鸡匍匐性状基因及与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记

摘要

本发明涉及鸡匍匐性状基因及与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记。所述分子标记位于鸡7号染色体上，用于扩增该DNA分子标记的引物如SEQ？ID？NO:1-2所示。本发明还首次鉴定了鸡匍匐性状的关键基因和原因突变，即由IHH基因的半合子缺失引起，该缺失位点位于chr7:21798705-21810600(Ensembl，Galgal？4版本)，该缺失区域包含唯一的目的基因IHH，该基因的全部缺失，导致胚胎的早期致死。本发明克隆获得了鸡匍匐性状基因，该基因及其检测引物对鸡匍匐性状形成机理的深入研究以及地方鸡种中筛查匍匐性状基因以及匍匐型鸡品种资源保护、研究和改良工作具有重要的意义，还能够促进人类和其他脊椎动物的肢体发育机理的深入研究。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及鸡遗传育种领域，具体地说，涉及鸡匍匐性状基因及与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记。

背景技术

矮小型是脊椎动物的一种常见的异常肢表型，不同的物种具有相似的表型。矮小表型由相应的基因控制，包括性染色体矮小基因和常染色体矮小基因。匍匐性状是鸡品种中存在的一种特有的矮小表型，该表型主要特征为胫短身矮、翅膀短小。了解匍匐性状形成的分子机理，对匍匐鸡的保种和改良工作具有重要的意义，也为人类和其他物种的肢体发育提供参考和借鉴。

Landauer和Dunn(1930)提出匍匐性状是由常染色体上的显性纯合致死基因(Cp)控制的质量性状，杂合子个体表现匍匐性状，显性纯合子表现为致死型，胚胎死亡集中在孵化的第4天，孵化早期死亡率为25％，后代中杂合子的成活率基本不受影响，但由于软骨营养不良，引起发育迟缓，导致胫骨变短，表现为匍匐性状。国际上对匍匐性状的研究已有近90年的研究历史，研究学者从形态学、解剖学、细胞学和分子水平对匍匐性状鸡胚胎进行了相关的研究。早期的研究尝试用物理指标来判断胚胎的分离表型，该研究通过早期胚胎24-25h、48-54h的体节计数的方法或者形态学的方法来确认体节数目以区分纯合致死胚胎、杂合胚胎和正常胚胎。前人研究也表明Cp胚胎软骨发育不正常、引起发育阻滞。另外，Loewenthal(1957)通过对Cp胚胎和正常胚胎的组织学及组化分析，把胚胎利用海利氏固定液(Helly’sfluid)进行固定，然后进行不同染色来观察Cp胚胎与正常型胚胎的差异，结果表明Cp纯合胚胎与正常型胚胎的Feulgen染色以及胞质嗜碱性均显著不同。Wallace等(1969)通过核酸测定研究表明Cp胚胎与正常型胚胎也存在有显著差异。此外，研究者对Cp胚胎的细胞培养以及软骨发育也进行了相关研究。但这些区分胚胎表型的方法操作复杂、费用高、耗时长、需要有专门的仪器，在生产中很难大规模推广应用。因此，开发一种利用分子标记进行匍匐性状准确的的检测方法具有重要的意义。

匍匐性状是一些地方鸡种特有的表型，是鸡中特有的肢体异常表型。匍匐性状个体由于骨骼发育异常，引起发育迟缓、胫骨变短，翅膀变小、身体矮小。匍匐性状由常染色体上显性纯合致死基因Cp控制，因此Cp基因身份最有可能与控制机体骨骼发育的基因及其信号通路基因相关。兴义矮脚鸡是原产于我国贵州省的地方品种，具有胫短身矮、体躯匀称、肉美味鲜，肉蛋兼用等特点，是一种稀有珍贵的家禽遗传资源。由于该品种具有特殊的匍匐性状而受到广泛的关注，但是存在孵化率低、胫长不一致、个体体重差异较大、脚趾畸形等发育问题，米易等一些地方鸡种也由于携带该基因严重影响这些地方品种的孵化率和生长发育的整齐度。因此，只有克隆得到Cp基因，才能从根本上解决育种中存在的这些问题，才能更深入研究匍匐性状形成的分子机理和地方鸡种中筛查该基因。另外，鸡作为一个动物模型，Cp基因的研究也将会为人类和其他脊椎动物肢体发育研究提供参考，也将促进人类软骨发育相关疾病的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记及其应用。

本发明的另一目的是提供一种鉴定或辅助鉴定匍匐性状鸡的方法。

本发明的又一目的是提供鸡匍匐性状基因。

为了实现本发明目的，本发明提供的与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记，其位于鸡7号染色体上，用于扩增所述DNA分子标记的引物如SEQIDNO:1-2所示。

所述DNA分子标记由鸡7号染色体上长片段缺失序列(chr7:21798705-21810600)的上、下游序列组成，其为：

i)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；或

ii)SEQIDNO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQIDNO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供所述DNA分子标记在鸡分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定匍匐性状鸡的方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以待测样品的基因组DNA为模板，利用SEQIDNO:1-2所示引物进行PCR扩增；

3)检测PCR扩增产物；若扩增产物中含有所述DNA分子标记，则判定该个体为匍匐性状鸡；若扩增产物中不含所述DNA分子标记，则判定该个体不为匍匐性状鸡。

步骤2)中PCR反应体系包括：基因组DNA80-100ng,含Mg²⁺的10×PCR缓冲液3.0μl，2.5mMdNTPs4.0μl，2.5U/μlTaqDNA聚合酶1.5μl，10μmol/l上、下游引物各0.2μl，ddH₂O补足至总体积25.0μl。

PCR扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共33个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

步骤1)和2)中所述待测样品来源于鸡血液或离体的组织器官；步骤3)中检测PCR扩增产物采用的方法包括琼脂糖凝胶电泳、测序或分子杂交等方法。

优选采用酚仿法提取待测鸡个体的翅静脉血DNA。

本发明还提供用于鉴定匍匐性状鸡的PCR检测试剂盒，所述试剂盒中包含SEQIDNO:1-2所示引物。

本发明还提供鸡匍匐性状基因，所述基因位于鸡7号染色体上长片段缺失序列(chr7:21798705-21810600)的中间，该缺失序列包含Cp基因，其身份为IHH基因，即由IHH基因的半合子缺失引起鸡匍匐性状。该基因具体位于鸡基因组chr7:21803719-21807290(Ensembl数据库，Galgal4版本)，其为：

i)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列；或

ii)SEQIDNO:6所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQIDNO:6所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明还提供用于扩增所述鸡匍匐性状基因的特异性PCR引物，所述引物如SEQIDNO:4-5所示。

本发明进一步提供含有SEQIDNO:4-5所示引物的PCR检测试剂或试剂盒。

适用于所述检测试剂或试剂盒的PCR反应体系包括：基因组DNA50-500ng，含Mg²⁺的LAPCR缓冲液3.0μl，2.5mMdNTPs4.0μl，10mmol/L上、下游引物各0.5μl，LATaqDNA聚合酶1.5U，ddH₂O补足至总体积25.0μl。

PCR扩增程序：98℃变性10sec，60℃退火30sec，72℃延伸3min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

本发明首次利用生物信息学分析鉴定了鸡匍匐性状的关键基因和原因突变，即由IHH基因的半合子缺失引起，该缺失位点位于chr7:21798705-21810600，该缺失区域包含唯一的目的基因IHH，该基因的全部缺失，导致胚胎的早期致死。另外，本发明巧妙地利用PCR方法检测匍匐性状鸡，弥补了常规筛选方法的不足，缩短了筛选周期。本发明还克隆获得了鸡匍匐性状基因，该基因及其检测引物对鸡匍匐性状形成机理的深入研究以及地方鸡种中筛查匍匐性状基因以及匍匐型鸡品种资源保护、研究和改良工作具有重要的意义，还能够促进人类和其他脊椎动物的肢体发育机理的深入研究。

附图说明

图1为本发明实施例1中采用酚仿法提取鸡基因组的DNA电泳检测结果；其中，M为DNAMarker，编号1-8为待测个体。

图2为本发明实施例1中长片段PCR方法扩增鸡匍匐性状基因的电泳图；其中，M为1kbDNAMarker，泳道1和5为匍匐型个体扩增出匍匐基因条带(3350bp)；泳道2为早死胚胎未扩增出匍匐基因条带；泳道3和4为正常个体扩增匍匐基因条带。

图3为本发明实施例2中匍匐性状鸡个体的PCR产物电泳检测结果；其中，M为600bpDNAMarker，编号1-8为匍匐性状个体的目的片段(234bp)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例1鸡匍匐性状基因Cp的克隆

拟采用具有完整系谱记录的兴义矮脚鸡为实验对象，组建Cp基因型分离家系(匍匐型公鸡与匍匐型母鸡杂交)，采集死亡胚胎、匍匐型和正常全同胞或半同胞个体，提取基因组DNA并进行DNA质量控制，每个个体单独构建文库，通过IlluminaHiseq2000高通量测序平台进行全基因组重测序，对重测序数据进行质量控制和比对，在基因组范围内对每个个体进行各种变异分析，包括SNP、InDel(插入缺失)、CNVs(拷贝数变异)、基因重组等。主要使用的生物信息学软件包括bowtie2(序列比对)、SAMTools(BAM文件处理)、GATK、SNPTools(SNP，小InDel分析)、Pindel、PEMer(大InDel，重组)、CNVnator以及CNV-TV(CNV分析)。经过深度生物信息学分析和挖掘，进行Cp基因组定位，获取Cp基因结构。

鸡匍匐性状基因的克隆方法如下：

1.1实验材料

匍匐性状鸡(兴义矮脚鸡)饲养和样品采集在中国农业大学家禽遗传资源与育种试验基地完成。血液采用ACD抗凝，血液与ACD抗凝剂的比例为1:3。

1.2基因组DNA提取与检测

采用酚仿法提取血液基因组DNA，步骤如下：

(1)在1.5mlEP管中分别加入30-40μl的新鲜ACD抗凝血样。

(2)在每个EP管中加入700μl细胞裂解液，充分混匀10min。

(3)加入30μl蛋白酶K(终浓度为20mg/ml)，振荡10min。

(4)55℃，220转/min，水浴振荡过夜消化。

(5)将消化后的血液加入600μlTris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μl上清液至干净的离心管中。重复步骤(5)，提取效果更好。

(6)加入600μl的酚仿(Tris饱和酚：氯仿＝1:1)，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径的枪头小心吸取600μl上清液至干净的离心管中。

(7)加入600μl的氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇＝24:1)，缓慢颠倒离心管10min，然后12000rpm，离心10min，用大口径枪头小心吸取300μl上清液至干净的离心管中。

(8)加入1000μl的无水乙醇，轻摇离心管，待有白色絮状沉淀出现停止摇动。

(9)用枪头小心将DNA沉淀挑出，置于盛有300μl70％乙醇的离心管中洗涤，8000rpm，离心3-5min，弃上清；或者8000rpm，离心3-5min，倒掉上清，再加入300μl70％乙醇洗涤8000rpm，离心3-5min，弃上清。

(10)将乙醇倒干净，室温使乙醇挥发，晾干2-3h。

(11)加入100μlddH₂O溶解DNA(或适量TE缓冲液)，溶解好的DNA，4℃过夜保存。然后置于-20℃长期保存。

1.3DNA质量和浓度检测

用NanoDrop2000测量DNA浓度及OD值。用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA，结果如图1所示，提取的基因组DNA质量较好，主带单一、清晰。

1.4引物设计

采用PrimerPremier6.0软件设计引物，在引物设计过程中，尽量避免发夹结构、引物二聚体和错配等情况的出现，使引物序列最优化。扩增所用的引物序列如下：

F1:5′-TCCGTCAAGTCAGGTAAGG-3′(SEQIDNO:4)

R1:5′-CACCCACGCAACCAAGT-3′(SEQIDNO:5)

1.5实验方法

以上述方法提取的基因组DNA为模板，以F1、R1为引物，采用长片段PCR扩增方法扩增目的序列，长片段扩增酶购自TaKaRa公司(CodeNo:RR900A)。

PCR反应体系：鸡基因组DNA50-500ng，LAPCRbufferⅡ缓冲液(含Mg²⁺)为3.0μl，2.5mM的dNTPs混合液4.0μl，10mmol/L引物F1、R1各0.5μl，LATaqDNA聚合酶1.5U，ddH₂O补足至总体积25.0μl。

PCR反应条件：98℃变性10sec，60℃退火30sec，72℃延伸3min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用。

电泳检测、纯化回收与测序验证：配制浓度1.5％的琼脂糖凝胶，采用100V、40min的条件进行电泳检测。长片段PCR扩增产物如图2所示，待测个体可以扩增出单一的条带。将获得PCR产物进行切胶回收，纯化后的产物送至公司测序验证。经过测序，所得核苷酸序列如SEQIDNO:6所示，即鸡匍匐性状基因Cp。

实施例2与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记的获得

匍匐性状鸡缺失序列位于鸡7号染色体chr7:21798705-21810600(Ensembl，Galgal4版本)区域，因此设计缺失序列引物，在常规PCR反应条件下扩增缺失序列，检测待测个体的表型。

以提取的基因组DNA为模板(基因组DNA提取方法同实施例1)，采用PCR方法扩增缺失序列。基于缺失区域的上、下游序列设计引物，所用的引物序列为F：5′-TTTGGCAGCTAGAAGGGGAA-3′和R:5′-GTTGCGAGAGTGAGCCATG-3′(SEQIDNO:1-2)。

PCR反应体系(25.0μl)：鸡基因组DNA80-100ng,10×PCR缓冲液(含Mg²⁺)3.0μl，dNTPs(2.5mM)4.0μl，TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)1.5μl，引物F、R(10μmol/l)各0.2μl，ddH₂O补足至总体积25.0μl。

PCR扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，共33个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

用浓度1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测PCR扩增产物，PCR扩增产物如图3所示，从图中可以看出匍匐性状鸡可以扩增出单一DNA分子标记条带(234bp)，未检测到该条带的不是匍匐性状鸡。PCR产物胶回收后进行测序验证，并与数据库中序列进行比较，扩增出的DNA片段，即与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

实施例3匍匐性状鸡的筛查方法

3.1实验材料

兴义矮脚鸡父母代家系及后代：兴义矮脚鸡G₀代由5只匍匐型公鸡和15只匍匐型母鸡组成(种鸡蛋由贵州省畜禽遗传资源管理站提供，由中国农业大家禽遗传资源与育种试验基地孵化)。G₀代匍匐型公鸡与G₀代匍匐型母鸡杂交获得G₁代。G₁代匍匐型公鸡与匍匐型母鸡杂交获得G₂代(表1)。

3.2匍匐型个体检测方法

采集所有个体的血液，按照酚仿法提取基因组DNA，检测DNA质量，然后采用实施例2所述的PCR方法进行基因组中与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记的检测，若基因组DNA序列中出现单一的DNA分子标记条带(234bp)，则该个体为匍匐性状鸡；若基因组DNA序列中没有出现该条带，则该待测个体不是匍匐性状鸡。

对所有个体进行基因型判别，实验重复三次，结果如表1所示。

表1父母代家系及后代个体基因型检测结果

由表1可知，本发明的方法对匍匐性状鸡的辅助鉴定均可以达到100％。该基因的克隆及其检测引物对鸡匍匐性状鸡育种和改良工作，匍匐性状形成机理和地方鸡品种中筛查匍匐性状基因具有重要的意义。

实施例4个体基因分型与鸡匍匐性状的关联分析

4.1实验材料

拟采用具有完整系谱记录的兴义矮脚鸡为实验对象，G₀代种蛋由贵州省畜禽遗传资源管理站提供，在中国农业大家禽遗传资源与育种试验基地孵化与饲养。选取健康强健、体重相近的公鸡，按照1:5的比例，组建Cp基因型分离家系(匍匐型公鸡与匍匐型母鸡杂交)。在38周产蛋高峰期进行人工授精，收集种蛋进行人工孵化。分别在胚胎孵化的第4天、第9天采集早期死亡胚胎，出雏的当天采集所有个体血液。

4.2基因分型检测方法

采用实施例1中方法提取胚胎和血液基因组DNA，用NanoDrop2000测量DNA浓度及OD值，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，DNA于-20℃冰箱保存备用。使用实施例1(SEQIDNO:4-5)和2所述的引物，通过PCR方法进行基因组中与鸡匍匐性状相关的DNA分子标记的扩增检测。根据琼脂糖凝胶检测结果，筛查匍匐型与正常表型的鸡，利用实施例1的引物(SEQIDNO:4-5)，所有匍匐型与正常个体都可以扩增出大片段(3350bp)匍匐基因条带(图2)。利用实施例2的扩增DNA分子标记的引物(SEQIDNO:1-2)，若扩增结果只出现特有的条带(234bp)，则该个体为匍匐型个体；未出现特有的条带(234bp)，则该待测个体为正常个体。结果如表2所示。

表2不同表型个体基因型检测结果

卡方检验结果表明，鸡匍匐性状基因的缺失与鸡的匍匐表型紧密连锁(P>0.05)，表明该DNA分子标记可用于匍匐体型鸡的标记辅助选择与育种，为兴义及其他地方鸡品种保护和开发利用奠定了重要的基础，具有重要的研究和应用价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

Landauer,W.,andL.C.Dunn.1930.StudiesontheCreeperfowl.I.Genetics.J.Genet.23:397-413.

Rudnick,D.,andV.Hamburger.1940.OntheidentificationofsegregatedphenotypesinprogenyfromCreeperfowlmatings.Genetics25:215-224.；Rudnick,D.1945.DifferentiationofprospectivelimbmaterialfromCreeperchickembryosincoelomicgrafts.J.Exp.Zool.100:1-17.

Gayer,K.1942.AstudyofcolobomaandotherabnormalitiesintransplantsofeyeprimordiafromnormalandCreeperchickembryos.J.Exp.Zool.89:103-129.；Cairns,J.M.,andK.Gayer.1943.IdentificationofchickembryoshomozygousfortheCreeperfactor.J.Exp.Zool.92:229-242.；Gayer,K.,andV.Hamburger.1943.ThedevelopmentpotenciesofeyeprimordiaofhomozygousCreeperchickenembryostestedbyorthotopictransplantation.J.Exp.Zool.93:147-180.

Loewenthal,L.A.1957.HistologicalandhistochemicalstudiesonthehomozygousCreeperembryo.Anat.Rec.128:201-211.

Wallace,H.,R.I.Clyman,andL.P.Pierro.1969.NucleicaciddeficiencyintheprothanichomozygousmutantofCreeperfowl.J.Exp.Zool.172:245-252.

Shibuya,T.,andY.Kuroda.1970.StudiesofCreeperfowl.2.AnalysisofexpressionofCpgeneincellculture.Japan.J.Genet.45:496.；Dinner,B.1971.ChemicalanalysisofembryonicCreeperchickentibia.J.Dent.Res.50:704.

傅筑荫.2000.贵州兴义矮脚鸡及应用前景.中国家禽,22:35-36.；曹娟,陈彬,傅筑荫,戴燚.2010.贵州兴义矮脚鸡遗传方式研究.中国家禽,32:23-25.；国家畜禽遗传资源委员会组编.2010.中国畜禽遗传资源志·家禽志.北京：中国农业出版社,269-271.

金四华,侯卓成,李俊英,焦仁刚,龚俞,杨宁.兴义矮脚鸡体重与胫长Gompertz生长曲线及相关性分析.第十七次全国动物遗传育种学术讨论会论文集,四川成都,2013:505。