小麦抗条锈病基因Yr69及其连锁的SSR分子标记以及使用方法

摘要

本发明涉及植物遗传学和小麦育种领域，特别涉及小麦抗条锈病形状的分子标记，具体为小麦抗条锈病基因Yr69及其连锁的SSR分子标记以及使用方法，解决现有的分子标记与抗条锈病基因Yr69的遗传距离远，标记不够准确的问题，使用方法：1）、以小麦DNA为模板，2SA33为引物扩增；2）、程序为：预变性；变性，退火，延伸，循环；延伸；保存备用；3）、电泳后将产物和上样缓冲液混合后点样，电泳后染色拍照；4）、扩增出的特异条带说明存在Yr69。优点：1、获得2AS33；2、显性标记，遗传距离为1.9cM，快速、准确鉴定Yr69基因并预测白粉病抗性，加快Yr69的利用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物遗传学和小麦育种领域，特别涉及小麦抗条锈病性状的分子标记，具体为小麦抗条锈病基因Yr69及其连锁的SSR分子标记以及使用方法。

背景技术

由小麦条锈菌（Pucciniastriiformiswestf.sp.tritici(Pst)）引起的小麦条锈病是最主要的世界性真菌病害。它具有流行速度快、发病面积广、危害程度高等特点，病害严重时，可使小麦减产40%以上，甚至绝收。合理利用抗病品种是防治该病害最经济环保、安全有效的方法。但由于小麦条锈病菌的高度变异性及小麦条锈菌新致病类型CYR31、CYR32和CYR33等的出现和流行以及抗病品种的大面积单一种植，致使大多数品种抗性不能持久，很容易被条锈菌新小种所克服。因此，不断寻找、鉴定新的抗性资源，选育新的抗性小麦品种，并与其它抗条锈基因聚合，培育持久抗病性的聚合品种、多系品种和多抗品种，对延缓条锈菌病理小种的毒性变异、拓宽小麦品种遗传基础、增加抗病品种的使用寿命非常必要，这也是实现我国小麦条锈病可持续控制的根本措施。

小麦的近缘种属植物蕴藏着丰富的抗条锈病基因资源。随着小麦远缘杂交和染色体工程的深入开展，小麦近缘种属的许多抗条锈病基因被转移到的小麦中。目前，国际上已正式命名的抗条锈基因及QTL位点中有许多来源于小麦的近缘种属植物。长穗偃麦草（又称彭提卡偃麦草,Th.ponticum,2n=70,JJJJ^sJ^s/StStE^eE^bE^x），是小麦的近缘属植物，具有多花多实、抗干旱、耐盐碱、优质、免疫或高抗多种小麦病害等优良特性。长穗偃麦草与小麦有高度可杂交性，且其优良基因易于在小麦背景中表达，是小麦外源基因转移和远缘杂交不可多得的优异基因供体。CH7086是衍生于长穗偃麦草与普通小麦的八倍体小偃麦小偃7430的小偃麦渗入系，对小麦白粉病和条锈病均免疫。条锈病抗病性鉴定及遗传分析表明，CH7086携带有一个显性抗病基因，国际基因组命名委员会将其命名为Yr69。

抗病基因的分子标记及连锁图谱建立是对目标基因进行精细遗传定位及图位克隆抗病基因的基础，同时更是分子标记辅助育种的有力工具。简单重复序列（simplesequencerepeats，SSR）是一类广泛存在于基因组上的、由几个核苷酸重复单位组成的串联重复序列。由于在基因组上数量丰富、多态性高、共显性遗传、操作简单、结果稳定可靠等优点而被广泛应用与种质鉴定、基因的分子标记定位及分子标记辅助育种中。因此，利用SSR分子标记定位Yr69和开发与其连锁的分子标记对于克隆和利用抗条锈基因Yr69具有重要意义。

发明内容

本发明解决现有的分子标记与抗条锈病基因Yr69的遗传距离远，标记不够准确的问题，提供一种小麦抗条锈病基因Yr69及其连锁的SSR分子标记以及使用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：小麦抗条锈病基因Yr69连锁的SSR分子标记，所述SSR分子标记为引物2AS33，所述引物的核苷酸序列为：上游序列为5'-AGAAGGCACACTGCTGGAAC-3'，下游序列为5'-ACATGAGTGAGTTGTGAGTC-3'。

小麦抗条锈病基因Yr69连锁的SSR分子标记在辅助选择标记抗条锈病基因Yr69中的应用。

小麦抗条锈病基因Yr69连锁的SSR分子标记，与小麦抗条锈病基因Yr69的遗传距离为1.9cM。

小麦抗条锈病基因Yr69连锁的SSR分子标记用于鉴定小麦中是否含有抗条锈病基因Yr69的使用方法，包括如下操作步骤：

1）、以小麦基因组DNA为PCR扩增模板，以SSR分子标记2AS33为引物，进行PCR扩增，反应体系为20μL，所述反应体系包括：50-100ng/μL小麦基因组DNA，10×PCRbuffer，具体为：10mMTris-HCl，pH值8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl₂；0.2mMdNTP，1UTaq酶，0.25μM引物，最后加入一滴矿物油；

2）、PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用；

3）、电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将5μlPCR产物和5μL上样缓冲液混合后点样，180V电压下电泳2h，硝酸银染色拍照；

4）、分析鉴定，能扩增出269bp的特异条带，则说明小麦种质中存在抗条锈病基因Yr69，否则，待测小麦种质中不存在抗条锈病基因Yr69。

小麦抗条锈病基因Yr69来源于长穗偃麦草，所述小麦抗条锈病基因Yr69位于小麦与长穗偃麦草杂交获得的小麦品种2AS染色体远离着丝粒的顶端。

本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明获得与抗条锈病基因Yr69连锁的分子标记2AS33；2、该标记是显性标记，与Yr69的遗传距离为1.9cM，可以快速、准确鉴定小麦Yr69基因的存在与否以及存在状态并预测条锈病抗性，从而加快对小麦抗条锈病基因Yr69的利用；3、实现小麦抗条锈病抗原的多样化。

附图说明

图1为引物2AS33在CH7086、台长29以及台长29×CH7086F₂代部分单株的扩增结果。图中M:Marker;P_R:抗病亲本(CH7086);P_S:感病亲本(台长29);BR:抗病基因池;Bs:感病基因池;R:纯合抗病株;H:分离株;S:纯和感病株；箭头所示为引物2AS33在抗病亲本和单株中跟抗病基因Yr69连锁的条带；

图2为抗条锈基因Yr69的遗传连锁图与中国春2A缺失系遗传图谱的对比图。图中（a）为Yr69的遗传连锁图；（b）为中国春2A缺失系遗传图。

具体实施方式

用于抗性遗传分析的抗病亲本CH7086与台长29杂交、回交产生后代的分离群体F₁、F₂、BC₁和F_2:3家系，构成遗传作图群体；

一、成株期抗性鉴定

将供试材料按以下播种方法种植于大田：抗病亲本CH7086、感病亲本台长29和绵阳11及CH7086×台长29和CH7086×绵阳11的F₁代各种植1行，F₂代种植10行，BC₁代种植7行，每行单粒点播18粒；F_2:3家系及亲本各种植1行，每行单粒点播15-20粒；行长1.6m，行距0.25m；为确保鉴定材料充分发病，每隔10行种植1行铭贤169做感病对照，并在实验材料四周种植高感条锈病品种绵阳11作为诱发材料；实验材料于拔节后接种，将准备好的新鲜孢子悬浮液喷在叶子已去蜡质的麦苗上（在喷雾器内加入CYR32的新鲜孢子，先用少量清水湿润后搅成糊状，再加入足量的水至淡桔黄色）；待感病对照铭贤169充分发病后调查记载侵染型，逐株调查记录各小麦材料的反应型，反应型按6级标准记载；根据抗×感杂种F₁的反应型及F₂、F_2:3和BC₁群体中抗、感单株分离比例，分析小麦新品系CH7086对条锈菌CRY32抗病基因数目与显隐性；根据χ²测验判定其观察值与理论值的符合程度，最终推断出抗条锈品系CH7086所携带抗性基因的数目、显隐性及互作方式。

二、F₂群体的分子标记分析（本步骤仅以一种具体的实施方式证明本发明所述方法成立，并不代表仅有下述小麦品种可以用本发明所述方法鉴定Yr69基因的存在与否）

1、总DNA提取采用SDS法；

2、抗病池和感病池的建立：选取CH7086×台长29杂交组合F₂分离群体205个单株用于SSR分析和抗病基因染色体定位；依据Michelmore等提出的分离群体分组分析法（bulkedsegregationanalysis，BSA），分别选取10株免疫单株（抗病反应等级为0级）和10株高感单株（感病反应等级为4级）的DNA等量混合构建抗病池（BR）和感病池（BS）；

3、多态性分子标记筛选：先用抗感亲本和抗病池、感病池对微卫星标通过PCR方法进行多态性筛选，具体为：（1）PCR反应总体系为20μL，其中包括10×PCRbuffer，具体为：10mMTris-HCl，pH值8.3，50mMKCl，1.5mMMgCl₂；0.2mMdNTP，1UTaq酶，0.25μM引物和50-100ng/μL小麦基因组DNA，最后加入一滴矿物油；（2）PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存备用；（3）电泳为8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将5μLPCR产物和5μL上样缓冲液混合后点样，180V电压下电泳2h，硝酸银染色拍照；（注：这一部分是在发现该基因过程中所使用的方法，属于通用方法，“分子标记的使用方法”中的程序是使用分子标记2AS33进行该基因存在与否的检测时所使用的方法。通用方法不一定适用于所有的分子标记，所以2AS33的使用程序虽然与通用方法相同，还是单独做了说明。）

4、功能分子标记的开发：在GrainGenes数据库中利用定位于小麦2AS-0.78-1.00区段上的EST去比对小麦2AS勘测序列（国际小麦基因组测序联盟2014），比对条件BLASTn的E值设为0.00001；将比对到的重叠群序列提交到SSRIT软件，寻找SSR标记；

5、遗传图谱构建：利用在抗感池中筛选的多态性分子标记和构建的F₂群体，进行基因分型，用Kosambi函数计算分子标记与目标基因的遗传距离（cM），并使用Joinmap4.0软件分析多态性标记与抗病基因的连锁关系，并构建遗传连锁图谱；

三、结果

1、Yr69遗传分析：在杂交组合CH7086×台长29F₂的205个单株中，152株抗病（侵染型为0-0;级的96株、1-2级的56株）、53株感病（侵染型为3级的10株、4级的43株），其χ²=0.08，P=0.78，表明抗、感的分离比符合3R:1S（如下表1所示）；

表1抗′感杂交组合不同世代群体对条锈菌CYR32的成株期抗性分离

2、Yr69的染色体定位：

本试验中选取了杂交组合CH7086×台长29的205株F₂群体用于微卫星标记分析；选取平均分布于小麦2l条染色体上的608对SSR引物，对抗、感亲本进行多态性筛选，发现有4对SSR引物Xgwm210、Xwmc382、Xbarc124和Xgwm636在抗感性状池之间存在多态性，且经F₂分离群体验证这4对SSR标记均与材料中的抗病基因连锁；通过Graingenes网站（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）可以查询到的小麦微卫星遗传图谱和R?der、Somers等分别构建的小麦高密度微卫星遗传图谱研究比对，发现这4对引物都被定位在2AS染色体上，因此初步推断CH7086的抗病基因位于2AS上；为了进一步对抗性基因准确定位，利用中国春和全套中国春缺体-四体材料、双端体材料和缺失系材料对这4对具有多态性的引物进行扩增，结果将与抗性标记连锁的目的基因初步定位于bin2AS5-0.78-1.00区间；

为了对抗病基因所在染色体区段进行标记加密并进一步确定与标记连锁的目的基因的准确性与可靠性，本研究选取来自Graingenes网站（http://wheat.pw.usda.gov/cgi-bin/graingenes）小麦微卫星遗传图谱和R?der、Somers、Eriksen和Marone等多人构建的小麦高密度微卫星遗传图谱上的定位于染色体2AS上的50对SSR引物、9对STS引物以及定位于2AS5-0.78-1.00染色体区间的小麦EST序列设计出154对EST引物，对抗感亲本和抗感性状池进行筛选；结果发现，除前述Xgwm210、Xwmc382、Xbarc124和Xgwm636外，另外2对SSR引物Xgpw7101和Xwmc25、1对STS引物Xmag3807及1对EST引物2AS33（图1），在抗感亲本和抗感性状池间和群体后代材料中也呈现稳定一致的多态性差异；通过JoinMap4.0软件分析，这6对SSR标记、1对STS标记及1对EST标记与抗病基因YrCH86处于同一个连锁群中，位置顺序为：Xgwm636-Xgwm210-Xwmc382-Xwmc25-X2AS33-YrCH86-Xmag3807-Xgpw7101-Xbarc124，遗传距离分别为4.5cM、2.3cM、2.5cM、2.7cM、1.9cM、3.1cM、3.4cM、4.8cM（图2）；目前国际小麦基因命名委员会已正式将抗性基因YrCH86定名为Yr69。

<110>山西省农业科学院作物科学研究所

<120>小麦抗条锈病基因Yr69及其连锁的SSR分子标记以及使用方法

<160>2

<210>1

<211>总数

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物序列

<222>（1）…（20）

<400>1

5'-AGAAGGCACACTGCTGGAAC-3'

20

<210>2

<211>总数

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物序列

<222>（1）…（20）

<400>2

5'-ACATGAGTGAGTTGTGAGTC-3'

20