一种快速建立北京油鸡慢羽系的方法及应用

摘要

本发明提供了新的用于快速建立北京油鸡慢羽系的方法。通过设计特异性的引物对，采用荧光定量PCR方法检测北京油鸡Junction区域和PRLR基因的拷贝数，实现了对北京油鸡公鸡羽速基因型的快速鉴定，进而快速建立油鸡慢羽系。本发明具有操作简便、经济实惠、可以对大规模样本检测的优点，适合北京油鸡公鸡羽速基因型的鉴定、快速构建北京油鸡慢羽系，实现北京油鸡雌雄自别配套。

说明书

技术领域

本发明涉及家禽育种领域，具体地说，涉及一种借助分子检测技术手段鉴 定公鸡羽速基因型，并快速培育北京油鸡慢羽系的方法以及在北京油鸡雌雄 自别配套生产中的应用。

背景技术

北京油鸡，又名“中华宫廷黄鸡”，是原产于京郊的一个非常优秀的地方 品种。北京油鸡的鸡肉和鸡蛋口感好，营养价值高，近些年非常收欢迎，推 广规模和数量逐年增加(张剑，2010)。

在北京油鸡养殖过程中，为了方便管理，增加群体一致性，需要将公鸡和 母鸡分开饲养，或者为了节约生产成本有的养殖者只饲养单一性别的鸡。因 此，雏鸡在刚刚出生时就需要进行雌雄鉴别。

家禽的性器官位于体内，因此雏鸡出生时，需要通过翻肛才能够判定公母。 但是翻肛鉴别对人员的技术能力要求很高，而且耗时费工，损耗较大，并且 对雏鸡造成应激，产生很大伤害，同时还可能引起疾病的传播。如果能借助 一些肉眼可见的外观特征很快区分公母，而不是通过性器官来区分，则能够 事半功倍。

目前，自别雌雄体系在许多家禽品种中都有很广泛的应用，有羽色、羽速 等不同的自别方法。北京油鸡羽色为单一的黄羽，羽色自别是无法实现的。 2011年，初芹等结合表型和基因型判定，证明羽速在北京油鸡群体中属于性 连锁性状，具备建立根据羽速实现北京油鸡自别雌雄配套系的遗传基础。

要建立自别雌雄配套系第一步工作就是要建立快羽纯系和慢羽纯系。由于 羽速表型为快羽的公母鸡，其基因型均是纯合快羽(公鸡为Z^kZ^k，母鸡为 Z^kW)；羽速表型为慢羽的母鸡，其基因型是纯合慢羽(ZK^W)；只有羽速表型 为慢羽的公鸡，有两种基因型：一种是纯合的慢羽(Z^KZ^K)，另一种是杂合的 慢羽(Z^KZ^k)。因此，根据表型就能够实现对快羽系的构建，选育慢羽纯系的 关键就是选出基因型纯合的慢羽公鸡。

早期的研究一般都是通过测交实验在一定置信度的条件下区分这两种基 因型的，在实际的品系育成中基本也是这么操作的，如固始鸡(宋素芳等， 2004)，贵妃鸡(杜炳旺等，2006)，琅琊鸡(穆阿丽等，2012)、安义瓦 灰鸡(谢明贵等，2013)、专利200910062895.0等等。测交试验就是慢羽公 鸡与多只快羽母鸡杂交，根据后代羽速类型是否出现快羽来判定慢羽公鸡的 基因型，需要投入大量的时间、精力和资金。

2008年，Martin等人发现慢羽K基因上存在一段长度为176,324bp的串 联重复序列。这段重复序列的两端分别是催乳素受体基因(PRLR)和编码精 子鞭毛蛋白2基因(SPEF2)的部分序列。也就是说相对于快羽k基因，慢 羽K基因包含2个拷贝的PRLR基因和SPEF2基因的部分序列(图1)。而 重复插入序列与正常序列之间的连接处(图1指示的Junction区域)序列只 在慢羽K基因中有。因此，我们只需要通过检测这些DNA序列的拷贝数， 就能准确判定鸡的基因型。

SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发 波长的染料，在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链 DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链 DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。 该方法无需合成特异性探针，无需担心探针保存不当导致降解等问题，而只 需合成普通引物即能完成检测，因此成本更低、具有更普遍的适用性。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中测交试验耗时长、成本高的缺点的问 题，提供一种快速鉴定北京油鸡公鸡羽速基因型的荧光定量PCR方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种建立北京油鸡慢羽系的方法，根据羽速表型来鉴定慢羽母鸡，以及 通过鉴定Junction区域和PRLR基因的拷贝数来检测公鸡羽速基因型的步骤。

优选的，所述Junction区域的核苷酸序列如SEQIDNO:11所示。

优选的，本发明所述的方法以待测油鸡公鸡基因组DNA为模板，通过 SYBRGreenI染料荧光定量PCR分析Junction区域和PRLR基因的拷贝数计 算ΔCt值，进而确定待检油鸡公鸡是否为慢羽纯合子。

优选的，本发明所述的荧光定量PCR使用的引物为：

用于扩增北京油鸡Junction区域的引物对Jun，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1和SEQIDNO:2所示；和，

用于扩增北京油鸡PRLR基因的引物对PRLR，其核苷酸序列分别如： SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。

优选的，本发明所述荧光定量PCR的反应体系是：10μLSYBRGreen Supermix(Bio-Rad)，20pmol/μL上、下游引物和10ng/μL基因组DNA各1μL， 用水补齐至20μL。

优选的，本发明所述荧光定量PCR的反应条件是：94℃3min预变性； 94℃15s，60℃30s退火延伸，共40个循环。

本发明提供了用于扩增北京油鸡Junction区域和PRLR基因的引物对， 所述引物对为引物对1和引物对2，其中，引物对1：用于扩增北京油鸡 Junction区域的引物对，其核苷酸序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2 所示；

引物对2：用于扩增北京油鸡PRLR基因的引物对，其核苷酸序列分别如： SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。

本发明提供了包含所述引物对的试剂盒，优选的，本发明提供的试剂盒 为荧光定量PCR检测试剂盒。

优选的，本发明所述的试剂盒还包括用于SYBRGreenI染料荧光定量 PCR的试剂。

本发明提供了一种鉴定北京油鸡慢羽型的荧光定量PCR方法，包括如 下步骤：

(1)提取待测公鸡的基因组DNA；

(2)以待测鸡只的基因组DNA为模板，用引物对和两条探针进行荧光 定量PCR扩增；所述引物对为引物对1和引物对2，其中，

引物对1：用于扩增北京油鸡Junction区域的引物对，其核苷酸序列分 别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；

引物对2：用于扩增北京油鸡PRLR基因的引物对，其核苷酸序列分别 如：SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；

(3)在选种时，通过计算ΔCt值分析Junction区域和PRLR基因的拷 贝数来选择留种的公鸡。

优选的，本发明所述荧光定量PCR方法采用的染料为SYBRGreenI。

进一步的，本发明将上述方法应用于北京油鸡公鸡羽速基因型检测，快 速鉴定公鸡羽速基因的基因型。

进一步的，本发明将上述引物对应用于北京油鸡公鸡基因型检测，快速 构建油鸡慢羽系。

进一步的，本发明将上述方法应用于北京油鸡雌雄自别配套生产中。

本发明通过设计特异性的引物对，采用荧光定量PCR方法检测目的序 列的拷贝数，解决了北京油鸡慢羽公鸡基因型的鉴定问题，以及慢羽系的快 速构建问题。本发明首次将SYBRGreenI染料应用于北京油鸡慢羽公鸡的荧 光定量PCR检测中，无需合成TaqMan探针，只需合成普通引物即可实现 对公鸡基因型的分型，实验设计更为简便，适用于任何一款定量PCR仪。

本发明具有操作简便、经济实惠、可以对大规模样本检测的优点，适合 北京油鸡公鸡基因型检测，快速构建油鸡慢羽系以及北京油鸡雌雄自别配套。

附图说明

图1：慢羽K基因与快羽k基因对比示意图

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修 改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常 规手段。

实施例1方法的建立

1.1引物的设计与筛选

根据快慢羽的序列不同，设计引物，共设计5对引物。对应不同的基因 型，不同的扩增片段其拷贝数不同，具体如表1。

表1不同引物名称及拷贝数

注：vim位于2号染色体上，为已知单拷贝基因

Jun引物对应的序列是慢羽基因插入重复序列与原序列连接部位的序列片段

首先对不同引物进行扩增效率观察。选择的荧光PCR反应程序为94℃ 3min预变性，94℃15s，60℃30s退火延伸，共40个循环。PCR反应体系 为20μL，包括10μlSYBRGreenSupermix(BIORAD)，上下游引物 (20pmol/μL)和基因组DNA(10ng/μL)各1μL。

选择相同的个体，分别将基因组DNA稀释10倍、100倍、1000倍、10000 倍，然后对不同引物分别扩增，比较不同引物对相同个体的扩增效率。然后， 将不同基因型个体稀释到相同DNA浓度，然后用相同的引物分别扩增，比 较引物在不同个体间扩增的稳定性，最终确定PRLR、Jun两对引物更适用于 构建慢羽公鸡基因型的荧光定量PCR检测方法。

1.2慢羽公鸡的基因型检测方法建立

选择17只公鸡，按照1:5比例，与慢羽母鸡交配，观测后代的快慢羽表 型，如果出现快羽型个体，则判定为杂合子基因型。其中由于6号公鸡于实 验中期死亡所以不予考虑。观测结果显示1、11、14、16、17号公鸡为纯和 的慢羽公鸡，而其他11只为杂合子基因型。

采集17只慢羽公鸡血样，翅下静脉采血，ACD(柠檬酸0.48g、柠檬酸 钠1.32g、葡萄糖1.47g，加蒸馏水至100mL)抗凝。

选用鸡抗凝血基因组DNA提取试剂盒DP318(天根生化技术有限公司， 北京)，提取基因组DNA，具体步骤如下：

1)取出样品，融化后，吸取20μL于2mL离心管中；

2)加入180μL缓冲液GS，20μL蛋白酶K，混匀；

3)加入200μL缓冲液GB，充分摇匀；

4)56℃烘箱中消化3小时以上(或过夜)，消化早期，每隔3-5min颠倒摇 匀一次，直至溶液变澄清透亮；

5)加入200μL无水乙醇，轻轻晃动混匀，转移到吸附柱中，12000rpm离 心30s，弃去收集管中的暗绿色废液；

6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃去收集管 中废液；

7)向吸附柱中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去废液；

8)加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃去废液；

9)12000rpm离心2min；

10)将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，开口凉干；

11)加入100μL洗脱缓冲液TB，静置2min；

12)12000rpm离心2min，弃吸附柱。基因组DNA存在于离心管中溶液 中；

13)使用NanoDrop2000色谱法检测DNA浓度，稀释到10ng/μL，4℃保存 备用或-20℃长期保存。

SYBRGreen染料实时荧光PCR，使用ΔCt法来分析其拷贝数的差异，各 公鸡实验结果如表2。

表2荧光定量PCR检测结果

注：a，6号公鸡死亡；b，15号公鸡为快羽。

DΔCt＝2.59-1.89＝0.7。如果ΔCt<1.89+0.7×35％＝2.135，则判定为纯合基因 型，如果ΔCt>2.59-0.7×35％＝2.345，则判定其为杂合子基因型，ΔCt介于 2.135-2.345之间的为不确定，不建议用作慢羽系的构建。如果Ct_Jun大于35， 则个体基因型为快羽型。

实施例2北京油快、慢羽系的建立

首先，雏鸡出生时，鉴别羽速，将快羽型和慢羽型分开。对于羽速类型不 确定的个体，即覆主翼羽长度比主翼羽长度相差2mm以内的雏鸡，直接给 予淘汰了。

由于快羽型个体的基因型和表型是一一对应的，利用分离到的快羽型公鸡 和快羽型母鸡交配，并对群体持续选育，即实现了快羽系的建立。

慢羽型母鸡的基因型和表型是一致的，但公鸡的基因型有两种，其中杂合 子不能稳定遗传。因此，培育慢羽系的关键就是公鸡基因型的鉴定。需要选 出基因型Z^KZ^K的慢羽公鸡留种，淘汰基因型为Z^KZ^k的公鸡。

对根据表型判定出的300只慢羽公鸡，在8周龄时采血，按照实施例1 的方法测定公鸡基因型。其中，Z^KZ^K基因型117只(占39％)，Z^KZ^k基因 型个体88(占29％)，基因型不确定个体95只(占32％)。结合体重、外 貌、精液品质等其他性能，从117只Z^KZ^K基因型公鸡种选择30只作为核心 群慢羽公鸡，用于下一代慢羽家系的纯繁。

用上述留种的30只慢羽纯合子基因型的公鸡，与300只慢羽表型母鸡， 按照公母比例1:10输精，15天收集一批种蛋入孵，共孵化2批。出雏时对 3415只雏鸡的羽速类型进行鉴别，全部为慢羽类型。表明用实施例1建立的 方法进行公鸡基因型检测，快速构建油鸡慢羽系是非常有效的。

实施例3北京油鸡雌雄自别配套应用

利用实施例2建立的慢羽系、快羽系群体，建立配套生产。随机选择快羽 公鸡30只，精液混合后，对300只母鸡输精。种蛋收集15天后入孵。

出雏时对1786只雏鸡，首先邀请资深鉴别员进行了翻肛鉴别，得到971 只公鸡和824只母鸡。然后对公鸡和母鸡的羽速类型进行核查。理论上而言， 快羽公鸡和慢羽母鸡交配，后代快羽是母鸡，慢羽是公鸡。羽速鉴定结果显 示，824只母鸡中有813只快羽和11只慢羽；971只公鸡中有918只慢羽和 53只快羽。

为了检验羽速自别的准确性，对母鸡中11只慢羽个体和公鸡中的53只快 羽个体进行剖检。结果显示，11只慢羽个体全部为公鸡，而53只快羽个体 中45只是母鸡，其余8只是公鸡。试验结果充分表明北京油鸡快慢羽品系配 套生产雏鸡能够准确的通过羽速来自别雌雄，准确性要高于翻肛鉴别。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局 限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种 变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。