展的进行，提高我国甘蔗生产技术水平，迫切 需要建立一种简便、快速、准确、灵敏的鉴定甘蔗抗褐锈病方法，是甘蔗抗褐锈病分子育种 最关键的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法， 鉴定或辅助鉴定甘蔗抗褐锈病的方法及其在甘蔗抗褐锈病育种中的应用。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定甘蔗抗褐锈病的方法，包括如下步骤：分别以待 鉴定甘蔗和POJ2878的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列表中序列2所示的两 条单链DNA组成的PCR引物对进行PCR扩增，将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶 HaeIII进行酶切，通过电泳检测扩增产物，按照如下方法确定待鉴定甘蔗对褐锈病的抗 性：

如果待鉴定甘蔗的PCR扩增产物电泳条带有与POJ2878带型相同的条带，且大小为 389bp则待鉴定甘蔗为抗褐锈病甘蔗或候选为抗褐锈病甘蔗，如果待鉴定甘蔗的PCR扩增 产物电泳条带没有与POJ2878带型相同的条带，则待鉴定甘蔗为非抗褐锈病甘蔗为或为候 选非抗褐锈病甘蔗；所述待鉴定甘蔗为桂糖35和科5的杂交后代，上述方法中，所述待鉴定 甘蔗具体选自桂糖35（抗褐锈病）和科5（感褐锈病）的杂种后代中的F1单株。在本发明的一 个实施例中，所述待鉴定甘蔗具体选自桂糖35和科5的杂种后代中的F1单株。

具体为：

包括如下步骤：分别以待鉴定甘蔗和“POJ2878”的基因组DNA为模板，PCR扩增体系：2 ×PremixExTaqMixPCRBuffer12.5μL，10μmol/L引物1和引物2各0.5μL，25ng/μL模板 DNA2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL；扩增程序如下：94℃5min；94℃30S，56℃ 30S，72℃40S，34个循环；72℃7min。

将扩增的PCR产物利用限制性核酸内切酶HaeIII进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳 检测酶切产物，按照如下方法确定待鉴定甘蔗对褐锈病的抗性：如果待鉴定甘蔗的酶切产 物电泳条带有与POJ2878带型相同的条带，则待鉴定甘蔗为抗褐锈病甘蔗，如果待鉴定甘蔗 的酶切产物电泳条带没有与POJ2878带型相同的条带，则待鉴定甘蔗为非抗褐锈病甘蔗。酶 切产物经过胶回收及测序，该抗性片段大小为389bp，其余条带为非特异性扩增。

所述引物1为：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；所述引物2为：417-5’- CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。

本发明具有以下优点：

本发明的引物对是与Bru1基因位点紧密连锁的标记，是基于PCR和酶切技术产生的共 显性标记，因而可靠且使用方便，与以往的抗褐锈病标记相比，具有与目标基因Bru1紧密连 锁、准确性高、检测效率高、成本低廉等优点。

1.紧密连锁：实验证明，利用本方法对甘蔗育种材料辅助鉴定的结果与抗性鉴定 结果完全一致，表明该方法用于甘蔗抗褐锈病育种的分子标记辅助选择。

2.准确性高:与以往的抗褐锈病标记相比，该检测方法克服假阳性高、稳定性差 等问题。

3.成本低廉：本研究使用限制性内切酶HaeIII属于廉价的四碱基内切酶，而其他 方法使用是昂贵的六碱基核酸内切酶RsaI。

本发明通过对甘蔗抗褐锈病基因的定位，开发与其紧密连锁的分子标记方法，该 方法可用于抗病基因的图位克隆和分子标记辅助选择，通过检测抗褐锈病基因位点来预测 甘蔗对褐锈病的抗性，可以在甘蔗的实生苗阶段进行淘汰选择，不仅节约生产成本而且大 大提高选择效率，进而加速甘蔗抗褐锈病育种进程。

附图说明

图1PCR扩增后直接进行电泳分析结果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.分 别代表甘蔗样品编号为甘蔗品种POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136，粤甘35 号，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合庆割手密，云南83-215，贵州78-2-04。

图2PCR产物利用RsaI酶切后进行电泳分析结果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10.分别代表甘蔗样品编号为甘蔗品种POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05-136， 粤甘35号，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合庆割手密，云南83-215，贵州78-2-04。

图3PCR产物利用HaeIII酶切后进行电泳分析结果。M:Marker,1,2,3,4,5,6,7, 8,9,10.分别代表甘蔗样品编号为甘蔗品种POJ2878，云蔗91-510，云蔗03-194，柳城05- 136，粤甘35号，崖城05-179和割手密福建89-1-1，云南合庆割手密，云南83-215，贵州78-2- 04。

图424个F1单株经过PCR扩增后利用HaeIII酶切的电泳结果。其中1-24是桂糖35 （抗褐锈病）和科5（感褐锈病）的杂交后代。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中所有的甘蔗和割手密材料均从云南省农科院（国家甘蔗种质资源圃资 源）提供。

实施例1利用RBS引物对上述10种不同甘蔗品种进行PCR扩增，分别通过不同核酸 内切酶比较，验证本发明方法的准确性和特异性。

提取甘蔗的核酸DNA，利用RBS标记引物进行PCR扩增，采用Eppendorf MastercyclerEPPCR热循环仪5333型基因扩增仪。25μLPCR反应体系组成:10×PCR Buffer(Mg²⁺)2.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2μL，引物1和引物2（10μmol/L）各0.5μL，ExTaq 酶（5U/μL）0.125μL，模板DNA（25ng/μL）2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL。PCR扩增条 件:94℃5min；94℃30S，56℃30S，72℃40S，34个循环；最后72℃延伸7min 后4℃保存备用。反应结束后将所得PCR产物用于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，剩余部分PCR 产物进行酶切验证。

酶切体系：取RBS的PCR产物10μL、10×M缓冲液2.5μL、HaeIII(10000U) 1.0μL、加ddH₂O6.5μL补足25μL进行酶切，酶切反应程序为37℃2h、65℃10min， 酶切结束取酶切反应产物10μL，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测验证。

所述引物1为：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；所述引物2为：417-5’- CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。

电泳结果表明：从图1所示结果表明，利用RBS引物对上述10种甘蔗材料进行PCR扩 增，所有材料都得到扩增，没有假阴性结果出现，表明本研究所验证的PCR反应体系完全正 常，符合检测要求。图2和图3分别为PCR产物利用RsaI酶与HaeIII酶酶切后进行电泳比较分 析，从图2和图3中可以看出，泳道1、泳道2、泳道3、泳道4分别在191bp和389bp的位置出 现目标条带，且图3所示HaeIII酶酶切产物亮度显著高于RsaI酶产物亮度，结果表明上述4 种甘蔗品种均为抗褐锈病材料，且本研究建立的HaeIII酶酶切体系优于RsaI酶酶切体系。 但是从图2的泳道8、泳道9、泳道10的191bp的位置也出现了目标条带，但是经过测序分析， 发现该条带并非目标条带，为假阳性条带。但是通过图3可以得出，PCR产物利用HaeIII酶切 后发现目标位置没有出现阳性条带，说明本研究建立的甘蔗抗褐锈病检测方法克服了以前 的酶切鉴定中存在假阳性问题，具有很高的特异性。

实施例2利用RBS引物对桂糖35（抗褐锈病）和科5（感褐锈病）的杂种后代中的F1 单株进行验证

分别提取24种杂交群体F1单株DNA样品，按照传统的核酸提取方法CTAB法，以纯化后 的基因组DNA作为模板，利用上述引物对进行PCR扩增，采用EppendorfMastercyclerEP PCR热循环仪5333型基因扩增仪。25μLPCR反应体系组成:10×PCRBuffer(Mg2+)2.5μ L，dNTP（2.5mmol/L）2μL，正反向引物（10μmol/L）各0.5μL，ExTaq酶（5U/μL）0.125μL， 模板DNA（25ng/μL）2μL，加灭菌双蒸水使总体积为25μL。PCR扩增条件:94℃5min；94 ℃30S，56℃30S，72℃40S，34个循环；最后72℃延伸7min后4℃保存备用。反应 结束后将所得PCR产物用于1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，剩余部分进行酶切验证。酶切体系： 取9O20-F4标记PCR产物10μL、10×M缓冲液2.5μL、HaeIII(10000U)1.0μL、加ddH₂O 6.5μL补足25μL进行酶切，酶切反应程序为37℃2h、65℃10min，酶切结束取酶切反 应产物10μL，以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

所述引物1为：29-5’-TTTATAAATTACCATTAAGGACCAT-3’；所述引物2为：417-5’- CAGCATTTAAGATGGCATAGGCGTC-3’。

申请人采用本方法检测杂交后代F1的24个单株DNA样品，结果发现该方法检测结 果稳定可靠、条带亮度高、检测准确性极高，没有出现假阳性结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建农林大学

<120>一种鉴定甘蔗抗褐锈病基因位点紧密连锁的分子标记方法

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<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

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