基于原位实时光谱在线监测蛋白质酶解过程的装置和方法

摘要

本发明公开了基于原位实时光谱在线监测蛋白质酶解过程的装置和方法，属于蛋白质酶解过程在线监测领域。对不同浓度的谷朊蛋白悬浮液进行酶解，酶解过程定时取样，化学方法监测酶解过程中的重要参数，水解度，酶解液的多肽浓度，酶解液的ACE抑制率；对所收集的酶解液快速的采集其原位实时光谱；将所采集的光谱进行预处理；采用联合区间最小二乘法进行水解度，酶解液的多肽浓度，酶解液的ACE抑制率的最佳光谱区间的筛选；采用联合区间最小二乘法建立校正模型和预测模型；利用上述预测模型对酶解过程进行原位实时监测和反应终点的判断。利用预测模型对底物浓度为10g/L的谷朊蛋白悬浮液的酶解过程进行监测，预测值和实测值吻合度较高。

说明书

技术领域：

本发明涉及蛋白质酶解过程在线监测领域，特指一种基于原位实时近红外光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程的一种技术。

背景技术：

小麦谷朊蛋白是淀粉加工的副产物，蛋白含量高达85％，富含疏水性氨基酸，是一种非常有潜力的酶解法制备降血压肽的原料。在酶解法制备降血压肽过程中，蛋白的水解度DH(Degreeofhydrolysis)、水解产物中多肽的浓度和表征水解产物降血压活性的ACE抑制率(Theinhibitiononangiotensinconverting-Ienzymeinhibitory)是非常关键三个指标，是判断酶解反应终点的重要依据。传统的化学方法测定DH时，需要引入NaOH，在一定程度上影响最终多肽产品的品质。而传统离线测定水解液的多肽浓度和ACE抑制活性时需要经过从反应器中取样，灭酶，离心等繁琐程序，工作量大且由于离开了反应部位而不能得到准确的结果。因此需要一种快速的，连续的方法在酶解反应器中原位的监测酶解反应中的重要参数，用以判断酶解反应终点。

目前，一般在线测量与控制系统仅限于温度、压力和流量等，而对过程中化学成分和许多物性变量仍不能进行有效的连续测量，因此，在线光谱技术应运而生，它是以现场状况下基于分子水平基础上的微观物理量和微观化学量的光谱传感技术，依托于微小型光纤光谱仪的使用，在化工、制药、轻工和高分子材料等工业部门的过程监测中发挥着重要的作用。目前这种微小型便携式近红外光谱仪结合光纤探头由于其成本低，速度快，无污染，便于实时、在线分析和控制等优点。近几年来，光谱监测手段广泛应用于食品加工过程中的过程监控和品质测定。如食品发酵过程中菌群结构的在线监测(公开号：CN103616383A)，基于水平ATR的中红外光谱快速测定农产品含油率的方法(公开号：CN201210124558)，一种利用可见-近红外漫反射光谱技术检测茶鲜叶氮含量的方法(公开号：CN101382488A)。但是，目前这些方法还不能顺利的应用于水溶液的反应体系。

本发明旨在利用在线光谱技术建立一种适用于在酶解反应器中原位实时监测酶解反应的方法，用以快速的判断酶解反应的终点。

发明内容：

本发明的目的是采用原位实时近红外光谱仪结合光纤可浸入式探头，建立一种在线监测谷朊蛋白酶解过程的方法。旨在实现蛋白酶解过程的快速，原位，实时监测。本发明一种基于原位实时光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程的方法，按照下述步骤进行：

(1)对谷朊蛋白进行酶解，酶解过程定时取样，化学方法监测其酶解过程。

(2)对所收集的酶解液快速的采集其原位实时近红外光谱；

(3)光谱预处理；

(4)最佳光谱区间的筛选；

(5)模型建立和预测；

(6)利用上述预测模型对酶解过程进行原位实时预测

其中步骤(1)所述的谷朊蛋白酶解为底物浓度为20-50g/L谷朊蛋白悬浮液，加酶量6460U/g，酶解温度50℃、酶解时间0-80min。酶解过程指标为谷朊蛋白水解度、酶解液中的多肽浓度和酶解液的ACE抑制率。

其中步骤(2)所述原位实时光谱采用微小型近红外光纤光谱仪采集近红外光谱，光谱仪探头为可浸入式透射探头。

其中步骤(3)所述的光谱预处理为一阶导数、二阶导数、标准化归一化处理(SNV)、多元散射校正(MSC)处理方法进行预处理。

其中步骤(4)所述的最佳光谱区间的选择是指采用联合区间最小二乘回归方法(Si-PLS)对谷朊蛋白的DH，水解液的多肽浓度和ACE抑制率的最佳光谱区间进行选择。

其中步骤(5)所述的模型建立和预测是指将样品集分为校正集(59个)，预测集(29个)采用联合区间最小二乘回归方法(Si-PLS)建立校正和预测模型。

其中步骤(6)所述的，利用上述预测模型对酶解过程进行原位实时监测是指，对建模外的一个酶解过程进行原位光谱的监测，预测酶解过程中的DH，酶解液的多肽浓度及ACE抑制率，比较预测值和实测值，计算残差。

本发明的有益效果是：

利用基于原位实时光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程的方法，能够在酶解反应器中原位实时的监测蛋白酶解反应过程中的重要指标(DH、酶解液多肽浓度、ACE抑制率)。以谷朊蛋白为样本，采用原位实时光谱反应系统，利用Matlab2009b和联合区间最小二乘法(Si－PLS)建立模型，以相关系数和相对误差作为衡量指标，建立了谷朊蛋白DH，酶解液多肽浓度，ACE抑制率的回归模型。DH预测模型的相关系数R为0.9570，残差为1.73％；多肽浓度的相关系数R为0.9840，残差为0.79mg/mL；ACE抑制率的相关系数R为0.9536，残差为5.12％；利用预测模型对底物浓度为10g/L的谷朊蛋白悬浮液的酶解过程进行监测，预测值和实测值吻合度较高。

附图说明：

图1为本发明原位实时光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程定量模型分析流程图；

图2为本发明中使用的原位实时光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程装置；其中1为酶解反应池，2为谷朊蛋白悬浮液，3为温度计，4为搅拌装置，5为浸入式透射光线探头，6为卤钨灯光源，7为微小型近红外光谱仪，8为信号采集和控制系统。

具体实施方式：

图1为本发明原位实时光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程定量模型分析流程图；

本发明中以水解度(DH)、酶解液中的多肽浓度、酶解液的ACE抑制率的变化来表示整个酶解反应过程的变化。

DH的测定采用pH-stat法；酶解液多肽浓度的测定采用福琳酚法，酶解产物ACE抑制率的测定按照文献“Jiaetal..TheuseofultrasoundforenzymaticpreparationofACE-inhibitorypeptidesfromwheatgermprotein.FoodChem.119,336(2010)”进行。

具体的测定过程如下：

(1)用蒸馏水分别配制底物浓度20、30、40、50g/L的谷朊蛋白悬浮液1500mL按照1.3.2中所述的方法进行酶解，酶解时间80分钟，前20分钟每间隔2分钟取一次样品，后60分钟每间隔5分钟取一次样品，每次取样量为1mL，取样后迅速用沸水浴灭酶10min，冷却后10000g离心10min，收集上清液储存于4℃下待测。取样的同时，在反应池中进行原位实时光谱的采集。共计88个样品。

(2)谷朊蛋白DH，多肽浓度，ACE抑制率的离线测定：多肽浓度的测定方法为将上述样品分别稀释50倍，等比例体积添加15％的三氯乙酸，在30℃的水浴中反应30min，5000g离心10min以去除大分子蛋白，收集上清液按照福林酚法测定多肽浓度；DH的测定方法参考pH-state法；酶解产物中ACE抑制率的测定方法参照Jiaetal.的液相色谱法。

图2为本发明中使用的原位实时光谱在线监测谷朊蛋白酶解过程装置。1为酶解反应池，2为谷朊蛋白悬浮液，3为温度计，4为搅拌装置，5为浸入式透射光线探头，6为卤钨灯光源，7为微小型近红外光谱仪，8为信号采集和控制系统。整个系统工作时，在酶解反应池1中进行谷朊蛋白悬浮液的酶解，开启搅拌装置4，将浸入式透射光线探头5伸入谷朊蛋白悬浮液2中并固定，由卤钨灯光源6发出光源传导到浸入式透射光线探头5在酶解反应池中采集样品光谱反馈到微小型近红外光谱仪7中并由信号采集和控制系统8进行采集和存储。

(3)谷朊蛋白酶解过程中原位实时光谱的采集：使用海洋公司的NIRQUEST256-2.5型近红外微型光谱仪(美国海洋光学)结合TP300透射浸入式光纤探头采集酶解过程中酶解液的近红外光谱，采用对近红外光灵敏度最高的铟砷化镓(InGaAs)检测器，光谱范围800-2500nm。具体光谱采集条件为：以蒸馏水为背景，透射方式，2mm的光程采集酶解过程中酶解液的近红外光谱图，扫描次数为16次，分辨率9.5nm，信噪比为10000:1，在800-2500nm的近红外光谱区域内共含256个变量。每个样品连续采集3次光谱，取其平均值作为该样本的原始光谱。

(4)谷朊蛋白酶解过程中原位实时光谱的预处理：用Matlab2009b分析软件，分别对光谱进行SNV,MSC,1阶导数,2阶导数预处理，以最小二乘法PLS建模，获取最优的光谱预处理方法。最终SNV预处理方法的建模结果优于其他预处理方法。详情见表1.

表1不同预处理光谱的监测指标模型的最佳结果

(5)校正模型的建立：将88个样品的光谱用SNV预处理方法进行预处理，分成校正集(59个)和预测集(29)两个部分。采用的化学计量学算法为联合区间最小二乘回归(Si-PLS)，经留一法进行交叉验证，分别针对谷朊蛋白的DH，酶解液的多肽浓度以及ACE抑制率筛选出最佳的光谱区间，建立其校正模型和预测模型。结果显示：谷朊蛋白酶解过程中的DH，酶解液的多肽浓度及ACE抑制率的Si-PLS模型具有很好的预测性能，详情见表2。

表2酶解过程中监测指标光谱区间的选择和建模结果

(6)酶解过程的预测：用蒸馏水配制底物浓度为10g/L的谷朊蛋白悬浮液1500mL按照(1)中所述的方法进行酶解，并且采集光谱。将采集的光谱带入(5)中所建立的预测模型中，对谷朊蛋白酶解反应过程中的DH、酶解液的多肽浓度和ACE抑制率进行预测，再将预测值与实际值进行比较。详情见表3。

表3酶解过程预测结果

表3显示，利用Matlab2009b和联合区间最小二乘法(Si－PLS)建立模型，以相关系数和相对误差作为衡量指标，建立了谷朊蛋白DH，酶解液多肽浓度，ACE抑制率的回归模型。DH预测模型的相关系数R为0.9570，残差为1.73％；多肽浓度的相关系数R为0.9840，残差为0.79mg/mL；ACE抑制率的相关系数R为0.9536，残差为5.12％；利用预测模型对底物浓度为10g/L的谷朊蛋白悬浮液的酶解过程进行监测，预测值和实测值吻合度较高。利用光谱信息代入模型得出的预测值和实际测量值有较高的吻合度，(5)中所建立的Si-PLS预测模型可以很好的预测谷朊蛋白的酶解过程，用于在线实时监测谷朊蛋白的酶解过程。