一种预防金黄色葡萄球菌感染的ATT融合蛋白的制备及应用

摘要

本发明涉及一种ATT融合蛋白，是在金黄色葡萄球菌TRAP融合蛋白的氨基酸序列前用Linker连接了白色念珠菌Als3T细胞表位的9个氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还涉及编码ATT融合蛋白的基因、ATT融合蛋白的制备方法以及应用。本发明的ATT融合蛋白免疫接种小鼠，并进行免疫检测和攻毒试验，结果表明ATT融合蛋白能够诱导机体产生更坚强的免疫应答和抗金黄色葡萄球菌感染作用，是预防金黄色葡萄球菌感染理想的疫苗候选抗原。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种预防金黄色葡萄球菌感染的ATT融合蛋白的制备及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一种自然界中普遍存在的革兰氏阳性致病菌，是引起人类医院和社区感染最为常见的原因，严重危害人类健康。S.aureus也是奶牛乳房炎的主要病原，给奶业造成巨大经济损失。以往对金黄色葡萄球菌感染主要采用抗生素治疗，但随着抗生素的广泛使用，出现了大量耐药菌，使抗菌药物疗效不佳。越来越多的人意识到疫苗是预防金黄色葡萄球菌感染的首选。研究表明，抗金黄色葡萄球菌感染过程中，细胞免疫应答特别是Th1和Th17细胞起着关键作用，能够调节增强CD8⁺T细胞和B细胞反应、将先天性免疫细胞募集到炎症部位并增强其对S.aureus的杀伤、清除能力。

金黄色葡萄球菌TRAP(targetofRNAIII-activatingprotein)具有抗氧化应激作用，可以防止细菌DNA因氧化而引起的基因突变，而且TRAP能诱导机体产生良好的免疫保护作用。Als3是白色念珠菌的粘附因子，能够诱导机体产生坚强的细胞免疫应答，对金黄色葡萄球菌具有交叉免疫效果。进一步研究证实，在Als3蛋白中存在着一个T细胞表位，能够诱导机体产生良好的Th1和Th17细胞免疫应答。为了进一步增强TRAP诱导机体产生抗金黄色葡萄球菌免疫保护作用，更有效地预防金黄色葡萄球菌感染，可以考虑将金黄色葡萄球菌TRAP蛋白与Als3蛋白中的T细胞表位进行融合表达，以获取更好的免疫作用。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种ATT融合蛋白，将金黄色葡萄球菌TRAP蛋白与Als3蛋白中的T细胞表位进行融合表达而成，以获取更好的免疫作用。

本发明的第二目的是提供上述ATT融合蛋白的编码基因。

本发明的第三目的是提供上述ATT融合蛋白的制备方法。

本发明的第四目的是提供上述ATT融合蛋白的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种ATT融合蛋白，是在金黄色葡萄球菌TRAP融合蛋白的氨基酸序列前用Linker连接了白色念珠菌Als3T细胞表位的9个氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

二、编码上述的ATT融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

三、上述的ATT融合蛋白的制备方法，是将上述的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，纯化得融合蛋白。

四、上述的ATT融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。首先以金黄色葡萄球菌基因组为模板，通过PCR方法扩增获得trap基因片段。之后设计引物，引物中包含白色念珠菌Als3的T细胞表位的基因及Linker。通过PCR方法扩增获得Trap和Als3T细胞表位的融合基因，并将该基因插入到表达载体pET-28a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后可获得高水平表达的可溶性融合蛋白ATT。

本发明进一步提供上述融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。具体为：利用该融合蛋白N末端含有的6个连续His残基能与Ni²⁺柱结合的特性，选用MagneHisTM蛋白纯化系统进行纯化，并将纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备疫苗免疫小鼠，然后进行免疫原性和免疫保护作用研究。

采用上述技术方案的积极效果：本发明选取Als3的T细胞表位与TRAP蛋白融合，制备成重组ATT融合蛋白，并对其进行免疫原性研究，结果证实将Als3的T细胞表位与TRAP蛋白融合后能诱导机体产生较好的免疫保护作用，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及诱导更机体产生强的免疫保护作用。

附图说明

图1为ATT融合蛋白扩增方法示意图；

图2为ATT，TRAP的PCR产物电泳分析结果。其中，1为ATT的PCR产物，558bp；2为TRAP的PCR产物结果，498bp；M为DNAMarkerDL8000；

图3为重组质粒ATT-pET28a、TRAP-pET28a和eAls-pET28a表达载体重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定结果。A图为ATT-pET28a酶切鉴定和PCR鉴定；B图为TRAP-pET28a酶切鉴定和PCR鉴定；C图为eAls-pET28a酶切鉴定。其中，每个图中的M为DNAMarkerDL8000；A图和B图中1为重组质粒的鉴定结果；2为重组质粒的酶切鉴定结果；C图中1为重组质粒的酶切鉴定结果；

图4为重组ATT、TRAP和eAls蛋白表达及纯化结果。图A为ATT；图B为TRAP；图C为eAls。其中，每个图中的1为未诱导的pET-28a；2为IPTG诱导后的pET-28a；3为未诱导的重组菌；4为IPTG诱导后的重组菌；5为蛋白纯化结果；M为蛋白质Marker；

图5为重组蛋白ATT、TRAP、eAls+TRAP和eAls免疫小鼠后攻毒结果(n＝10)。其中，图A为实验动物S.aureusNewman株攻毒后存活数；图B为实验动物S.aureusWood46株攻毒后存活数；

图6为ATT、TRAP、eAls+TRAP和eAls二免后小鼠血清中IgG亚类的分析结果。

图7为ATT、TRAP、eAls+TRAP和eAls二免后小鼠脾脏细胞中IFN-γ的分泌水平。

图8为ATT、TRAP、eAls+TRAP和eAls二免后小鼠脾脏细胞中IL-4、IL-10、IL-17A的分泌水平。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源：

1、金黄色葡萄球菌标准株Newman：金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性，冯昊、刘乐峰、迟佳琦、王宁、李闰婷、佟春玉、马金柱、朱战波、崔玉东，生物工程学报，2009,25(8)：1180-1186；另外，该生物专利还公开在专利“金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备及应用”中，专利号：201110231144.4，申请日2011.08.12，公开日2011.12.14和专利“金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用”中，专利号：201310480520.2，申请日2013.10.15，公开日2014.02.12中；

2、重组质粒pET32a-TRAP：金黄色葡萄球菌IsdB3与TRAP融合蛋白免疫保护作用研究，王宁，硕士论文，授予单位：黑龙江八一农垦大学，导师：崔玉东教授，公开日期：2009年；另外，该生物专利还公开在专利“金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备及应用”中，专利号：201110231144.4，申请日2011.08.12，公开日2011.12.14中；

3、所有引物为自行设计并委托上海生工生物工程技术服有限公司合成。

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明ATT融合蛋白及相应实验相关蛋白的制备。

1、引物的设计与合成

参照NCBI上已发表的黄色葡萄球菌trap基因序列，应用Oligo6.67及DNAStar软件设计2对PCR引物，扩增ATT蛋白的上下游引物为F1、R1；扩增TRAP蛋白的上下游引物为F2、R2。具体扩增片段长度、编号、引物位置及序列见表1以及图1。为了进一步定向克隆，在上游引物5′末端引入BamHI，在下游引物3’末端引入HindIIII，下划线代表限制性酶切位点，波浪线代表Linker(GSGSGSGS)。上述引物均由上海生工生物工程技术服有限公司合成。

表1PCR引物及Linker设计

2、TRAP-pET32a重组菌培养及质粒提取

取-70℃冻存的甘油保存菌DH5α-pET32a-TRAP重组菌，用接菌环沾取菌液在含有Amp+的LB固体培养基上划线，37℃过夜培养后，次日无菌操作挑取中等大小、边缘整齐的菌落，无菌接种于4mLLB/Amp+液体培养基中，180rpm/min37℃震荡培养12h。无菌操作吸取2ml菌液于2.0tube管中，12000rpm/min离心2min，弃净上清液，质粒提取实验试剂盒(GTPlasmidminipreppurificationkit)提取，按说明书进行。取2-5μl收集液于1％琼脂凝胶电泳中进行验证。

3、目的基因扩增

PCR反应体系及步骤按照以下方法进行：将PCR管置于冰上，依次按照说明书依次加入下列试剂后，进行PCR扩增。

ATT融合蛋白基因片段的扩增：

以pET32a-TRAP重组质粒为模板，分别以F1、R1为引物进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性5min后，94℃变性45s，58℃退火40s，72℃延伸40s，进行30个循环，最后72℃延伸8min，PCR产物4℃保存。

trap基因片段的扩增：

以pET32a-TRAP重组质粒为模板，分别以F2、R2为引物进行PCR扩增，反应条件如下：94℃预变性5min后，94℃变性45s，56℃退火40s，72℃延伸40s，进行30个循环，最后72℃延伸8min，PCR产物4℃保存。

各取3μLPCR扩增产物，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，电泳结果在558bp和498bp处分别出现电泳带，与预期扩增产物目的片段大小一致，如图2所示。

4、PCR产物回收与纯化

用AxyPrep凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)对目的片段进行纯化和回收，具体操作步骤按照说明书进行。取2μl回收样品，通过1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，出现目的条带后将回收后的产物于-20℃保存备用。

5、PCR产物与pMD18-T载体的连接转化

根据pMD18-TVectorkit说明书，依次在2支1.5ml离心管中加入各自切胶纯化的基因片段产物3μl，pMD18-TVector2μl，LigationSolutionI5μl。混匀后将离心管置于16℃干式恒温器中，连接时间设置为2h。然后，将连接产物全量加入到感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，然后42℃热休克90s，注意不要摇动，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min，立即加入事先预热到37℃无抗生素的800μLLB培养基，37℃空气摇床温和振荡培养1h，培养物瞬时离心，取200μL上清液，均匀涂布于含50μg/mLAmp⁺的LB平板上,待液体被吸收后倒置平板，37℃温箱中过夜培养。

6、重组质粒的鉴定

ATT-pMD18T和TRAP-pMD18T重组质粒按下列体系进行双酶切鉴定(重组质粒30μl，10×Buffer5μl，BamHI2.5μl，HindIII2.5μl，ddH2O总体系50μl)。混匀后37℃水浴3h。取重组质粒0.5μl作为模板，其余试剂、反应体系及反应条件分别参照1.5中各自目的PCR扩增体系。取5μl上样，于1％琼脂糖凝胶电泳验证。结果如图3所示，均在预期位置出现目的基因条带及载体片段条带，将鉴定正确的质粒作为模板，通过设计的引物进行PCR验证，1％琼脂凝胶电泳结果出现目的条带且与双酶切后目的基因大小一致。将鉴定正确的阳性菌株送北京金伟智公司进行基因测序，将测序结果用BLSAT方法与GenBank中已发表的标准序列进行比较，测序结果与NCBI上金黄色葡萄球菌TRAP序列及实验设计的序列进行比对，同源性达到100％。

7、eAls蛋白原核克隆载体构建

获取发表的Als3T细胞表位序列，设计一段序列将这个Als3T细胞表位序列重复6次，每两个Als3T细胞表位序列之间加一段柔性Linker(GSGSGSGS)且在第一个Als3T细胞表位序列的5’端及最后一个Als3T细胞表位序列的3’端各加上一段同样的Linker便于表达，该片段表达产物称为eAls。在这段序列的5’添加BamHI限制性内切酶位点，3’端添加HindIII限制性内切酶位点。将这段序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并连接到pUC57载体上。

8、重组蛋白原核表达载体构建

将pET-28a质粒用限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒进行回收。同时将重组克隆质粒pMD-18T-ATT、pMD-18T-TRAP及pUC57-eAls分别用限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒回收各目的基因片段。在3个灭菌的PCR反应管中，分别将各目的基因片段与载体pET-28a双酶切片段，在SolutionI作用下连接过夜，然后按前述方法进行转化，PCR及酶切检测，确定目的片段正确插入。将鉴定正确的质粒转入BL21(DE3)感受态细胞中，送上海生工生物工程公司测序。所获序列用Blast程序与GenBank中己发表的标准序列进行比较。将鉴定为阳性菌株的重组克隆命名为ATT-pET28a、TRAP-pET28a、eAls-pET28a。

9、重组蛋白的诱导表达

将含有ATT-pET28a、TRAP-pET28a、eAls-pET28a的重组质粒BL21(DE3)表达菌株接种于含Kan+的50mLLB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀值为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续剧烈振荡培养，在4h取2ml菌液，12000r/min离心1min，倒掉上清，在沉淀中加入40μlddH2O，10μl5×SDS-PAGEloadingbuffer，吹打混匀，煮沸5min，取10μl在10％的SDS-PAGE进行电泳分离。电泳后取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，在脱色摇床上染色1h，弃去染色液，用蒸馏水淋洗凝胶后，加入脱色液，在摇床上脱色1h，待蓝色背景消失、目的条带清晰时，用清水冲洗，照相保存。

10、重组蛋白的纯化

重组细菌培养物生长至A₆₀₀值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度1mM/L，继续振荡培养4-5h测定诱导菌的A₆₀₀值。然后，用Promega公司的MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒进行纯化，纯化后蛋白通过SDS-PAGE来进行纯度验证。结果如图4所示，通过与白质分子量Marker和诱导0h相比对，诱导后的目的蛋白大小分别为24KD(ATT)、22KD(TRAP)和18KD(eAls)，与纯化后的目的蛋白大小一致。

实施例2

本实施例说明ATT、Trap和eAls蛋白免疫效果对比。

1、动物免疫和攻毒试验

取健康、雌性、相同周龄的SPF级C57/B6小鼠100只，分为S.aureusNewman和S.aureusWood46攻毒组。小鼠ATT蛋白免疫接种后进行攻毒，同时用TRAP蛋白、eALS蛋白、eAls蛋白与TRAP蛋白混合(eAls+TRAP)和PBS作为对照，每组10只。纯化各实验组蛋白1mg/ml，以1：1的比例与弗式完全佐剂进行乳化，每只200μl小鼠腿部肌肉注射免疫；首次免疫后21d，将蛋白与不完全弗氏佐剂以1：1比例进行乳化，腿部肌肉注射加强免疫。

本实验取S.aureusNewman，Wood46标准菌株进行攻毒。取稀释好的菌液对二免后14d的小鼠腹腔攻毒，并每天记录小鼠状态以及死亡数目，持续两周，无菌状态下解剖死亡小鼠并分离病菌，分析是否为实验攻毒菌导致小鼠死亡。

本实验使用SPF级C57/B6小鼠为模型进行攻毒实验，具体分组见表2。

表2小鼠攻毒模型分组

在加强免疫后14d用金黄色葡萄球菌Newman，Wood46菌株以绝对致死量(金黄色葡萄球菌Newman株以8.0×10⁸CFU/mouse和金黄色葡萄球菌Wood46菌株以6.0×10⁸CFU/mouse的剂量)进行小鼠腹腔攻毒，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数据，见表3。攻毒Newman株和Wood46株ATT的免疫保护率均为80％。

表3腔组小鼠模型攻毒结果

2、抗体水平

用间接ELISA检测分离的血清样本中IgG亚类。大量纯化实验组蛋白ATT，TRAP，eAls备用。

包被抗原均以10μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃两小时，然后用PBST洗涤。每孔加100μL5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μLTMB显色液，室温显色10min后每孔加入50μL2M的硫酸终止反应，测OD450nm吸光值。分析结果。当样品OD450值≥(阴性血清的OD450值+3倍标准方差)时即为阳性。

将各实验组抗原以1μg/well包被好酶联板后，将二免14d血清按1：100比例稀释作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3以1：5000稀释后作为二抗，采用间接ELISA方法检测抗体水平，酶标仪OD₄₅₀下读取数值，结果表明重组蛋白ATT抗体效价最高，高于Trap及eAls实验组(图6)。

3、细胞因子检测

用Elispot方法检测INF-γ含量。用ELISA方法检测IL-4、IL-10、IL-17含量。按细胞因子检测试剂盒的操作步骤进行。

应用ELISPOT方法测定各实验免疫组和对照组小鼠的淋巴细胞IFN-γ分泌水平(图7)。重组蛋白ATT实验组中INF-γ含量高于TRAP实验组和混合组，差异显著(P＜0.05)，同其他各组比较差异极显著(p<0.01)。

应用ELISA方法测定各实验重组蛋白免疫组和对照免疫组小鼠脾脏细胞上清液中IL-4、IL-10、IL-17分泌水平(图8)。所得结果经t-检验后，ATT免疫组小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-4、IL-10分泌量高于TRAP实验组(P＜0.01)；IL-17A分泌量中，除混合组略高于ATT组，ATT组与TRAP实验组比较差异显著(p<0.05)，同其他各组比较差异极显著(P＜0.01)。

以上结果表明，本发明ATT融合蛋白疫苗的免疫效果优于各蛋白单独或混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及免疫保护作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。