鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法

摘要

本发明公开了鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法。所述的微卫星引物为：F:5’-CGACTGGTGGGAGTTTCTGAC-3’；R:5’-GCCGCTTCTATCTCCTTTGC-3’。由于牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态特征往往难以鉴别；幼体阶段的牡蛎根据形态特征更加难以区分。而利用本发明的微卫星引物，采用本发明的鉴定方法，可以快速、准确地鉴定出香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎个体，并且在三者间的杂交种个体鉴定中也具有潜在的应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

说明书

技术领域：

本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和物种鉴定领域，具体涉及鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法。

背景技术：

微卫星DNA，又称作短串连重复(STRs)、简单重复序列(SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)，是指基因组中以1～6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。近年来，微卫星标记以其简单高效等优点被广泛应用于物种鉴定和杂交种分析。

牡蛎属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝目、牡蛎科，为全球性分布类群；牡蛎肉味鲜美、富含多种人体必需氨基酸，是一种重要的海洋生物资源，更是世界上最重要的海水养殖经济类群之一，其养殖总产量和单位面积产量在所有的贝类养殖种类中位居首位。牡蛎也是中国产量最大的经济贝类，其中具有较高经济价值的香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎在中国已进行人工养殖。香港巨牡蛎(Crassostreahongkongensis)喜欢生活在近河口或附近有淡水注入的地方，主要分布在浙江、福建、广东、广西、海南，年产量在100多万吨。其肉柱肥大、肉质白嫩、味道鲜美，市场价格远超过其它牡蛎品种。是暖温性近岸生长的一个经济价值极高的牡蛎类群，是我国南方养殖的主要经济种。有明牡蛎(Crassostreaariakensis)在我国南北沿海均有分布，主要集中在广东、广西，分布于我国南北低盐海。其肉味鲜美、营养丰富，是我国南方诸省的重要海水养殖经济贝类，已有近两百年的养殖历史。太平洋牡蛎(Crassostreagigas)分布在我国长江以北，为世界性养殖品种，主要集中在我国辽宁、山东等地，年产量近80万吨。由于生长速度快、环境适应性强、肉味鲜美，深受广大消费者青睐。牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态特征往往难以鉴别。而牡蛎软体部的解剖结构、染色体数目和核型差异很小，可提供的分类证据也很少。近年来，基于COⅠ、16SrDNA等线粒体基因和ITS序列差异的分子生物学被用于三者鉴定，但这些基因序列之间差异比较小，难以用电泳等简单方法进行区分；HRM方法虽然简单，但需要相关大型仪器支撑；而测序试验周期较长，且花费较高。急需一种简单高效的方法对香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎个体进行大规模物种鉴定。

另外随着牡蛎养殖业对优良新品种需求的不断增加，种间杂交研究在牡蛎间不断进行，学者们陆续开展了香港巨牡蛎×太平洋牡蛎、香港巨牡蛎×有明牡蛎、太平洋牡蛎×有明牡蛎杂交组合的研究，并证明部分种间杂交牡蛎的精卵能够结合，并正常发育。对获得的杂交后代进行遗传鉴定是很必要的，因为在牡蛎的种间杂交种经常会出现雌核发育、雄核发育、单倍体等现象。急需一种简单方法对香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎的杂交个体进行分子鉴定。

发明内容：

本发明的目的是提供一种简单、高效和精确的鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物和鉴定方法。

本发明从150对香港巨牡蛎微卫星引物中筛选出的1对微卫星(SSR)引物，用其对香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎各90个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效的进行物种鉴定，另外对三者间的杂交种个体鉴定也有潜在应用价值，从而实现了本发明的目的。

本发明的鉴定香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的微卫星引物，其特征在于，所述的微卫星引物(SSR引物Ch409)为：

F:5’-CGACTGGTGGGAGTTTCTGAC-3’(如SEQIDNO.1所示)；

R:5’-GCCGCTTCTATCTCCTTTGC-3’(如SEQIDNO.2所示)。

本发明的香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎及其杂交种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取牡蛎样品的基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，用上述微卫星引物进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳，然后分型判定；

由于SSR引物Ch409产生的香港巨牡蛎特异条带范围在308bp～347bp之间，有明牡蛎特异性条带范围在362bp～422bp之间，太平洋牡蛎特异性条带范围在206bp～242bp之间，三者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分三种牡蛎的个体。如果PCR产物，若在308bp～347bp区间内出现1～2条条带，则该牡蛎样品为香港巨牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在362bp～422bp区间内出现1～2条条带，则该牡蛎样品为有明牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在206bp～242bp区间内出现1～2条条带，则该牡蛎样品为太平洋牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；如果PCR产物同时在308bp～347bp区间和362bp～422bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体为香港巨牡蛎与有明牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种；如果PCR产物同时在308bp～347bp区间和206bp～242bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为香港巨牡蛎与太平洋牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种；如果PCR产物同时在362bp～422bp区间和206bp～242bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体为有明牡蛎与太平洋牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。

所述的以该基因组DNA作为模板，用上述微卫星引物进行PCR扩增优选PCR反应体系为：DNA模板50ng，Buffer10mM，微卫星引物F和微卫星引物R各0.2mM，dNTP0.2mM，Mg²⁺2.0Mm，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL；反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

本发明从150对香港巨牡蛎微卫星引物中筛选出一对能够在香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎中通用并且可以根据扩增条带大小区分三种牡蛎，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：Ch409，并在三者间的杂交种个体鉴定也有潜在应用价值。

由于牡蛎的外部形态常随生活环境的不同而发生极大的变化，单纯依靠形态特征往往难以鉴别；幼体阶段的牡蛎根据形态特征更加难以区分。而利用本发明的微卫星引物，采用本发明的鉴定方法，可以快速、准确地鉴定出香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎个体，并且在三者间的杂交种个体鉴定中也具有潜在的应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

附图说明：

图1为微卫星引物Ch409在太平洋牡蛎、有明牡蛎、香港巨牡蛎部分个体间的电泳染色对比图谱；1～9是太平洋牡蛎个体，其中2、3、4、5、6、7、8为杂合子，其他为纯合子，10～19是有明牡蛎个体，其中11、12、14、16、17、19为杂合子，其他为纯合子，20～29是香港巨牡蛎个体，其中20、21、25、26、27、29为杂合子，其他为纯合子。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

采用酚氯仿抽提法提取香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎各90个个体的基因组DNA，具体方法如下：

将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μl裂解液和10μl蛋白酶K(10mg/ml)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚(200μL)、氯仿/异戊醇(24:1)(200μL)混合液抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。由此分别得到香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎的基因组DNA。

以提取的三种牡蛎的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：

PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer10mM，引物(微卫星引物Ch409序列F和R)各0.2mM，dNTP0.2mM，Mg²⁺2.0Mm，TaqDNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。

其中微卫星引物Ch409序列为：

F:5’-CGACTGGTGGGAGTTTCTGAC-3’(如SEQIDNO.1所示)；

R:5’-GCCGCTTCTATCTCCTTTGC-3’(如SEQIDNO.2所示)。

反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次；72℃延伸10min。

PCR反应结束后，取0.5μL扩增产物在8％非变性巨丙烯酰胺凝胶电泳，22V稳压电泳4小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO₃溶液(AgNO₃1g，37％甲醛1.5mL，dH₂O1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS₂O₃、dH₂O1000mL)显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描仪下扫描，然后进行分型。具体结果如图1所示，从图1可以看出，香港巨牡蛎的纯合子在308bp～347bp区间内出现1条条带，香港巨牡蛎的杂合子在308bp～347bp区间内出现2条条带；有明牡蛎的纯合子在362bp～422bp区间内出现1条条带，有明牡蛎的杂合子在362bp～422bp区间内出现2条条带；太平洋牡蛎的纯合子在206bp～242bp区间内出现1条条带，太平洋牡蛎的杂合子在206bp～242bp区间内出现2条条带。

因此，如果是待测牡蛎样品，按照上述方法提取其DNA，以其为模板，用微卫星引物Ch409进行PCR扩增，PCR产物用非变性巨丙烯酰胺凝胶电泳，然后染色完毕后，进行分型，根据电泳结果与标准图谱进行对比，若在308bp～347bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为香港巨牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在362bp～422bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为有明牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子；若在206bp～242bp区间内出现1～2条条带，则该DNA样品为太平洋牡蛎，出现1条条带说明该个体为纯合子，出现2条条带则说明该个体为杂合子。该标记在香港巨牡蛎、有明牡蛎、太平洋牡蛎间杂交种鉴定中的潜在应用方法为：样品只有同时在308bp～347bp区间和362bp～422bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的香港巨牡蛎与有明牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种；样品只有同时在308bp～347bp区间和206bp～242bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的香港巨牡蛎与太平洋牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种；样品只有同时在362bp～422bp区间和206bp～242bp区间内各出现1条带，即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的有明牡蛎与太平洋牡蛎杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。