血清microRNA在肝癌诊断中的应用及诊断试剂盒

摘要

本发明公开了由血清microRNA组成的肝细胞肝癌诊断标志物组合，以及含有这些标志物组合的试剂盒。所述肝癌诊断标志物组合共包括如下microRNA：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c以及hsa-miR-192。本发明可用于肝癌诊断。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学诊断领域，具体涉及由血清microRNA组成的肝癌诊断组合，所述的血清microRNA包括hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c、hsa-miR-192，以及用于肝癌诊断的试剂盒及其应用。

背景技术

原发性肝癌是世界范围内常见的高发病率、高致死率的恶性肿瘤，其中肝细胞肝癌(简称肝癌,HepatocellularCarcinoma,HCC)占原发性肝癌的90％以上。世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》指出，2012年全球肝癌新发病例位列恶性肿瘤的第五位，其致死率则位居第二位，其中中国肝癌的新发及死亡病例均约占全球病例的一半。由于缺乏有效的筛查手段，导致60％-70％的肝癌患者诊断时已处于晚期，错失根治性切除机会。可见，早期诊断，早期治疗是增加肝癌患者生存率，降低肝癌死亡率最有效的途径。

肝癌的发生发展过程是一个多因素、多阶段、多步骤的过程。任何原因引起的肝硬化是肝癌最常见的危险因素。在亚洲，慢性乙型肝炎病毒(HBV)引发的肝炎、肝硬化是诱发肝癌最主要的风险因素。绝大多数肝癌患者伴有肝炎和肝硬化病理改变，在历经肝炎、肝硬化阶段后，最终发展为肝癌，人们称之为“肝癌三部曲”。据估计，中国乙型肝炎携带者数量近1.2亿，其中20％将发展成为慢性乙型肝炎患者，15％-40％的慢性乙型肝炎患者则将进一步发展为肝硬化。因此，对肝癌高危人群进行长期监测，及早发现并预警早期肝癌，便于确定针对性的个体化防治方案，延缓甚至防止肝癌的发生，有利于改善患者生存质量。

目前临床上主要通过血清甲胎蛋白(AFP)检测或影像学检查筛查肝癌。虽然AFP已广泛用于肝癌筛查，但其检出肝癌的敏感性不够高：在临床诊断出肝癌的患者中，约35-60％肝癌患者的AFP水平仍低于警戒值(20ng/ml)；在亚临床肝癌中的敏感性则仅为14-40％。尽管超声、CT、MRI等影像学检查方法可以作为AFP检测的补充，然而由于长期随访筛查则费用昂贵，而且这些方法的检出率有赖于肿瘤大小及操作者的经验，因而可能出现误诊、漏诊的情况。因此，发现新的高敏感性、高特异性，且低廉又易于检测的肝癌早期诊断标志物具有重要的临床意义。

MicroRNA是一类广泛存在于真核生物中的内源性小分子非编码RNA，长度为18-24个核苷酸(nt)。MicroRNA通过转录后水平抑制靶基因的表达，调控细胞分化、增殖、凋亡等生命活动，在胚胎发育、机体代谢、疾病发生发展等多种生理和病理过程中发挥重要作用。近年来，研究人员在血液、唾液、尿液等多种体液中检测到microRNA，提出循环microRNA的概念。血液等体液标本易于获得，临床可操性强且创伤性小，而且循环microRNA稳定性好，检测便利，因此，循环microRNA具有作为肿瘤等疾病无创性生物标志物的潜能，适用于高危人群筛查。

新近研究指出，肝癌患者与非肝癌对照具有不同的循环microRNA表达谱。例如，miR-21、miR-122、miR-223在肝癌患者以及HBV肝炎患者血清中的水平均高于健康人；而在肝癌患者血浆中升高的miR-21在患者切除术后下调；Li等人通过检测513例个体血清microRNA表达谱，确定了区分HBV肝炎患者与健康人以及肝癌患者与健康人的分类组合；Zhou等人检测了近千份血浆标本microRNA的水平，发现由miR-122，miR-192，miR-21，miR-223，miR-26a，miR-27a以及miR-801等七个循环microRNA构成的分类模块，能区分肝癌与所有非肝癌群体总和(包括健康人，肝炎、肝硬化患者)，并可诊断AFP阴性的肝癌。这些研究提示循环microRNA作为肝癌诊断标志物的潜能。

然而目前关于循环microRNA作为肝癌诊断标志物的研究仍存在以下不足：(1)大部分研究只是挑选了前人报道的在肝癌组织表达失调的microRNA作为候选指标，可能无法全面客观反映循环microRNA的情况；(2)部分研究样本量少，缺乏多中心验证；(3)对照设置不完善，难以说明确定的标志物为肝癌特异的诊断标志物。因此，目前仍然有必要发现具有临床应用价值的肝癌早期诊断标志物，用于肝癌高危人群的监测，从而及早预警早期小肝癌，便于临床医生及时采取恰当的防治措施。

在中山大学的专利申请201410623463.3中，公开了由hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-133a、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-192以及hsa-miR-505共七个microRNA组成的肝癌诊断标志物，其具有早期诊断灵敏性高、特异性好等特点。尽管如此，本领域仍存在提供其他肝癌分析诊断标记物组合的需求。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简便、能够有效诊断肝癌的肝癌诊断标志物。

为实现上述技术目的，本发明提供了一种肝癌诊断标志物，所述肝癌诊断标志物包括分别编码以下microRNA分子组合的核酸分子：

1)组合一：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145；

2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505；

3)组合三：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR-192；

4)组合四：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-505。

在一个优选的实施方案中，所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高于健康人、乙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。

另一方面，本发明还提供了用于肝癌诊断的microRNA分子组合，其包括以下microRNA组合：

1)组合一：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145；

2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505；

3)组合三：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR-192；

4)组合四：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-505。

在一个优选的实施方案中，所述microRNA在肝癌患者血清中的水平高于健康人、乙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者。优选地，所述肝癌为原发性肝细胞肝癌。

具体而言，本发明通过以下步骤得到了上述四种由血清microRNA组成的肝癌诊断组合：

1.通过高通量qPCRArray筛选肝癌患者与慢性乙型肝炎患者差异的候选血清microRNA；

2.实时荧光定量PCR验证候选血清microRNA；

3.在由健康人、肝炎、肝硬化、肝癌患者组成的训练组中确立可区分肝癌与非癌对照(包括健康人、肝炎及肝硬化患者)的血清microRNA组合；

4.在两个独立验证组验证步骤3确立的血清microRNA组合诊断肝癌的效果；

5.分析步骤3确立的血清microRNA组合在小肝癌、BCLC早期及AFP阴性的肝癌患者中的诊断效果。

对实验结果进行分析及相关统计显示：上述步骤1中，发明人通过高通量qPCRArray筛选确定了19个候选microRNA，并在步骤2中验证了19个候选microRNA在肝癌患者血清中的水平均升高。进一步检测了候选microRNA在训练组(样本量为257份)中的水平，并确立了区分肝癌与非癌对照的最优血清microRNA组合。进而在独立的验证组1及验证组2(样本量分别为352、139份)中验证了该血清microRNA组合可以区分肝癌与非癌对照。与此同时，发明人发现相较传统的肝癌筛查手段，如AFP，血清microRNA组合在小肝癌、BCLC早期及AFP阴性的肝癌患者中具有更好的诊断效果。

在另一个方面，本发明还公开了一种用于肝癌诊断的诊断试剂盒，包含分别用于检测以下microRNA分子在血清中水平的试剂：

1)组合一：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145；

2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505；

3)组合三：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR-192；

4)组合四：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-505。

在一个实施方案中，所述用于检测microRNA分子在血清中水平的试剂为实时荧光定量PCR相关试剂。

在再一个优选的实施方案中，所述诊断试剂盒还包括血清RNA提取系统和反转录系统。在优选的实施方案中，该试剂盒还包括用于评估是否罹患肝癌的分析方法。

在一个优选的实施方案中，所述诊断试剂盒包括可用于检测以下microRNA水平的LNA修饰引物：

1)组合一：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145；

2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505；

3)组合三：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR-192；

4)组合四：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-505。

优选地，所述用于检测microRNA分子组合在血清中水平的试剂为实时荧光定量PCR相关试剂。

更优选的，所述诊断试剂盒还包括检测外源参照NC67的LNA修饰引物。通过外源参照NC67校准，得到上述目标基因在待检血清标本中的水平2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_taget-Ct_reference)。根据microRNA阈值将检测标本microRNA水平分别赋值为1或0，实现离散化。

进一步，分别根据逻辑回归方法分析血清microRNA组合评估待测者是否罹患肝癌：

1)组合一：Logit(p＝HCC)＝-0.333-0.578*hsa-miR-193a-5p-0.531*hsa-miR-143-0.692*hsa-miR-145；

2)组合二：Logit(p＝HCC)＝-0.343-0.407*hsa-miR-193a-5p-0.595*hsa-miR-29a-0.706*hsa-miR-133a-0.480*hsa-miR-505；

3)组合三：Logit(p＝HCC)＝-0.326-0.419*hsa-miR-193a-5p-0.347*hsa-miR-29a-0.354*hsa-miR-29c-0.654*hsa-miR-145-0.423*hsa-miR-192；

4)组合四：Logit(p＝HCC)＝-0.355-0.171*hsa-miR-193a-5p-0.338*hsa-miR-29a-0.531*hsa-miR-133a-0.511*hsa-miR-145-0.462*hsa-miR-192-0.393*hsa-miR-505。

其中，hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c、hsa-miR-192为相应血清microRNA检测水平离散化后的数值，并以Logit(p＝HCC)＝0.5为诊断阈值，高于0.5则诊断为肝癌，低于0.5则诊断为非肝癌。所述诊断试剂盒可应用于肝癌诊断。

本发明的血清microRNA组合用于肝癌检测及早期诊断的优越性在于：(1)标本更易于获得，临床可操性更强且创伤性更小，而且血清microRNA稳定性更好，检测更便利；(2)实验方法非常成熟，检测过程更简便、易于重复，由普通的技术员均可以完成；(3)本发明采用高通量筛选、多中心验证以及在高危人群标本中进行研究，对血清microRNA组合的效果以及诊断试剂盒进行了全面评估，以上方法和策略的应用保证了本发明在肝癌临床诊断中的潜在应用价值，并为其他疾病生物标志物的研制提供可借鉴的方法策略；(4)血清microRNA诊断肝癌试剂盒能够更加及时反映肝癌患者的疾病状态，避免繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案。

附图说明

图1为本发明实施例4、5在训练组、验证组中的ROC曲线图。具体地，训练组(A)、验证组1(B)以及验证组2(C)中血清microRNA组合及AFP区分肝癌与非癌对照(上图)及高危人群(下图)的ROC曲线图。

图2为本发明实施例6在小肝癌患者(肿瘤≤3cm)中的ROC曲线图。具体地，训练组(A)、验证组1(B)、验证组2(C)以及训练组与所有验证组(D)中血清microRNA组合及AFP区分小肝癌患者与非癌对照(左图)及高危人群(右图)的ROC曲线图。

图3为本发明实施例7在不同BCLC分期肝癌患者中的ROC曲线图。具体地，血清microRNA组合及AFP区分BCLC0+A期(A)、BCLCB期(B)或BCLCC期(C)肝癌患者与非癌对照(上图)及高危人群(下图)的ROC曲线图。

图4为本发明实施例8在AFP阴性肝癌患者(AFP≤20ng/ml)中的ROC曲线图。具体地，训练组(A)、验证组1(B)、验证组2(C)以及训练组与所有验证组(D)中血清microRNA组合区分AFP阴性肝癌患者与非癌对照(左图)及高危人群(右图)的ROC曲线图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围；所描述的附图也仅是示意性的，被认为是非限制性的。

实施例1：血清标本的采集及制备

发明人于2009年8月至2014年8月采集了健康人(HC)、乙型肝炎携带者(IHC)、慢性乙型肝炎患者(CHB)、肝硬化患者(LC)及肝癌患者(HCC)的血液标本，这些人群满足入组标准(表1)，并根据性别、年龄匹配的原则，设定肝癌及其对照组标本。

训练组：2009年8月至2012年3月采集的健康人(51例)、慢性乙型肝炎患者(51例)、肝硬化患者(47例)以及肝癌患者(108例)的257份血清标本。

验证组1：2012年4月至2013年4月采集的健康人(60例)、慢性乙型肝炎患者(68例)、肝硬化患者(71例)以及肝癌患者(153例)的352份血清标本。

验证组2：2013年5月至2013年8月采集的健康人(48例)、乙型肝炎携带者(42例)以及肝癌患者(49例)的139份血清标本。

上述参与人群的临床特征见表2。

表1.参与人群的入组标准

入组条件参考美国肝病研究协会(AASLD)2009年实践指南。

参考肝活检Metavir系统。

抽取肝癌患者术前、健康人、乙型肝炎携带者、慢性乙型肝炎患者以及肝硬化患者外周静脉血各4ml，于干燥采血管中4℃静置半个小时以上。随后400g，4℃离心10min取上清，进一步1800g，4℃离心10min取上清，得到血清，分装后于-80℃保存备用。

表2.训练组及验证组参与者的临床病理特征

实施例2：qPCRArray及其数据分析

选取6个肝癌患者术前以及8个慢性乙型肝炎患者距末次检查至少一年以上的血清标本用于qPCRArray筛选。这些患者均为男性，且其年龄均值、分布均无显著差异(表3)。

表3.用于qPCRArray分析的标本临床病理特征

本发明采用AppliedBiosystems公司的ArrayHumanMicroRNA方法筛选肝癌与慢性乙型肝炎差异的microRNA，共检测754个已知的人类microRNA的水平。具体步骤参见AppliedBiosystems网站。得到的原始数据经校准后，采用SignificantAnalysisofMicroarray(SAM)分析方法挑选差异microRNA，最终筛选得到19个用于后续验证的候选microRNA(表4)。

表4.本发明采用的候选microRNA及外源参照信息

Exiqon公司产品编号

实施例3：实时荧光定量PCR检测训练组标本microRNA水平

1.1血清RNA提取

本发明采用Trizol试剂提取，并经过酚/氯仿抽提纯化、异丙醇沉淀、糖原助沉的方法获得血清RNA，具体步骤如下：

1.取200μl血清，优选地加入等体积的混有cel-miR-67(NC67，基于与人类基因组序列没有同源性的线虫miR-67成熟体序列所设计的双链RNA，终浓度为0.2nM，序列见表4)的Trizol裂解液，充分振荡混匀，冰浴15min。

2.加入100μl预冷氯仿，振荡混匀，4℃，12000g离心15min。

3.转移上清，加入等体积预冷酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，4℃，14000g离心10min。并重复该步骤一次。

4.转移上清，加入等体积预冷氯仿，振荡混匀，4℃，14000g离心15min。

5.转移上清，优选地加入等体积异丙醇以及糖原(终浓度为200μg/ml)，振荡混匀，4℃，16000g离心30min。

6.小心倾倒上清，用1ml70％乙醇洗涤沉淀一次，4℃，16000g离心10min。

7.弃上清，待乙醇挥发后，加入10μlDEPC水溶解，置于-80℃中保存备用。

1.2实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

本发明优选地采用UniversalcDNASynthesis逆转录试剂盒，对等体积的血清RNA进行逆转录。进一步优选地采用SYBRGreenqPCRmastermix试剂盒，以稀释20倍的cDNA为模板，LNA修饰的引物进行RT-qPCR检测。所述逆转录试剂盒、qPCR检测试剂盒以及LNA修饰引物均购自Exiqon公司(丹麦)。

通过外源参照NC67校准，得到目标microRNA的表达值2^-ΔCt(ΔCt＝Ct_taget-Ct_reference)。结果显示，19个候选microRNA在肝癌患者血清中的水平均显著升高。

实施例4：训练组中确定最优血清microRNA组合

将训练组标本按照19个microRNA各自检测水平从大到小排列，并依次取值(如有重复值则只取一次)，根据取值将标本判定为阳性或阴性类群，结合标本的既定类别分析获得每次取值的敏感性和特异性，进一步绘制ROC曲线(ReceiverOperatingCharacteristicCurve)。寻找使(敏感性+特异性)/2值达到最大的点，该点对应的表达数值即为microRNA离散化的阈值。进一步将高或低于阈值的标本分别赋值为1或0，实现离散化，用于进一步的模型构建。本发明采用的microRNA离散化阈值(表4)将用于训练组、验证组中相应microRNA数据的离散化，从而将连续变量转变为二分类变量。

建模结果显示，以下组合对诊断肝癌具有良好效果：

1)组合一：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145；

2)组合二：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505；

3)组合三：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-29c、hsa-miR-145、hsa-miR-192；

4)组合四：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-145、hsa-miR-192、hsa-miR-505。

其评估是否罹患肝癌的公式分别为：

(1)组合一：Logit(p＝HCC)＝-0.333-0.578*hsa-miR-193a-5p-0.531*hsa-miR-143-0.692*hsa-miR-145；

(2)组合二：Logit(p＝HCC)＝-0.343-0.407*hsa-miR-193a-5p-0.595*hsa-miR-29a-0.706*hsa-miR-133a-0.480*hsa-miR-505；

(3)组合三：Logit(p＝HCC)＝-0.326-0.419*hsa-miR-193a-5p-0.347*hsa-miR-29a-0.354*hsa-miR-29c-0.654*hsa-miR-145-0.423*hsa-miR-192；

(4)组合四：Logit(p＝HCC)＝-0.355-0.171*hsa-miR-193a-5p-0.338*hsa-miR-29a-0.531*hsa-miR-133a-0.511*hsa-miR-145-0.462*hsa-miR-192-0.393*hsa-miR-505。

其中，hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c、hsa-miR-192为相应血清microRNA检测水平离散化后的数值。

上述组合在训练组中可以区分肝癌与非癌对照或高危人群，具有很好的肝癌诊断效果，表现在血清microRNA组合的AUC均大于AFP20或AFP400(以20或400ng/ml作为AFP阈值)的AUC(图1A)。

实施例5：验证组中验证血清microRNA组合诊断肝癌的效果

在训练组中确立的血清microRNA组合被用于验证组诊断肝癌。同样地，采用Trizol提取以及实时荧光定量PCR检测方法进行实验。所述组合在验证组1、2中仍可区分肝癌与非癌对照或高危人群，具有很好的肝癌诊断效果，表现在血清microRNA组合的AUC均大于AFP20或AFP400的AUC(图1中B、C)。

实施例6：血清microRNA组合在小肝癌患者(肿瘤≤3cm)中的诊断效果

本发明进一步证明了血清microRNA组合具有很好的诊断小肝癌的效果。在训练组、验证组1、验证组2中，这些组合诊断小肝癌的AUC均显著大于AFP；训练组与三个验证组病例合并分析结果同样显示这些组合区分小肝癌与非癌对照或高危人群的AUC远大于AFP20或AFP400(图2)，分别为：

组合一：0.815vs0.729或0.616，0.813vs0.711或0.615；

组合二：0.833vs0.729或0.616，0.824vs0.711或0.615；

组合三：0.839vs0.729或0.616，0.819vs0.711或0.615；

组合四：0.839vs0.729或0.616，0.835vs0.711或0.615。

实施例7：血清microRNA组合在不同BCLC分期肝癌患者中的诊断效果

血清microRNA组合在不同BCLC分期肝癌患者中均有较佳的诊断效果，这些组合的AUC显著大于AFP的AUC，尤其是在BCLC0+A期，即BCLC早期，组合的优势更加明显：以所有非癌对照/高危人群为对照，在BCLC0+A期肝癌诊断中，上述组合的AUC分别为：组合一：0.805/0.802；组合二：0.821/0.811；组合三：0.805/0.785；组合四：0.823/0.819；而AFP20或AFP400则分别为0.735/0.709或0.649/0647(图3)。

实施例8：血清microRNA组合在AFP阴性(AFP≤20ng/ml)肝癌患者中的诊断效果

血清microRNA组合在AFP阴性肝癌患者中同样具有很好的诊断效果。以所有非癌对照/高危人群为对照，上述组合在训练组、验证组1、验证组2各组以及所有中心组合的预测AFP阴性肝癌的AUC(图4)分别为：

组合一：0.819/0.824、0.803/0.816、0.883/0.831以及0.819/0.818；

组合二：0.762/0.763、0.782/0.784、0.789/0.731以及0.780/0.769；

组合三：0.830/0.818、0.799/0.787、0.858/0.782以及0.819/0.795；

组合四：0.844/0.847、0.797/0.801、0.892/0.865以及0.827/0.824。

实施例9：血清microRNA试剂盒的制作

本发明试剂盒用于肝癌诊断，尤其是早期肝癌，由血清RNA提取系统、反转录系统、实时荧光定量PCR系统、引物系统以及用于评估是否罹患肝癌的逻辑回归分析方法组成。

所述试剂盒的血清RNA提取系统中，发明人采用Trizol试剂提取，并经过酚/氯仿抽提纯化、异丙醇沉淀、糖原助沉的方法获得血清RNA。发明人采用一系列Exiqon公司LNA修饰的引物作为所述试剂盒的引物系统，用于检测以下分子：hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c、hsa-miR-192以及NC67(外源参照)。

实时荧光定量PCR系统中，发明人采用Exiqon公司的逆转录试剂盒以及SYBRGreenqPCRmastermix试剂盒进行检测。进一步分别根据逻辑回归方法分析血清microRNA组合评估待测者是否罹患肝癌：

组合一：Logit(p＝HCC)＝-0.333-0.578*hsa-miR-193a-5p-0.531*hsa-miR-143-0.692*hsa-miR-145；

组合二：Logit(p＝HCC)＝-0.343-0.407*hsa-miR-193a-5p-0.595*hsa-miR-29a-0.706*hsa-miR-133a-0.480*hsa-miR-505；

组合三：Logit(p＝HCC)＝-0.326-0.419*hsa-miR-193a-5p-0.347*hsa-miR-29a-0.354*hsa-miR-29c-0.654*hsa-miR-145-0.423*hsa-miR-192；

组合四：Logit(p＝HCC)＝-0.355-0.171*hsa-miR-193a-5p-0.338*hsa-miR-29a-0.531*hsa-miR-133a-0.511*hsa-miR-145-0.462*hsa-miR-192-0.393*hsa-miR-505。

其中，hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-145、hsa-miR-29a、hsa-miR-133a、hsa-miR-505、hsa-miR-29c、hsa-miR-192为相应血清microRNA检测水平离散化后的数值。以Logit(p＝HCC)＝0.5为诊断阈值，高于0.5则为肝癌患者，低于0.5则为非肝癌患者。