一种Cronobacter sakazakii的类脂A结构突变株的构建及其应用

摘要

本发明公开了一种Cronobactersakazakii的类脂A突变株的构建及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过将Cronobacter？sakazakii菌株的ESA-02008基因片段进行敲除，使Cronobacter？sakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性降低了32倍、Cronobacter？sakazakii细胞毒性降低了27％、Cronobacter？sakazakii菌株在巨噬细胞中的繁殖水平显著降低，同时还得到了发生结构突变的类脂A。本发明的结构突变的类脂A的修饰完全缺失。

说明书

技术领域

本发明涉及一种Cronobactersakazakii的类脂A突变株的构建及其应用，属于基因工程 技术领域。

背景技术

类脂A可以被宿主细胞表面的Toll样受体4(TollLikeReceptor4，TLR-4)识别，继而 引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子。细胞因 子的种类和数量主要取决于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂， 非特异性的增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。

阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobactersakazakii)是一种自然界中广泛存在的食源性革兰氏阴 性致病菌，主要污染婴儿配方奶粉。它可以引起新生儿脑膜炎、败血病、菌血症及坏死性小 肠结膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革兰氏阴性菌的致病能力与其外膜类脂A的分子 结构密切相关，但关于阪崎克罗诺杆菌类脂A分子修饰及作用还有待研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供C.sakazakii的类脂A分子修饰相关的突变株。

本发明的第一个目的是提供一种Cronobactersakazakii的基因工程菌，所述基因工程菌 缺失了ESA-02008基因片段。

在本发明的一种实施方式，所述ESA-02008基因片段的核苷酸序列是SEQIDNO:1的序 列。

在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌为无抗性C.sakazakiiBAA894△ESA-02008， 以CronobactersakazakiiBAA894为出发菌、缺失了核苷酸序列为SEQIDNO:1的ESA-02008 基因片段。

在本发明的一种实施方式，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的ESA-02008 敲除片段电转化入含pKD46质粒的C.sakazakiiBAA894，获得突变株C.sakazakiiBAA894 ΔESA-02008-loxPkan，再化转入pKD-Cre质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因； 去除pKD-Cre(参考文献：YaningHan,ConstructionofMonophosphorylLipidAProducing EscherichiacoliMutantsandComparisonofImmuno-StimulatoryActivitiesofTheir Lipopolysaccharides,MarineDrugs,2013,11,363-376)质粒后获得无抗性lipidA的基因结构突 变的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式，所述ESA-02008敲除片段的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。

在本发明的一种实施方式，所述位点特异性重组为Cre酶介导的loxP位点特异性重组， 最终42℃培养去除pKD-Cre质粒，获得无抗性类脂A的结构基因缺失的基因工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种降低Cronobactersakazakii对阳离子抗菌肽抗性和/或降 低Cronobactersakazakii细胞毒性和/或降低Cronobactersakazakii菌株在巨噬细胞中的繁殖 水平的方法，所述方法是敲除Cronobactersakazakii菌的ESA-02008基因片段。

本发明的第三个目的是提供所述基因工程菌在生产类脂A、制备疫苗或制备疫苗佐剂方 面的应用。

在本发明的一种实施方式，所述生产类脂A，是先发酵培养收集基因工程菌菌体，洗涤 后用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8，v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌0.5-1.5h， 2000rpm离心30min分相，收集细胞碎片，加入12.5mM醋酸钠(pH4.5)超声波振荡2-10min， 100℃裂解30min；冷却至室温后，加入氯仿和甲醇配成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/ 水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心30min，取下相移移到旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯 仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将lipidA洗出。

在本发明的一种实施方式，所述应用是对基因工程菌的类脂A进行提取，然后利用类脂 A制备疫苗或疫苗佐剂。

在本发明的一种实施方式，所述利用类脂A制备疫苗或疫苗佐剂，类脂A可以被宿主细 胞表面的Toll样受体4(TollLikeReceptor4，TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理 生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性细胞因子。细胞因子的种类和数量主要取决 于类脂A的结构，因此，某些特殊结构的类脂A可作为疫苗佐剂，非特异性的增强机体对抗 原的免疫应答反应，提高疫苗效率。铝佐剂是目前全球公认的广泛应用于人体的疫苗佐剂， 安全可靠，可显著增强体液免疫反应，但是对细胞免疫的效果不够理想。因此通过本发明的 类脂A的改造，来协助刺激免疫系统产生反应，增强疫苗的免疫力并减少疫苗的毒副作用

本发明的有益效果：

本发明通过将Cronobactersakazakii菌株的ESA-02008基因片段进行敲除，使 Cronobactersakazakii菌株对阳离子抗菌肽抗性降低了32倍、Cronobactersakazakii细胞毒性 降低了27％、Cronobactersakazakii菌株在巨噬细胞中的繁殖水平显著降低，同时还得到了发 生结构突变的类脂A。本发明的结构突变的类脂A的修饰完全缺失，可以多产生2500pg/mL 的细胞因子TNF-α，细胞因子比野生型菌生产的类脂A增加了1.6倍。

附图说明

图1.pH5.0与pH7.0条件下CronobactersakazakiiBAA894中ESA-02008的相对表达量；

图2.pH7.0和pH5.0环境中CronobactersakazakiiBAA894的类脂A的TLC分析；1:pH7.0 BAA894类脂A样品；2:pH5.0BAA894类脂A样品；

图3.pH7.0和pH5.0环境中CronobactersakazakiiBAA894的类脂A的ESI/MS分析；A:pH7.0 BAA894类脂A样品；B:pH5.0BAA894类脂A样品；

图4.CronobactersakazakiiBAA894ΔESA-02008在pH7.0和pH5.0类脂A样品ESI/MS分析；

图5.BAA894野生型及突变株对阳离子抗性肽抗性的MIC及抑菌圈；

图6.野生型突变株脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7产生TNF-α的分析；

图7.野生型和突变株侵染Caco-2细胞；

图8.C.sakazakiiBAA-894和C.sakazakiiBAA-894ΔESA-02008突变菌株的毒力。

具体实施方式

类脂A的的结构鉴定与分析：

薄层层析(TLC)检测：将样品点于Gel60TLC板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水 (40:25:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10％硫酸进行碳化， 置于加热板上显色。

ESI/MS分析：类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERSSYNAPTQ-TOF MassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小 于m/z2500。

C.sakazakii突变菌株在巨噬细胞内的存活能力：

THP-1细胞使用RPMI1640培养基+10％胎牛血清(含100U/mL青霉素，100μL/mL链霉 素，4500mg/L葡萄糖，2mmol/LL-谷氨酰胺)，37℃，5％CO2培养箱培养，800r/min离心5 min收集细胞，并用PBS缓冲液洗去胰酶；细胞计数后重悬在无抗的细胞培养基中，向24 孔组织培养板各个孔中加入500μL细胞(约1×10⁵个细胞)；在37℃，5％CO2培养箱中过夜 培养；过夜培养的菌液按1％的接种量转接，37℃，200r/min培养3h；取1mL菌液，5000r/min 离心5min收集菌体；将菌体重悬至PBS缓冲液，并测定OD₆₀₀值；用无抗的细胞培养基将 菌液稀释至菌体浓度大约为10⁷cfu/500μL；倒掉过夜培养细胞的培养基，添加菌液500μL至 24孔组织培养板中，37℃，5％CO2培养箱中静置培养45min，弃掉之前的培养基，加入含有 100μg/ml庆大霉素的新鲜培养基，培养45min。选取细菌刺激24h、48h、72h和96h四个时 间点取样；用PBS清洗细胞两次，然后加200μL0.25％含EDTA的胰酶消化细胞2min，加入 300μL的0.5％TritonX-100裂解细胞；将细胞裂解液稀释至合适的浓度，涂平板37℃培养过 夜并统计菌落数，每个样品三个平行。

实施例1：突变株C.sakazakiiBAA894△ESA-02008的构建

1、ESA-02008和ESA-03574基因敲除片段的获得

采用化学全合成或PCR分步扩增的方法获得ESA-02008基因敲除片段，其两端分别为 ESA-02008基因上下游同源臂、中间为带有LoxP位点的kan片段。ESA-02008基因敲除片段 的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。将ESA-02008基因敲除片段克隆到pBlueScriptIISK(+)， 获得重组质粒pBlueScriptIISK(+)-ESA-02008U-Lkan-ESA-02008D。以该质粒为模板，可以扩 增获得敲除片段ESA-02008U-Lkan-ESA-02008D。

2、敲除感受态的制备及电转化

接种带有Red重组辅助质粒pKD46(DatsenkoKA,WannerBL.One-Stepinactivationof chromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA,2000, 97(12):6640-6645)的CronobactersakazakiiBAA894于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体 培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mLLB液体培养基，30℃，200 rpm培养至OD₆₀₀＝0.2时加入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导重组酶的表达，继续培 养OD₆₀₀＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50mL离心管中，4℃、4000rpm离心10min 收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1mL10％甘油悬浮，每管80μL分装至 预冷的无菌EP管中。

将500-1000ngESA-02008敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击 5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，30℃培养，挑取转化子于 含30μg/mL卡那霉素及100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，PCR验证结果。

3、突变株抗性标记的去除

将PCR验证阳性的菌株接种含30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，42℃过夜培养， 将培养液划线30μg/mL卡那霉素的LB固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉 素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为 C.sakazakiiBAA894△ESA-02008::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pKD-Cre质粒， 42℃热激表达FLP酶，将阳性菌株于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加 入L-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/L)诱导Cre重组酶的表达，介导LoxP位点特异性重组， PCR验证挑选转化子。将PCR验证正确的菌株42℃热激后划线LB平板，挑取单菌落验证 其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为 C.sakazakiiBAA894△ESA-02008并保藏。

实施例2：野生型BAA894中ESA-02008基因在低pH条件下的转录

总RNA提取：利用SimplyPTotalRNAExtrectionKit(购自Bioflux公司)分别提取 BAA894在pH7.0和pH5.0条件下的总RNA。以去除DNA污染的RNA为模板，利用 RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit(购自ThermoScientific)合成cDNA。以16SrRNA 作为内参，每组三个平行，检测ESA-02008基因在低pH下的转录水平。结果如图1所示， 从图1能够看出pH5.0条件下BAA894中ESA-02008基因的相对表达量是pH7.0条件下的8 倍，即ESA-02008基因在低pH条件下的表达量增加，说明该基因受低pH调控。

实施例3：野生型C.sakazakiiBAA894在pH7.0和pH5.0条件下的类脂A结构分析

1、野生型C.sakazakiiBAA894类脂A结构在pH7.0和pH5.0条件下的提取及薄层层析 (TLC)分析。

lipidA的提取方法采用氯仿/甲醇/H₂O溶液混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始 OD₆₀₀＝0.02转接到400mLLB液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，4000rpm离心 30min收集菌体，ddH₂O洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8， v/v/v)90mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，使用一相体系洗涤细胞碎 片2-3次；加入27mL12.5mM的醋酸钠(PH4.5)溶液，超声震荡2min，100℃水浴30min 裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/ 水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇 溶液(4:1，v/v)将lipidA洗出。接着进行薄层层析(TLC)检测，将样品点于Gel60TLC 板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(25:15:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂， 用溶于乙醇的10％硫酸进行碳化，置于加热板上显色(结果如图2)。

TLC结果显示该方法提取C.sakazakiiBAA894类脂A在pH5.0条件下比pH7.0多了个点， 说明在低pH下发生了修饰。

2、类脂A结构的ESI/MS分析

类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERSSYNAPTQ-TOFMassSpectrometer 质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。BAA894 在pH7.0条件下的类脂A主峰值1796.3和1825.3；1716.3和1745.3为掉一个磷酸基团的峰 值。而在pH5.0条件下，峰值多了1840.3、1868.3、1919.3、1948.3，分别于对应的pH7.0 的类脂A峰值上多了123Da，即一个磷酸乙醇胺，ESA-02008基因(结果如图3)。

实施例4：突变菌株C.sakazakiiΔESA-02008的类脂A结构ESI/MS分析

类脂A的提取方法采用氯仿/甲醇/H₂O溶液混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始 OD₆₀₀＝0.02转接到200mLLB液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，4000rpm离心 30min收集菌体，ddH₂O洗涤菌体一次后用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8， v/v/v)76mL悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，使用一相体系洗涤细胞 碎片2-3次；加入27mL12.5mM的醋酸钠(pH4.5)溶液，超声震荡2min，100℃水浴30min 裂解糖链。冷至室温后加入30mL氯仿和30mL甲醇配成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/ 水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇 溶液(4:1，v/v)将lipidA洗出。类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在WATERSSYNAPT Q-TOFMassSpectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测 范围小于m/z2500。结果如图4所示，结果说明敲除ESA-02008基因的基因工程菌的类脂A， 类脂A上的修饰完全缺失。

实施例5：突变株对阳离子抗性肽的抗性。

采用微量肉汤稀释法分别测定C.sakazakiiBAA894野生型和突变株对粘菌素的MIC值。

粘菌素是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素。其环形多肽部分的氨基与细菌外膜 脂多糖的2价阳离子结合点产生静电相互作用，使外膜的完整性破坏，导致胞浆内的磷酸、 核苷等小分子外溢，引起细胞功能障碍直至死亡。

抗生素用LB液体培养基倍比稀释，使polymyxinB浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、 1.56、0.78、0.39、0.19μg/mL而colistin浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、 3.90625、1.8、0.9、0.45μg/mL加入96孔板中，留一排新型LB培养基作生长对照；另将等 体积OD₆₀₀＝0.01的稀释菌液加入96孔板中，盖上盖子，37℃静置培养12h，用酶标仪测定 菌液OD₆₀₀。将OD₆₀₀小于0.15的点对应的抗生素浓度定义为菌株对多粘菌素的MIC值。同 时，做这两种抗生素的抑菌圈实验，10ug的抗生素点涂到平板的滤纸片上，突变株对多粘菌 素的抗性均减弱。其中图5为抑菌圈的实验结果，有图5可知，由抑菌圈的大小反应对这两 种抗生素的抗性，抑菌圈越大，说明菌对抗生素的抗性越低，菌越容易被杀死。图中显示 ESA-02008突变株的抑菌圈比pH5.0条件下野生型菌株的抑菌圈要小，也就是其抗性减弱。

野生型和突变菌在不同pH下对阳离子抗性肽的MIC值结果如表1所示。结果表明 ESA-02008突变株对阳离子抗性肽的抗性降低。

表1野生型和突变菌在不同pH下对阳离子抗性肽的MIC值

实施例6：突变菌株脂多糖(LPS)毒性分析

1、突变菌株LPS的提取及纯化

LPS的提取采用热酚法。将过夜培养的菌液按初始OD₆₀₀＝0.02转接到800mLLB液体培 养基中，37℃培养12小时后8000rpm离心10min收集菌体，ddH₂O洗涤菌体一次后称量菌 体湿重，每3g湿菌体溶于10mLddH₂O中，68℃预热。加入等体积预热的90％苯酚，68℃剧 烈振荡1小时。低温冷却后，4℃，4000rpm离心20分钟，上清液用ddH₂O透析三天以去除 苯酚，真空冷冻干燥得到LPS粗品。粗品用适量ddH₂O重悬后，加入RNaseA(终浓度50μg/ml) 和DNaseI(终浓度100μg/ml)37℃处理2小时，再加入蛋白酶K(终浓度100μg/ml)37℃ 处理过夜。酶处理后的样品中加入5mL水饱和苯酚，混匀，4000rpm离心30分钟，上清液 用ddH₂O透析一天，真空冷冻干燥得到LPS。将LPS复溶到氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)，涡 旋振荡30秒，12000rpm离心10分钟，移除上清，沉淀复溶在水中，真空冷冻干燥得到LPS 纯品。

2、LPS刺激小鼠巨噬细胞白血病细胞RAW264.7后产生TNF-α的分析

RAW264.7接种于96孔板，每孔10⁵个细胞，37℃，5％CO₂培养12小时后，细胞贴壁， 换新鲜培养液，加入不同浓度LPS(终浓度分别为1、10、100、1000ng/ml)，刺激24小时后 取上清液，使用ELISA试剂盒(Duoset)检测TNF-α含量(图6)。RAW264.7细胞产生的TNF-α 含量随着LPS刺激浓度的增加而增加。

有图6可知，pH5.0BAA894产生的最少，因为低pH条件下类脂A上发生磷酸乙醇胺的 修饰，中和了表面负电荷，不容易被细胞识别。敲除ESA-02008基因的基因工程菌(即 BAA894ΔeptA)的类脂A，类脂A上的修饰完全缺失，在LPS浓度为10ng/ml-1000ng/ml时 产生细胞因子TNF-α比野生型菌生产的类脂A增加1.6倍。

因此，该基因的激活，可应用于后续疫苗佐剂的开发。

实施例7：Caco-2细胞的侵染实验

Caco-2细胞使用MEM培养基+10％胎牛血清(含100U/mL青霉素，100μL/mL链霉素， 4500mg/L葡萄糖，2mmol/LL-谷氨酰胺)，37℃，5％CO₂培养箱培养，800r/min离心5min 收集细胞，并用PBS缓冲液洗去胰酶；细胞计数后重悬在无抗的细胞培养基中，向24孔组 织培养板各个孔中加入500μL细胞(约1×10⁵个细胞)；在37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养； 过夜培养的菌液按1％的接种量转接，37℃，200r/min培养3h；取1mL菌液，5000r/min离心 5min收集菌体；将菌体重悬至PBS缓冲液，并测定OD₆₀₀值；用无抗的细胞培养基将菌液稀 释至菌体浓度大约为10⁷cfu/500μL；倒掉过夜培养细胞的培养基，添加菌液500μL至24孔组 织培养板中，37℃，5％CO₂培养箱中静置培养3h，弃掉之前的培养基，加入含有100μɡ/ml 庆大霉素的新鲜培养基，培养1h。用PBS清洗细胞两次，然后加200μL0.25％含EDTA的胰 酶消化细胞2min，加入300μL的0.5％TritonX-100裂解细胞；将细胞裂解液稀释至合适的浓 度，涂平板37℃培养过夜并统计菌落数，每个样品三个平行。

Caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，是被 广泛应用于肠道吸收的细胞模型。2002年被FDA批准认定为动物实验代替方法。C.sakazakii 属于肠道菌，可以穿透血脑屏障引起脑膜炎等疾病。实验结果如图7所示，结果显示ESA-02008 突变株的入侵Caco-2细胞的能力减弱，其毒性减弱。

实施例8：C.sakazakii突变菌株的在巨噬细胞内的存活能力。

C.sakazakii是一种食源性致病菌，具有在巨噬细胞中生存繁殖的能力。细菌在巨噬细胞 中的生存，与其自身毒性有必要的关联。细菌毒性越小在巨噬细胞中繁殖能力越弱；当细菌 表现出强度性时，细菌自身在巨噬细胞中的生存和繁殖能力也会有所提高。本发明测定了不 同pH条件下C.sakazakiiBAA-894、C.sakazakiiBAA-894ΔESA-02008突变菌株在单核巨噬细 胞THP-1细胞中的生存能力，从而反应该基因对于细菌自身毒性的影响。

结果显示(图8)，C.sakazakiiBAA-894野生型和回补株在巨噬细胞中繁殖速率较快，C. sakazakiiBAA-894ΔESA-02008(即BAA894ΔeptA)突变菌株均比其相应野生型菌株在巨噬细 胞中的繁殖水平有明显的降低。在24h和48h时间段，细菌繁殖速度最快，72h开始降低， 96h更低。可见，C.sakazakiiBAA894在巨噬细胞内存活多于96h，而且ESA-02008基因缺失， 使得该菌的类脂A结构上没有了磷酸乙醇胺的修饰，更容易被细胞杀死，该基因与菌株的毒 力有一定的作用。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。