一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法。该方法包括：将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s。本发明脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝 胶电泳分型方法。

背景技术

脉冲场凝胶电泳(PFGE，PulsedFieldGelElectrophoresis)是一种分离大 分子DNA的方法。在普通的凝胶电泳中，大的DNA分子(>10kb)移动速度接 近，很难分离形成足以区分的条带。在脉冲场凝胶电泳中，电场不断在两种 方向(有一定夹角，而不是相反的两个方向)变动。DNA分子带有负电荷， 会朝正极移动。相对较小的分子在电场转换后可以较快转变移动方向，而较 大的分子在凝胶中转向较为困难。因此小分子向前移动的速度比大分子快。 脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10kb到10Mb的DNA分子。现今，PFGE 作为一种基因分型技术得到广泛的应用。目前，较多关于PFGE的应用集中在 致病菌基因分型以及溯源方面，而从已有的报道看出这些致病菌大多为革兰 氏阴性菌，鲜有关于PFGE在革兰氏阳性菌应用中的报道。

革兰氏阳性菌大部分为耐热芽孢杆菌，这些耐热芽孢杆菌在食品尤其是 乳制品生产中会造成重大损失。主要在乳制品企业生产中表现在耐受传统的 巴氏杀菌(72℃/15s)，有些甚至能耐受超高温杀菌(UHT，140-145℃/2-5s) 而存活下来，对生产加工甚至最终产品有重要影响。例如，枯草芽孢杆菌对 特殊菌体进行促芽孢和微胶囊包被处理，在孢子状态下稳定性好，能耐氧化； 耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟。

目前，适合于革兰氏阴性菌的PFGE技术无法对革兰氏阳性菌进行准确的 基因分型，PFGE在乳源革兰氏阳性菌研究尚未有研究。因此，开展乳源革兰 氏阳性菌PFGE研究应用一方面能为这类菌进行基因分型；另一方面能进行溯 源研究，控制耐热芽孢菌对生产加工和产品影响，减少企业损失。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型 方法。该脉冲场凝胶电泳分型方法可对乳源革兰氏阳性菌进行准确分型。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，包括 如下步骤：

将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术对 DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末 转换时间为8～10s。

在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的初始转换时间为 2.2s，终末转换时间为10s。

作为优选，脉冲场凝胶电泳的梯度电压为5～7V/cm，电泳液温度为 12～16℃，电压角度为100°～120°，初始电流为140～170mA。

在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳技术的梯度电压为 6V/cm，电泳液温度为14℃，电压角度为120°，初始电流为170mA。

作为优选，脉冲场凝胶电泳的运行时间为15～16h。

在本发明提供的一些实施例中，脉冲场凝胶电泳运行时间为15h。

作为优选，裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合 物。

作为优选，以mL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为 5：(1～3)：(7～9)。

优选地，以mL/mg/mg计，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌酶的用量为5： 2：8。

作为优选，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的体积比为 (40～60)：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～5。

优选地，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的体积比为51：4，乳源 革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～4.5。

作为优选，裂解的温度为50～55℃，时间为2～5h，转速为50～70rpm。

优选地，裂解的温度为54℃，时间为4h，转速为60rpm。

作为优选，DNA酶切采用的限制性内切酶为XbaI内切酶。

在本发明提供的一些实施例中，DNA酶切的温度为37℃，时间为2～4h。

作为优选，将乳源革兰氏阳性菌裂解之前还包括初步裂解的步骤，初步 裂解采用的裂解液为细胞裂解液、蛋白酶K和溶菌酶的混合物。

作为优选，以mL/mg/mg计，初步裂解中，细胞裂解液、蛋白酶K与溶 菌酶的用量为1：(4～6)：(18～22)。

优选地，以mL/mg/mg计，初步裂解中，细胞裂解液、蛋白酶K与溶菌 酶的用量为1：5：20。

作为优选，初步裂解中，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的菌悬 液的体积比为(4～6)：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4～5。

优选地，初步裂解中，裂解采用的裂解液与乳源革兰氏阳性菌的体积比 为5：4，乳源革兰氏阳性菌的菌悬液的OD值为4.5。

作为优选，初步裂解的温度为36～38℃，时间为30～50min。

优选地，初步裂解的温度为37℃，时间为30min。

在本发明提供的一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌、苏 云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或蜡样芽孢杆菌中的一种或几种。

在本发明提供的一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分 型方法包括如下步骤：

1、初步裂解：

向400μL乳源革兰氏阳性菌的菌悬液中加入：细胞裂解液、蛋白酶K、 溶菌酶，以体积：OD计，细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为400μL/ (4～5)、20μL/(4～5)、80μL/(4～5)，放入37℃水浴30min。

2、制胶：

配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中待用；将制 得的胶与菌液混合均匀，混合时避免气泡产生，凝固，得到胶块。

3、裂解：

混合裂解液制备：细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，以体积：OD计，细 胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为5mL/(4～5)、20μL/(4～5)、80μL /(4～5)。胶块裂解：将胶块与混合裂解液混合，54℃水浴4h，转速60rpm。

4、胶块清洗：

包括DDH₂O清洗、TE缓冲液清洗。

5、胶块内DNA酶切：

采用XbaI内切酶对胶块内DNA进行酶切，在37℃水浴中孵育2～4小时。

6、电泳：

配制1％SeaKemGold(SKG)胶、加样、电泳；

电泳条件设置：梯度电压为6V/cm，电泳液温度为14℃，电压角度为 120°，初始转换时间为2.2s，终末转换时间为10s，初始电流为170mA，运 行时间为15h。

7、图像处理：

电泳结束后，取出胶，染色，脱色，对电泳胶块进行拍照。

在本发明提供的另一些实施例中，乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳 分型方法包括如下步骤：

1、初步裂解：

向400μL乳源革兰氏阳性菌的菌悬液中加入：以体积：OD计，细胞裂解 液、蛋白酶K、溶菌酶，用量分别为400μL：4.5、20μL/4.5、80μL/4.5，放入 37℃水浴30min。

2、制胶：

配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中待用；将制 得的胶与菌液混合均匀，混合时避免气泡产生，凝固，得到胶块。

3、裂解：

混合裂解液制备：以体积：OD计，细胞裂解液、蛋白酶K、溶菌酶，用 量分别为5mL/4.5、20μL/4.5、80μL/4.5；

胶块裂解：将胶块与混合裂解液混合，54℃水浴4h，转速60rpm。

4、胶块清洗：

包括DDH₂O清洗、TE缓冲液清洗。

5、胶块内DNA酶切：

采用XbaI内切酶对胶块内DNA进行酶切，在37℃水浴中孵育2～4小时。

6、电泳：

配制1％SeaKemGold(SKG)胶、加样、电泳；

电泳条件设置：梯度电压为5～7V/cm，电泳液温度为12～16℃，电压角度 为100°～120°，初始转换时间为1.8～2.5s，终末转换时间为8～10s，初始电 流为140～170mA，运行时间为15～16h。

7、图像处理：

电泳结束后，取出胶，染色，脱色，对电泳胶块进行拍照。

本发明提供了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，该方 法包括：将乳源革兰氏阳性菌裂解、DNA酶切后，采用脉冲场凝胶电泳技术 对DNA片段进行分离，所述脉冲场凝胶电泳的初始转换时间为1.8～2.5s，终末 转换时间为8～10s。本发明至少具有如下优势之一：

1、按照本发明提供的乳源革兰氏阳性菌PFGE对乳源革兰氏阳性菌进行 分型，可得到分辨率高、能进行基因分型的电泳图，因此可准确对乳源革兰 氏阳性菌进行基因分型；

2、本发明中采用的裂解液可充分裂解耐热型的乳源革兰氏阳性菌的细胞 壁，从而解决了细胞壁破壁的难点，为乳源革兰氏阳性菌PFGE破壁之后步骤 处理顺利进行提供关键方法；

3、本发明中在裂解之前还包括初步裂解的步骤，从而使细胞壁裂解地更 加充分，更有利于乳源革兰氏阳性菌的基因分型。

4、本发明提供的乳源革兰氏阳性菌PFGE为乳源革兰氏阳性菌溯源具有 非常重要意义。

附图说明

图1示实施例1的脉冲场凝胶电泳图；其中，M为标准菌株H9812；

图2示对比例1的脉冲场凝胶电泳图；其中，M为标准菌株H9812；

图3示对比例2的脉冲场凝胶电泳图；其中，M为标准菌株H9812。

具体实施方式

本发明公开了一种乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法，本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为 包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进 行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的乳源革兰氏阳性菌的脉冲场凝胶电泳分型方法中所用菌 种、试剂或仪器均可由市场购得。蛋白酶K的浓度为100mg/mL，溶菌酶的浓 度为100mg/mL。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

采用分离纯化的枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡样 芽孢杆菌这四种革兰氏阳性菌作为分析样品，采用本发明提供的脉冲场凝胶 电泳快速分型方法进行分型，包括以下工艺步骤：

1、制胶：

(1.1)菌落液态培养：选用从乳源中分离纯化的枯草芽孢杆菌、苏云金芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌菌株挑入培养基中进行液态培养两天 时间。

(1.2)菌悬液制备：将菌液加入EP管中，进行离心操作，离心条件： 5000rpm、5min。弃去上清液，将菌泥转移至有CSB的Falcon管中，调节OD 值为4.5即可。

(1.3)初步裂解：将制备好的400μL菌悬液离心，离心条件：5000rpm、 5min。弃去上清液，分别加入：400μL细胞裂解液、20μL蛋白酶K(酶浓度 100mg/mL)、80μL溶菌酶(酶浓度100mg/mL)。之后放入37℃水浴30min。

(1.4)溶胶：配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中 待用。

(1.5)制胶：移液枪吸取400μL胶加入EP管中，用枪头轻轻吸、吹3次保 证混合均匀(混合时要避免气泡产生)，之后将混合物加入模具加样孔中。 室温下凝固15min。

2、胶块裂解：

(2.1)混合裂解液制备：在50mL聚丙烯螺帽管中加入：5mLCLB、20μL 蛋白酶K、80μL溶菌酶。

(2.2)胶块裂解：将胶块移入相应管中，做好标记，放入54℃水浴摇床中， 水浴4h，转速60rpm。

3、胶块清洗：

(3.1)DDH₂O清洗：从水浴摇床中拿出螺帽管，盖上绿色滤帽。轻倒细胞 裂解液，在实验台上轻磕使胶块落在管底。每管中加入10-15mL预热的 DDH₂O，确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇 10-15分钟。重复3次

(3.2)TE缓冲液清洗：50℃水浴预热TE缓冲液。倒掉DDH₂O，加入10-15mL 预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇10-15分钟。倒掉TE，用TE再重复洗5 次，每次10－15分钟。

(3.3)倒掉最后一次的TE，加入5-10mLTE，继续下一步的酶切或放在4℃ 冰箱保存备用。

4、胶块内DNA酶切：

(4.1)稀释缓冲液：以灭菌超纯水按下表配制。

表1稀释缓冲液配比

试剂 μL/胶块 μL/10胶块 μL/15胶块 灭菌纯水 198μL 1980μL 2970μL 配套缓冲液 2μL 20μL 30μL 总体积 200μL 2000μL 3000μL

注意：缓冲液要置于冰上。

(4.2)在1.5mL微量离心管上标记好相应的样品名称；在每个1.5mL微量 离心管中加入200μL缓冲液稀释液。小心用小铲从TE中取出胶块，放在干 净的培养皿上。用刀片切下2-2.5mm宽的胶块，放入含缓冲液稀释液的1.5mL 微量离心管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。用同 样的方法处理标准株H9812的胶块。

注意：所切下的胶块的形状和大小，取决于灌注电泳胶所用的梳子齿大 小。

(4.3)将管子放在37℃水浴中孵育5-10分钟，或室温10-15分钟。

(4.4)在用稀释缓冲液孵育的过程中，将限制性内切酶XbaI按照以下的比 例配制酶切缓冲液，混匀。

表2酶切缓冲液配比

试剂 μL/胶块 μL/10胶块 μL/15胶块 灭菌纯水 175μL 1750μL 2625μL 配套缓冲液 20μL 200μL 300μL 酶(10U/μL) 5μL 50μL 75μL 总体积 200μL 2000μL 3000μL

注意：将酶液置于冰上，用后立即放回－20℃冰箱保存。

(4.5)用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。

(4.6)每管加入200μL混合液，实验台上轻磕管子底部，确保胶块在液面 的下面。

(4.7)在37℃水浴中孵育至少2小时。

5、电泳胶制备：

(5.1)打开水浴箱，温度调至55-60℃；配制2200mL的0.5×TBE；用0.5×TBE 配制1％SeaKemGold(SKG)胶。

(5.2)熔化时，微波加热60秒，混合；每隔15-30秒重复一次，直到胶完 全熔化。放在55-60℃水浴箱备用(温度至少平衡30分钟以后使用)。

6、加样：

(6.1)安装胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平 仪调整胶槽使其水平。

(6.2)把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。

(6.3)用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。

(6.4)把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在同一条直线上，并且胶块与胶 槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；在室温下凝固30分钟左右。记录加样顺序。

7、电泳条件设置：

(7.1)调整电泳槽水平。

(7.2)加入2-2.2L新配制的0.5×TBE缓冲液，关上盖子。

(7.3)打开主机和泵的开关，确保泵设在70(这时缓冲液的流速约1L/分钟) 和缓冲液在管道中正常循环。

(7.4)打开冷凝机，确保预设温度在14℃(缓冲液达到该温度通常需要20 分钟左右)。

(7.5)打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多 余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。

(7.6)设置电泳参数：梯度电压6v/cm；电泳液温度14℃；电压角度120°； 初始转换时间2.2s；终末转换时间：10s；初始电流：170mA；运行时间：15h。

8、图像处理：

(8.1)电泳结束后，关闭仪器。取出胶，放在盛放400mLGel-red溶液的托 盘内，染色20-30分钟。

(8.2)以500mL纯水脱色每20-30分钟换一次纯水，脱色4次。

(8.4)用相应软件对电泳胶块进行拍照分析。

图1中分别为标准菌株H9812、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣 芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌电泳图。

从图1可以看出采用上述PFGE操作流程能较好的对上述四种革兰氏阳 性菌进行分子分型。图样条带清晰，可分辨率高。

对比例1

采用分离纯化的枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡样 芽孢杆菌这四种革兰氏阳性菌作为分析样品，选择常规脉冲场凝胶电泳快速 分型方法，包括以下工艺步骤：

1、制胶：

(1.1)菌落液态培养：选用从乳源中分离纯化的枯草芽孢杆菌、苏云金芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌菌株挑入培养基中进行液态培养两天 时间。

(1.2)菌悬液制备：将菌液转移至有CSB的Falcon管中，调节OD值为4.5 即可，再吸取400μL菌液放置EP管中待用。

(1.3)溶胶：配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中 待用。

(1.5)制胶：移液枪吸取400μL胶加入EP管中，用枪头轻轻吸、吹3次保 证混合均匀(混合时要避免气泡产生)，之后将混合物加入模具加样孔中。 室温下凝固15min。

2、胶块裂解：

(2.1)混合裂解液制备：在50mL聚丙烯螺帽管中加入：5mLCLB、20μL 蛋白酶K。

(2.2)胶块裂解：将胶块移入相应管中，做好标记，放入54℃水浴摇床中， 水浴4h，转速60rpm。

3、胶块清洗：

(3.1)DDH₂O清洗：从水浴摇床中拿出螺帽管，盖上绿色滤帽。轻倒细胞 裂解液，在实验台上轻磕使胶块落在管底。每管中加入10-15mL预热的 DDH₂O，确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇 10-15分钟。重复3次。

(3.2)TE缓冲液清洗：50℃水浴预热TE缓冲液。倒掉DDH₂O，加入10-15mL 预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇10-15分钟。倒掉TE，用TE再重复洗5 次，每次10－15分钟。

(3.3)倒掉最后一次的TE，加入5-10mLTE，继续下一步的酶切或放在4℃ 冰箱保存备用。

4、胶块内DNA酶切：

(4.1)稀释缓冲液：以灭菌超纯水按表1配制。

注意：缓冲液要置于冰上。

(4.2)在1.5mL微量离心管上标记好相应的样品名称；在每个1.5mL微量 离心管中加入200μL缓冲液稀释液。小心用小铲从TE中取出胶块，放在干 净的培养皿上。用刀片切下2-2.5mm宽的胶块，放入含缓冲液稀释液的1.5mL 微量离心管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。用同 样的方法处理标准株H9812的胶块。

注意：所切下的胶块的形状和大小，取决于灌注电泳胶所用的梳子齿大 小。

(4.3)将管子放在37℃水浴中孵育5-10分钟，或室温10-15分钟。

(4.4)在用稀释缓冲液孵育的过程中，将限制性内切酶XbaI按照表2的比 例配制酶切缓冲液，混匀。

注意：将酶液置于冰上，用后立即放回-20℃冰箱保存。

(4.5)用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。

(4.6)每管加入200μL混合液，实验台上轻磕管子底部，确保胶块在液面 的下面。

(4.7)在37℃水浴中孵育至少2小时。

5、电泳胶制备：

(5.1)打开水浴箱，温度调至55-60℃；配制2200mL的0.5×TBE；用0.5×TBE 配制1％SeaKemGold(SKG)胶。

(5.2)熔化时，微波加热60秒，混合；每隔15-30秒重复一次，直到胶完 全熔化。放在55-60℃水浴箱备用(温度至少平衡30分钟以后使用)。

6、加样：

(6.1)安装胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平 仪调整胶槽使其水平。

(6.2)把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。

(6.3)用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。

(6.4)把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在同一条直线上，并且胶块与胶 槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；在室温下凝固30分钟左右。记录加样顺序。

7、电泳条件设置：

(7.1)调整电泳槽水平。

(7.2)加入2-2.2L新配制的0.5×TBE缓冲液，关上盖子。

(7.3)打开主机和泵的开关，确保泵设在70(这时缓冲液的流速约1L/分钟) 和缓冲液在管道中正常循环。

(7.4)打开冷凝机，确保预设温度在14℃(缓冲液达到该温度通常需要20 分钟左右)。

(7.5)打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多 余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。

(7.6)设置电泳参数：梯度电压6v/cm；电泳液温度14℃；电压角度120°； 初始转换时间2.2s；终末转换时间：63.8s；初始电流：170mA；运行时间： 15h。

8、图像处理：

(8.1)电泳结束后，关闭仪器。取出胶，放在盛放400mLGel-red溶液的托 盘内，染色20-30分钟。

(8.2)以500mL纯水脱色每20-30分钟换一次纯水，脱色4次。

(8.4)用相应软件对电泳胶块进行拍照分析。

图2中分别为标准菌株H9812、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣 芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌电泳图。

从图2可以看出采用上述PFGE操作流程不能较好的对上述四种革兰氏 阳性菌进行分子分型。图样条带不清晰，可分辨率低。

对比例2

采用分离纯化的枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和蜡样 芽孢杆菌这四种革兰氏阳性菌作为分析样品，选择常规脉冲场凝胶电泳快速 分型方法，包括以下工艺步骤：

1、制胶：

(1.1)菌落液态培养：选用从乳源中分离纯化的枯草芽孢杆菌、苏云金芽 孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌菌株挑入培养基中进行液态培养两天 时间。

(1.2)菌悬液制备：将菌液转移至有CSB的Falcon管中，调节OD值为4.5 即可，再吸取400μL菌液放置EP管中待用。

(1.3)溶胶：配置1％SeakemGold:1％SDS，微波溶解，放置在55℃水浴中 待用。

(1.5)制胶：移液枪吸取400μL胶加入EP管中，用枪头轻轻吸、吹3次保 证混合均匀(混合时要避免气泡产生)，之后将混合物加入模具加样孔中。 室温下凝固15min。

2、胶块裂解：

(2.1)混合裂解液制备：在50mL聚丙烯螺帽管中加入：5mLCLB、20μL 蛋白酶K、80μL溶菌酶。

(2.2)胶块裂解：将胶块移入相应管中，做好标记，放入54℃水浴摇床中， 水浴4h，转速60rpm。

3、胶块清洗：

(3.1)DDH₂O清洗：从水浴摇床中拿出螺帽管，盖上绿色滤帽。轻倒细胞 裂解液，在实验台上轻磕使胶块落在管底。每管中加入10-15mL预热的 DDH₂O，确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇 10-15分钟。重复3次。

(3.2)TE缓冲液清洗：50℃水浴预热TE缓冲液。倒掉DDH₂O，加入10-15mL 预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇10-15分钟。倒掉TE，用TE再重复洗5 次，每次10－15分钟。

(3.3)倒掉最后一次的TE，加入5-10mLTE，继续下一步的酶切或放在4℃ 冰箱保存备用。

4、胶块内DNA酶切：

(4.1)稀释缓冲液：以灭菌超纯水按表1配制。

注意：缓冲液要置于冰上。

(4.2)在1.5mL微量离心管上标记好相应的样品名称；在每个1.5mL微量 离心管中加入200μL缓冲液稀释液。小心用小铲从TE中取出胶块，放在干 净的培养皿上。用刀片切下2-2.5mm宽的胶块，放入含缓冲液稀释液的1.5mL 微量离心管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。用同 样的方法处理标准株H9812的胶块。

注意：所切下的胶块的形状和大小，取决于灌注电泳胶所用的梳子齿大 小。

(4.3)将管子放在37℃水浴中孵育5-10分钟，或室温10-15分钟。

(4.4)在用稀释缓冲液孵育的过程中，将限制性内切酶XbaI按照表2的比 例配制酶切缓冲液，混匀。

注意：将酶液置于冰上，用后立即放回-20℃冰箱保存。

(4.5)用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。

(4.6)每管加入200μL混合液，实验台上轻磕管子底部，确保胶块在液面 的下面。

(4.7)在37℃水浴中孵育至少2小时。

5、电泳胶制备：

(5.1)打开水浴箱，温度调至55-60℃；配制2200mL的0.5×TBE；用0.5×TBE 配制1％SeaKemGold(SKG)胶。

(5.2)熔化时，微波加热60秒，混合；每隔15-30秒重复一次，直到胶完 全熔化。放在55-60℃水浴箱备用(温度至少平衡30分钟以后使用)。

6、加样：

(6.1)安装胶槽，调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平 仪调整胶槽使其水平。

(6.2)把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。

(6.3)用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。

(6.4)把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在同一条直线上，并且胶块与胶 槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；在室温下凝固30分钟左右。记录加样顺序。

7、电泳条件设置：

(7.1)调整电泳槽水平。

(7.2)加入2-2.2L新配制的0.5×TBE缓冲液，关上盖子。

(7.3)打开主机和泵的开关，确保泵设在70(这时缓冲液的流速约1L/分钟) 和缓冲液在管道中正常循环。

(7.4)打开冷凝机，确保预设温度在14℃(缓冲液达到该温度通常需要20 分钟左右)。

(7.5)打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多 余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。

(7.6)设置电泳参数：梯度电压6v/cm；电泳液温度14℃；电压角度 100°-120°；初始转换时间2.2s；终末转换时间：20s；初始电流：140mA；运 行时间：15h。

8、图像处理：

(8.1)电泳结束后，关闭仪器。取出胶，放在盛放400mLGel-red溶液的托 盘内，染色20-30分钟。

(8.2)以500mL纯水脱色每20-30分钟换一次纯水，脱色4次。

(8.4)用相应软件对电泳胶块进行拍照分析。

图3中分别为标准菌株H9812、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、地衣 芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌电泳图。

从图3可以看出采用上述PFGE操作流程不能较好的对上述四种革兰氏 阳性菌进行分子分型。图样条带不清晰，可分辨率低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。