一种玉米大斑病菌分子检测引物及快速检测方法

摘要

本发明涉及一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法，属于农作物病害检测和生物技术领域。该特异性引物包括上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’，下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’；采用上述引物经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳可在玉米大斑病菌纯DNA、带菌的玉米叶片或叶鞘中特异性地扩增出片段长度为356bp的特异性扩增产物。本发明检测引物特异性强、灵敏度高，检测方法实用性好，操作简便快捷；本发明能实现玉米大斑病的早期检测，还能有效区分玉米上的灰斑病、圆斑病和小斑病，对玉米大斑病的早期预警和防控，防治病害的扩散蔓延具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法，专用于玉米大斑病菌的快速分子检测，同时可实现田间玉米大斑病的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物技术领域。

背景技术

玉米以其用途广、产量高、对种植条件要求低等优点在世界上多个国家广泛种植。在我国，玉米是种植面积居首位、产量居次席的重要粮食和经济作物，除作为粮食用途外，现代玉米产业还发展出能源、饲料、果蔬等多种用途。玉米产业健康发展对改善我国农业产业结构，保障粮食安全，扩大国民经济总量具有十分积极的重要作用。

玉米大斑病(northerncornleafblight，NCLB)是由凸脐蠕孢菌(Exserohilumturcicum)侵染引起的严重叶枯性真菌病害，可以为害叶片，严重时也为害叶鞘和苞叶。1876年玉米大斑病在意大利首次报道，20世纪初期已经广泛发生于美洲、欧洲、亚洲和大洋洲的玉米产区，成为当今世界上玉米主要叶部病害之一，有时还会引起玉米根腐病、茎腐病的其他玉米病害的发生为害。据报道，玉米大斑病一般年份减产20%左右，严重时减产50%以上。玉米大斑病菌病原以菌丝体及分生孢子随病残体越冬，成为第2年发病的初侵染来源，在玉米生长季节越冬菌源产生分生孢子，随雨水或气流传播至健康玉米叶片上，在适宜的温湿度条件下萌发侵入。如在感病品种上，侵入14天左右即可引起局部萎蔫，组织坏死，进而形成枯死病斑，病斑上又可以产生大量分生孢子，随气流传播造成多次侵染，造成病害爆发流行。因此玉米大斑病菌的侵染初期至病害的初发期是病害防治的最佳时期，而大斑病菌侵染初期难以从症状上与灰斑病、圆斑病及小斑病区分，且以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行。而玉米大斑病菌在形态特征上与玉米小斑病菌即玉蜀黍平脐蠕孢（Bipolarismaydis）极其相似，难以鉴定，因此迫切需要建立一种快速、灵敏的检测方法用于玉米大斑病的早期诊断，为病害的最佳防治时期提供技术支撑。

近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerasechainreaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internaltranscribedspacer,ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、大豆疫霉、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关玉米大斑病菌分子检测的研究尚未见报道。

发明内容

针对现有技术中对玉米大斑病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足玉米大斑病诊断的实际需要问题，提供了一种玉米大斑病菌分子检测引物及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种玉米大斑病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：

上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’；

下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’。

所述引物ESF和ESR对玉米大斑病菌特异性扩增出356bp的产物。

本发明还提供了一种玉米大斑病菌的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)从玉米叶片或叶鞘中提取DNA；

用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA；用于检测玉米叶片或叶鞘组织是否存在玉米大斑病菌时，采用NaOH快速裂解法提取玉米植株组织基因组DNA。

(2)以提取玉米叶片或叶鞘DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出356bp的产物，则判定所述的玉米叶片或叶鞘中存在玉米大斑病菌，否则所述的玉米叶片或叶鞘中不存在玉米大斑病菌。

本发明的有益效果在于：

（1）准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对玉米大斑病菌具有特异扩增作用的PCR引物。已经对不同地理来源的玉米大斑病菌、携带玉米大斑病菌的叶片、携带玉米大斑病菌的叶鞘和健康玉米叶片进行了检测验证，只有玉米大斑病菌和携带该病菌的组织中能特异性地扩增出一条356bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物用于检测玉米大斑病菌准确可靠；

（2）特异性强：本发明所设计的引物对玉米大斑病菌具有很强的特异性，能够用于区别玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌等玉米上常见病害的病原菌，从而能有效区分发生在玉米上症状特征相似的病害；

（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物与ITS基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR扩增后，对玉米大斑病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg；

（4）适用性广、实用性好：本发明的玉米大斑病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的玉米叶片或叶鞘进行检测，可实现玉米大斑病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。

（5）、操作简便快速：本发明只需进行DNA提取、PCR扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。

附图说明

图1为本发明引物对玉米大斑病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2、泳道3为不同地理来源的玉米大斑病菌，泳道4-11分别为：玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、花生褐斑病菌、阴性对照。

图2为本发明引物玉米大斑病菌的灵敏性检测扩增电泳图：图2-A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-12分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、阴性对照、阳性对照；图2-B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-13分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、阴性对照、阳性对照。

图3为本发明玉米叶片和叶鞘扩增电泳图，其中泳道M为2000bpDNAMarker，泳道2-11分别为自然发病的玉米叶片、自然发病的玉米叶鞘、人工接种发病的玉米叶片、人工接种发病玉米叶鞘、灭菌后的玉米叶片、健康玉米叶片、健康的玉米叶鞘、健康的玉米苞叶、阳性对照、阴性对照。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1分子检测引物设计及玉米大斑病菌特异分子检测方法的建立

1.玉米大斑病菌基因组DNA的提取：

采用CTAB法提取本实验室保存的6株玉米大斑病菌的基因组DNA，具体步骤如下：

(1)取0.1g菌丝粉于1.5mL离心管中，加入900μL2%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15min；

(2)取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000r/min离心10min；

(3)取上清液500μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000r/min离心10min；

(4)取上清液350μL，加入1/10体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60min，4℃条件下，8000r/min离心5min；

(5)弃去上清液，加入700μL体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000r/min离心10sec，晾干，加入50μLTE缓冲液，-20℃保存备用。

2.玉米大斑病菌ITS序列测定：

以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为引物对提取玉米大斑病菌的DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的引物TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送大连宝生物工程有限公司测序。

3.玉米大斑病菌特异分子检测引物的设计：

根据玉米大斑病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，用ClustalX软件将测序得到的6株玉米大斑病菌的ITS序列与GenBank中Exserohilum属不同种的ITS序列、玉米灰斑病菌ITS序列、玉米圆斑病菌ITS序列、玉米小斑病菌ITS序列进行同源性分析和差异位点比较，用PrimerPrimer5软件设计了对玉米大斑病菌具有特异性扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物ESF：5’-GCCGGCTGCCAATTGTTTTA-3’；

下游引物ESR：5’-CCCATGTCTTTTGCGCACTT-3’

4.玉米大斑病菌快速分子检测方法的建立：

(1)从玉米大斑病菌或玉米叶片或玉米叶鞘中提取DNA:

①用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA;

②用于玉米叶片或叶鞘中是否存在玉米大斑病菌时，采用NaOH快速裂解法提取玉米叶片或叶鞘的基因组DNA，具体步骤如下：

a.称取待检测的植物组织0.1g，加入0.5mol/LNaOH30μL，将组织充分磨碎成糊；

b.将糊状组织转入1.5mL离心管中，12000r/min离心6min，取上清液5μl；

c.上清液中加入495μL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0μL作为PCR模板进行扩增；

(2)以提取的玉米大斑病菌或玉米叶片或玉米叶鞘中的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出356bp的产物，则判定所述的玉米叶片或叶鞘存在玉米大斑病菌，否则所述的玉米叶片或叶鞘中不存在玉米大斑病菌。

实施例2玉米大斑病菌特异性扩增

1.采用CTAB法提取2株不同来源的玉米大斑病菌、玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、水稻稻瘟病菌及花生褐斑病菌的基因组DNA。

2.以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3.特异性扩增结果

如图1所示，2株玉米大斑病菌可以特异性扩增出356bp的条带，而玉米灰斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米小斑病菌、玉米南方锈病病菌、玉米纹枯病菌、水稻稻瘟病菌、花生褐斑病菌和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将玉米大斑病菌与其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于玉米大斑病菌的特异性扩增。

实施例3本发明引物对玉米大斑病菌的灵敏性检测

1.采用CTAB法提取玉米大斑病菌的基因组DNA；

2.将提取的玉米大斑病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；

3.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

4.以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增：

（1）第一轮PCR扩增：以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为外引物对配制的成系列浓度DNA进行第一轮PCR扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的引物TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；

（2）第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增的产物为模板，以ESF/ESR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的引物ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

5.检测结果

如图2所示，以本发明引物ESF/ESR为引物进行常规PCR时，在25μL反应体系中，10pg的玉米大斑病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg（图2-A）；而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物ESF/ESR为引物进行第二轮扩增时，在25μL反应体系中，10fg的玉米大斑病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10fg(图2-B)。

实施例4发病玉米叶片和叶鞘中玉米大斑病菌的检测

1.采用NaOH快速裂解法提取玉米叶片和叶鞘中基因组DNA。

2.以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL10×PCRbuffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTPMixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的ESF和ESR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3.检测结果

如图3所示，自然发病的玉米叶片、自然发病玉米叶鞘、人工接种发病的玉米叶片、人工接种发病玉米叶鞘、阳性对照中均可产生356bp左右的可视条带，而健康玉米叶片、健康的玉米叶鞘、健康的玉米苞叶、灭菌玉米叶片、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间玉米叶片和叶鞘大斑病菌的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种玉米大斑病菌分子检测引物及快速检测方法

<130>4

<160>4

<170>PatentInversion3.3

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<212>DNA

<213>人工序列

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gccggctgccaattgtttta20

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