一种液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法及含量测定方法

摘要

本发明提供了一种液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法，包括：a、取25克液态乳，加入碱性蛋白酶0.03-0.1U和中性蛋白酶0.01-0.05U，混合后于40-60℃水浴加热2-4小时，得到水解液；b、混匀后于5000-6000转/分钟离心15-20分钟，去掉上清液，保留沉淀物及上层脂肪；c、向沉淀物和上层脂肪中加入去离子水15-30mL，混匀后于5000-6000转/分钟离心15-20分钟，去掉上清液及上层脂肪，保留沉淀；d、将沉淀用水清洗一至两次，得到提取物。该提取方法有效降低提取过程中β-葡聚糖的损失；去除了干扰测定的乳糖。本发明还提供了使用该提取方法的液态乳中酵母β-葡聚糖的测定方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品中酵母β-葡聚糖的提取方法及含量测定方法，尤其适用于液态乳中酵母β-葡聚糖的提取和测定。

背景技术

酵母β-葡聚糖是以酿酒酵母为原料，经提取、酸碱处理、喷雾干燥等步骤生产而成，分子量为2万至400万道尔顿，分子式为(C₆H₁₂O₆)_n，其中n=125-25000。大量研究证明，酵母β-葡聚糖具有增强免疫、抗辐射与降血脂功能，这使得酵母β-葡聚糖在食品行业有了更为广泛的应用前景。

目前，酵母β-葡聚糖的测定方法多采用苯酚-硫酸法，但该法精密度较差，并且不适合测定液态乳制品中的酵母β-葡聚糖。液态乳制品的成分比较复杂，且含有大量蛋白质，直接测定的结果准确性较差并可对仪器造成不良影响。较为理想的方案是先提取液态乳中的酵母β-葡聚糖，再对酵母β-葡聚糖的含量进行测定。现有的提取方法是用蛋白沉淀剂（例如乙酸锌和亚铁氰化钾）将液态乳中的蛋白质沉淀，取上清液进行测定；该方法的缺点是：易造成β-葡聚糖的回收率低；此外，盐析沉淀蛋白方法中，乳糖和其他多糖添加剂对离子色谱测定有干扰，影响β-葡聚糖的测定。

发明内容

本发明的目的是提供一种液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法，可降低提取过程中酵母β-葡聚糖的损失。

本发明的另一个目的是提供一种液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法，其回收率和精密度较高。

本发明提供了一种液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法，包括：a、取25克液态乳，加入碱性蛋白酶0.03至0.1U和中性蛋白酶0.01至0.05U，充分振荡混合后于40至60℃水浴加热2至4小时，得到水解液；b、将水解液振荡混合均匀后，于5000至6000转/分钟离心15至20分钟，去掉上清液，保留沉淀物及上层脂肪；c、向步骤b得到的沉淀物和上层脂肪中加入60至100℃的去离子水15至30mL，振荡混合均匀后，于5000至6000转/分钟离心15至20分钟，去掉上清液及上层脂肪，保留沉淀；以及d、将步骤c中得到的沉淀用水清洗一至两次，得到提取物；用水清洗的方法为：加入60至100℃的去离子水15至30mL，振荡混合均匀后，于5000至6000转/分钟离心15至20分钟，去掉上清液，保留沉淀。

在液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法的一种示意性实施方式中，还包括将步骤d得到的提取物冷冻干燥。

本发明还提供了一种液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法，包括先通过上述的液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法，提取待测液态乳中的酵母β-葡聚糖，再测定提取产物中酵母β-葡聚糖的含量。

在液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法的一种示意性实施方式中，测定方法包括：通过上述的提取方法，提取待测液态乳中的酵母β-葡聚糖；将提取后得到的产物用溶壁酶、1，6-葡聚糖酶、外切-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶水解，使酵母β-葡聚糖全部水解成葡萄糖，得到待测液；以及测定待测液中葡萄糖的含量，并计算待测液态乳中酵母β-葡聚糖的含量。

在液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法的一种示意性实施方式中，测定待测液中葡萄糖的含量的方法为GOPOD法。

在液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法的一种示意性实施方式中，GOPOD法的步骤包括：向待测液中加入3mLGOPOD溶液，40℃水浴中保持20分钟；最后冷却至室温并在510nm下测定吸光度值。

在液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法的一种示意性实施方式中，测定待测液中葡萄糖的含量的方法为高效液相色谱法。

在液态乳中酵母β-葡聚糖的含量测定方法的一种示意性实施方式中，高效液相色谱法的条件为：色谱柱：DionexCarboPacPA104×250mm，带CarboPacPA104×50mm保护柱；流动相：A为超纯水，电阻率≥18.2MΩ；B为0.25mol/L氢氧化钠溶液；C为1mol/L乙酸钠溶液；检测器：安培检测器；Au工作电极；Ag/AgCl参比电极；检测池温度30℃；糖采用积分安培模式检测，波形选择碳水化合物标准四电位；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL；

淋洗梯度见下表：

时间，min流速，mL/minOH 浓度，mmol/L乙酸钠浓度，mol/L梯度曲线0.001.0150线性16.001.0150线性16.101.01000.6线性21.001.01000.6线性21.101.02000线性23.001.02000线性23.101.0150线性30.001.0150线性

安培检测器检测糖波形参数：

时间，s电压，V集成0.0000.100off0.2000.100on0.4000.100off0.410-2.000off0.420-2.000off0.4300.600off0.440-0.100off0.500-0.100off， LastStep on

本发明提供的液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法，采用蛋白酶水解去除液态乳中的蛋白质，有效降低了酵母β-葡聚糖在提取过程中的损失；并且在提取过程中去除了对测定有干扰的乳糖。使用该提取方法对液态乳中酵母β-葡聚糖进行测定，测定回收率和精密度较高。

具体实施方式

为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明本发明的具体实施方式。

本发明中“U”，即活力单位，在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位。

提取例1：液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法。

a、取25克液态乳，加入碱性蛋白酶0.04U和中性蛋白酶0.03U，充分振荡混合后于40℃水浴加热2小时，得到水解液；

b、将水解液振荡混合均匀后，于5000转/分钟离心15分钟，去掉上清液，保留沉淀物及上层脂肪；

c、向步骤b得到的沉淀物和上层脂肪中加入60℃的去离子水15mL，振荡混合均匀后，于5000转/分钟离心15分钟，去掉上清液及上层脂肪，保留沉淀；

d、将步骤c中得到的沉淀用水清洗一至两次，得到提取物；用水清洗的方法为：加入60℃的去离子水15mL，振荡混合均匀后，于5000转/分钟离心15分钟，去掉上清液，保留沉淀；

e、将步骤d得到的提取物冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-47℃，得到干燥后提取物。

提取例2：液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法。

a、取25克液态乳，加入碱性蛋白酶0.03U和中性蛋白酶0.01U，充分振荡混合后于55℃水浴加热2.5小时，得到水解液；

b、将水解液振荡混合均匀后，于5500转/分钟离心17分钟，去掉上清液，保留沉淀物及上层脂肪；

c、向步骤b得到的沉淀物和上层脂肪中加入80℃的去离子水20mL，振荡混合均匀后，于5500转/分钟离心17分钟，去掉上清液及上层脂肪，保留沉淀；

d、将步骤c中得到的沉淀用水清洗一至两次，得到提取物；用水清洗的方法为：加入80℃的去离子水20mL，振荡混合均匀后，于5500转/分钟离心17分钟，去掉上清液，保留沉淀；

e、将步骤d得到的提取物冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-47℃，得到干燥后提取物。

提取例3：液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法。

a、取25克液态乳，加入碱性蛋白酶0.1U和中性蛋白酶0.05U，充分振荡混合后于60℃水浴加热4小时，得到水解液；

b、将水解液振荡混合均匀后，于6000转/分钟离心20分钟，去掉上清液，保留沉淀物及上层脂肪；

c、向步骤b得到的沉淀物和上层脂肪中加入100℃的去离子水30mL，振荡混合均匀后，于6000转/分钟离心20分钟，去掉上清液及上层脂肪，保留沉淀；

d、将步骤c中得到的沉淀用水清洗一至两次，得到提取物；用水清洗的方法为：加入100℃的去离子水30mL，振荡混合均匀后，于6000转/分钟离心20分钟，去掉上清液，保留沉淀；

e、将步骤d得到的提取物冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-47℃，得到干燥后提取物。

提取例4：液态乳中酵母β-葡聚糖的提取方法。

a、取25克液态乳，加入碱性蛋白酶0.048U和中性蛋白酶0.016U，充分振荡混合后于55℃水浴加热3小时，得到水解液；

b、将水解液振荡混合均匀后，于6000转/分钟离心20分钟，去掉上清液，保留沉淀物及上层脂肪；

c、向步骤b得到的沉淀物和上层脂肪中加入80℃的去离子水20mL，振荡混合均匀后，于6000转/分钟离心20分钟，去掉上清液及上层脂肪，保留沉淀；

d、将步骤c中得到的沉淀用水清洗一至两次，得到提取物；用水清洗的方法为：加入80℃的去离子水20mL，振荡混合均匀后，于6000转/分钟离心20分钟，去掉上清液，保留沉淀；

e、将步骤d得到的提取物冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-47℃，得到干燥后提取物。

上述提取例中，碱性蛋白酶购自Sigma，货号P4860-50mL，酶活2.4U/g；中性蛋白酶购自Sigma，货号P1236-50mL，酶活0.8U/g。

检测例1：GOPOD法检测。

一、溶液配制。

缓冲液A（乙酸钠缓冲液，pH5，200mM）：取11.6mL冰醋酸加入约900mL水中，边加边搅拌。用氢氧化钠（4M）调整pH至5，然后转移至1L容量瓶中，定容。

缓冲液B（乙酸钠缓冲液，pH3.8，1.2M）：取69.6mL冰醋酸加入约800mL水中，边加边搅拌，用氢氧化钠（4M）调整pH至3.8，然后转移至1L容量瓶中，定容。

10×TES缓冲液（10×（羧甲基）甲胺（TRIS）/EDTA/盐）：取12.12gTRIS，11.69g氯化钠，以及4.16g依地酸四钠二水盐（EDTAtetrasodiumdihydratesalt），溶解于约900ml纯水中，边溶解边搅拌。用高浓度HCl或4M的氢氧化钠调至pH至7。将溶液移至1L容量瓶中，用水定容。

溶壁酶溶液（10U/μL于1×TES缓冲液）：浓度为10U/μL。按生产厂说明，取定量溶壁酶于10%10×TES缓冲液中。注意：未使用的溶液可以在-15°的条件下，保存一年。每次用溶细胞酶的量不一样，溶细胞酶的浓度需要重新调整。其中，溶壁酶购自Arthrobacterluteus，SigmaL4025；也可使用相同品质的其他产品。

1，6-葡聚糖酶溶液:溶解冻干的1，6-葡聚糖酶于缓冲液A中，终浓度为1U/300μL。注意：固体不易充分溶解，所以此溶液需要处理成均匀的悬浮液。溶液在NMT-15°下至少保持稳定60天。其中，1，6-葡聚糖酶购自Pustulanase，Cel136，Prokazyme，或者相同品质的产品。

β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶混合溶液：取2000U的外切-β-葡聚糖酶和400U的β-葡萄糖苷酶，用缓冲液A定容到100mL，通过至少十次的颠倒混合。注意：配制需在冰上进行，并且在当日使用。剩余的β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶混合溶液可以再次冷冻在NMT-15°，冻融仅限一次，两年有效期。其中，外切-β-葡聚糖酶购自E-EXBGL200U/mL，200U/bottle，Megazyme，或者相同品质的产品；β-葡萄糖苷酶购自Megazyme，200U/bottle，或者相同品质的产品。

葡糖氧化酶/过氧化物酶缓冲液：在1升的容量瓶中加入45.287g无水磷酸氢二钾，30.382g对羟基苯甲酸和4g叠氮化钠，小心的加入800mL的水，用搅棒并微加热来混匀，直到完全溶解；把溶液倒入一个大烧杯，用2M的KOH溶液调至pH为7.4；再把溶液再倒回1升的容量瓶用水定容，颠倒混合至少6次。注意：缓冲液储存在棕色瓶子里在4°保质期3年。葡糖氧化酶/过氧化物酶缓冲液也可直接使用K-YBGL试剂盒的Bottle#3(Megazyme)或者GOPOD试剂盒的Bottle#1（Megazyme）。

葡聚糖氧化酶/过氧化物酶试剂（GOPOD溶液）：将50mL的葡糖氧化酶/过氧化物酶缓冲用水定容到1L，再加入葡萄糖测定试剂，混合溶解。注意：试剂储存在棕色瓶子里，并标明，在温度在2℃与8℃之间可以保存3个月，或者在NMT-17℃温度下保存1年，最好避免在室温条件。葡萄糖测定试剂为K-YBGL试剂盒的Bottle#4或者GOPOD试剂盒的Bottle#2（Megazyme），或者相同品质的产品，用量参照试剂产品说明。

葡萄糖梯度溶液：0mg/ml,0.05mg/ml,0.125mg/ml,0.25mg/ml,0.5mg/ml的葡萄糖溶液；溶剂是水。

二、检测步骤。

1、样品酶解：

1）、取上述提取例得到的干燥后提取物至离心管中，加入2M的0℃的KOH溶液0.4mL，漩涡混匀后置于冰浴20min，得到半透明均一的分散溶液；同时设置空白对照样（即干燥后提取物为空，其余同步操作）；

2）、向分散溶液中加入1.6ml缓冲液B，再加入600μl溶壁酶溶液（Lyticase），轻微摇晃混匀，切不可剧烈摇晃或振荡，避免影响酶活；混匀后放置在50℃水浴中持续12-18小时，同时进行涡旋摇动，样品加盖以防蒸发，完成后冷却至室温，得到中间物A；

3）、将中间物A于5000rpm下离心10分钟，取130μl上清液至新试管中，并向新试管中加入25μL的2MKOH，混匀；再加入300μL1，6-葡聚糖酶溶液并轻微摇晃振动，然后放置80℃水浴中保持15min，完成后冷却至室温，得到中间物B；

4）、向中间物B中加入390μLβ-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶混合溶液，40℃水浴保温1小时后，取出冷却至室温，得到中间物C；

5）、将中间物C离心1.5min，转速为5000rpm，取上清液50μL，加入50μL去离子水稀释，得到待测液。

2、葡萄糖含量测定：

向上述得到的待测液和葡萄糖梯度溶液中分别加入3mLGOPOD溶液，40℃水浴中保持20min；最后冷却至室温并在510nm下测定吸光值，测定采用分光光度计，其中紫外吸收波长为510nm,检测器为SuperEmulsionTSM-09，购自太阳化学株式会社。根据葡萄糖梯度溶液对应的吸光值绘制标准曲线，并根据标准曲线斜率计算出待测液中葡萄糖的含量，具体计算公式如下：

C=(ABSX-ABSS)/slop；

其中：

ABSX：待测液对应的吸光值；

ABSS：空白对照样对应的吸光值；

slop：标准曲线斜率；

C:待测液中葡萄糖的含量，mg/mL。

3、计算待测液态乳中酵母β-葡聚糖的含量：

X=100×C/｛[（WT_s/F1）×(F2/F3)]/2｝；

其中：

X：待测液态乳中酵母β-葡聚糖的含量，mg/100g；

C:待测液中葡萄糖的含量，mg/mL；

WT_s：待测液态乳的质量，mg；

F1：中间物A的体积，2.6mL；

F2：步骤3）中，向新试管中移取上清液的体积，0.130mL；

F3：中间物C的体积，0.845mL。

检测例2：高效液相色谱法检测。

一、高效液相色谱条件：

色谱柱：DionexCarboPacPA104×250mm，带CarboPacPA104×50mm保护柱；

流动相：A为超纯水，电阻率≥18.2MΩ；B为0.25mol/L氢氧化钠溶液；C为1mol/L乙酸钠溶液；

检测器：安培检测器；Au工作电极；Ag/AgCl参比电极；检测池温度30℃；糖采用积分安培模式检测，波形选择碳水化合物标准四电位；

流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL；

淋洗梯度见下表：

时间，min流速，mL/minOH 浓度，mmol/L乙酸钠浓度，mol/L梯度曲线0.001.0150线性16.001.0150线性16.101.01000.6线性21.001.01000.6线性21.101.02000线性23.001.02000线性23.101.0150线性30.001.0150线性

安培检测器检测糖波形参数：

时间(s)电压(V)集成0.0000.100off0.2000.100on0.4000.100off0.410-2.000off0.420-2.000off0.4300.600off0.440-0.100off0.500-0.100off， LastStep on

二、检测步骤。

1、样品酶解：同检测例1的样品酶解方法，得到待测液。

2、葡萄糖含量检测：

用高效液相色谱法检测待测液和葡萄糖梯度溶液（葡萄糖梯度溶液见检测例1）。根据葡萄糖梯度溶液对应的检测结果绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出待测液中葡萄糖的含量。

3、计算：

X=100×C/｛[（WTs/F1）×(F2/F3)]/A｝；

X：待测液态乳中酵母β-葡聚糖的含量，mg/100g；

C:待测液中葡萄糖的含量，mg/mL；

WT_s：待测液态乳的质量，mg；

F1：中间物A的体积，2.6mL；

F2：步骤3）中，向新试管中移取上清液的体积，0.130mL；

F3：中间物C的体积，0.845mL；

A：待测液稀释系数。

实施例设置：

将上述提取例和检测例结合，设置如下实施例：

液态乳样品提取例检测例实施例1纯牛奶提取例1检测例1实施例2香蕉牛奶提取例2检测例1实施例3谷物牛奶提取例3检测例1实施例4酸酸乳提取例4检测例1实施例5纯牛奶提取例1检测例2 实施例6香蕉牛奶提取例2检测例2 实施例7谷物牛奶提取例3检测例2 实施例8酸酸乳提取例4检测例2

向液态乳样品中添加酵母β-葡聚糖标准品，得到加标样本，用以上实施例的方法对加标样本进行检测并计算检测的加标回收率。检测结果如下表所示，单位为“%”：

实施例加标浓度为48 mg/100g的加标回收率加标浓度为60 mg/100g的加标回收率加标浓度为78mg/100g的加标回收率197.1597.3996.63296.8595.6096.83397.4698.1796.15496.8797.5897.12596.4896.8797.84697.3396.2298.11797.8297.7297.69898.1696.5697.36

向液态乳样品中添加酵母β-葡聚糖标准品，得到加标样本，用以上实施例的方法对加标样本重复检测三次，并计算三次检测结果的相对标准偏差，以此来表示精密度。检测结果如下表所示，单位为“%”：

实施例加标浓度为48 mg/100g的精密度加标浓度为60 mg/100g的精密度加标浓度为78mg/100g的精密度12.362.152.2323.174.031.8932.853.862.3542.672.992.6954.102.983.2263.652.452.6973.733.132.1683.664.233.18

同时设置两个对比实施例如下：

对比实施例1：对比前处理方法+本发明检测例1；

对比实施例2：对比前处理方法+本发明检测例2；

其中，对比前处理方法为：精确称取25.0000g（精确至0.0002g）样品放入一个150mL离心管中，加入5mL20%乙酸锌溶液和5mL10%亚铁氰化钾溶液，于7000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀加25mL纯水，振荡混合均匀后，于7000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀加25mL75%乙醇，振荡混合均匀后，于7000r/min离心10min，去掉上清液，沉淀再加25mL纯水，振荡混合均匀后，于7000r/min离心10min，去掉上清液。

用对比实施例1和2的方法检测纯牛奶的加标回收率为，单位为“%”：

实施例加标浓度为48 mg/100g的加标回收率加标浓度为60 mg/100g的加标回收率加标浓度为78mg/100g的加标回收率对比实施例193.2787.6195.12对比实施例288.1592.3785.16

用对比实施例1和2的方法检测纯牛奶的精密度为，单位为“%”：

实施例加标浓度为48 mg/100g的精密度加标浓度为60 mg/100g的精密度加标浓度为78mg/100g的精密度对比实施例15.876.145.96对比实施例27.126.657.56

在本文中，“示意性”表示“充当实例、例子或说明”，不应将在本文中被描述为“示意性”的任何实施方式解释为一种更优选的或更具优点的技术方案。

在本文中，“相等”、“相同”等并非严格的数学和/或几何学意义上的限制，还包含本领域技术人员可以理解的且生产或使用等允许的误差。除非另有说明，本文中的数值范围不仅包括其两个端点内的整个范围，也包括含于其中的若干子范围。

应当理解，虽然本说明书是按照各个实施例描述的，但并非每个实施例仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方案或变更，如特征的组合、分割或重复，均应包含在本发明的保护范围之内。