一种牙鲆原始生殖细胞dead end基因及其的应用

摘要

本发明涉及牙鲆Dead？end序列，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞dead？end基因及其的应用。牙鲆Dead？end基因为SEQ？ID？No.1中所示。所述基于牙鲆Dead？end基因的siRNA为20-50bp的siRNA。本发明在牙鲆中获得Dead？end(Dnd)的序列，并以该序列为靶基因合成的siRNA有促进生长的作用，因而该序列及相关的siRNA在鱼类包括海水鱼类促进生长的应用中具有极大的价值，这为鱼类包括海水鱼类促生长相关研究提供了基础技术保证。同时，本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以促进牙鲆等海水鱼生长。

说明书

技术领域

本发明涉及牙鲆Deadend序列，具体的说是一种牙鲆原始生殖细胞deadend基因及其的应用。

背景技术

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。牙鲆的快速生长能够提高养殖效率，并减少长时间养殖过程中的各种风险。通过遗传育种技术获得快速生长的品系需要较长的时间。如何利用小分子物质促进其生长未见报道。

Deadend(Dnd)是脊椎动物特有的生殖质成分,是原始生殖细胞(PGCs)及性腺生殖细胞的标记基因，其参与了PGCs的发生、发育、迁移、存活等功能，对PGCs的发育及其脊椎动物的配子生成至关重要。它编码RNA结合蛋白，该蛋白含有6个保守的结构域，一个C端结构域，一个RRM(RNARecognizeMotif),四个N端结构域。至今为止尚未见其对生长的影响的报道。

RNA干扰技术是近些年来发展起来的一种阻抑基因表达的方法，可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能以及表达调控等方面。该技术通过人为地引入与靶基因具有同源序列的dsRNA，宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA，最终诱导靶基因的mRNA降解，从而达到阻抑基因的表达，进而出现基因的功能缺失。

发明内容

本发明在于提供一种牙鲆原始生殖细胞deadend基因及其的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种牙鲆原始生殖细胞deadend基因，牙鲆Deadend基因为SEQIDNo.1中所示。

一种基于牙鲆原始生殖细胞deadend基因的siRNA，所述基于牙鲆Deadend基因的siRNA为20-50bp的siRNA。

所述siRNA的Sense(5'-3')序列为：CCACCUGAGGGUUCUGCGUG；Antisense(5'-3')序列为：CACGCAGAACCCUCAGGUGG；

或，以上述siRNA序列为核心序列在5'端和/或3'添加不同碱基或者其它核苷酸类似物等获得。

一种基于牙鲆原始生殖细胞deadend基因的靶基因应用，所述根据SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列的20-50bpsiRNA靶基因在促生长中的应用。

所述根据SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列的20-50bpsiRNA靶基因在鱼类中促生长中的应用。

所述鱼类为牙鲆。

本发明的优点：

本发明是首次在牙鲆中发现Deadend(Dnd)的序列，并证实以该序列为靶基因合成的siRNA有促进生长的作用，因而该序列及相关的siRNA在鱼类包括海水鱼类促进生长的应用中具有极大的价值，这为鱼类包括海水鱼类促生长相关研究提供了基础技术保证。

同时，本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以促进牙鲆等海水鱼生长。

附图说明

图1为本发明实施例提供的靶基因siRNA抑制目的基因表达图，其中，M，DNA标准；P1-P9，25bp的SiRNA注射组；B，PCR空白对照；C1-4，对照SiRNA注射组。

图2为本发明实施例提供的靶基因siRNA促进生长的分析图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明的实验步骤。

本发明在牙鲆中获得Deadend(Dnd)的序列如SEQIDNo.1中所示。以所述SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列为靶序列合成siRNA促进牙鲆生长的应用。本发明基因序列为牙鲆特有的序列，可以促进牙鲆生长。

实施例1

1.RNA提取

牙鲆性腺的总RNA提取采用Trizol(Invitrogen)提取，具体步骤如下：取大约0.1mg牙鲆性腺，加入0.1mLTrizol，充分混匀，然后加入Trizol0.9mL，室温放置5min。加入氯仿0.2mL，剧烈振荡15s，室温放置3min。12000×g，4℃，离心15min，离心后将离心管小心取出。取上清到新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置10min，12000×g，4℃，离心10min。去掉异丙醇，加入预冷的75％乙醇1mL洗涤沉淀，7500×g，4℃，离心5min。去掉乙醇，置于超净台中使乙醇挥发。加入水(无RNA酶)30μL，55-60℃水浴10min使RNA溶解，取出后置于冰上。加入1μLDNase(无RNA酶)，37℃水浴15min，消化DNA以去除DNA的残余。取出后置于冰上，1μL电泳检测质量及完整度，测吸光度检测浓度及质量。直接用于余下实验，或者液氮速冻，-80℃保存

2.cDNA合成及检测

取上述获得性腺总RNA2ug及1uloligod(T)加入灭过菌的PCR(无RNA酶)中，放入PCR仪70℃，5分钟，取出立即置于冰上，加入5.0μL5X反转录酶缓冲液，5.0μLdNTPMix(10mM)，1.0μLRNase抑制剂(RNaseInhibitor)(40U/μL)，1.0μLm-mlv反转录酶，并用水(无RNA酶)补至25ul，轻轻混匀，42℃温育60min。

用牙鲆β-actin基因作内参PCR检测cDNA，PCR所用引物如下：5'端引物5'–ACTACCTCATGAAGATCCTG–3'，3'端引物5'–TTGCTGATCCACATCTGCTG–3'

PCR混合物体系如下：

试剂 体积(ul) cDNA 0.5 2x Taq Mix 12.5 5'端引物 0.5 3'端引物 0.5 水 11.0 总和 25.0

PCR按照如下程序进行：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30min，反应30个循环；72℃10min，4℃+∞；反应结束后取出5μL在1.0％的琼脂糖电泳检测，发现PCR产物中为500bp左右的片段。

3.Dnd的获得。

PCR所用引物如下：(1)5'端引物5'–CACCTGAGGGTTCTG–3'，3'端引物5'–TACAACAACCAGTGATCCGAGTG–3'

PCR混合物体系如下：

试剂 体积(ul) cDNA 4.0 2x Pfu Mix 25 5'端引物 1.0 3'端引物 1.0 水 19.0 总和 50.0

PCR按照如下程序进行：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，反应45个循环；72℃10min，4℃∞；反应结束后取出5μL在1.0％的琼脂糖电泳检测，发现PCR产物中含700左右的片段，然后将剩下的产物(约45μL)通过胶回收的方法回收其适当的片段。

PCR产物的回收采用胶回收试剂盒(康为公司)进行，具体方法如下：制备大孔的琼脂糖凝胶，将回收用PCR反应液加入点样孔内，100V电压恒压电泳，使电泳条带分离效果达到最佳为止。在紫外灯下切下目的片段所在琼脂糖块放入1.5mL离心管中。按每100mg琼脂糖加300μLS1液的比例加入S1液，置50℃水浴10min，使琼脂糖块完全溶化。每2min颠倒混匀一次。将琼脂糖溶化后的溶液移入吸附柱，离心30s。倒掉收集管中液体，再将吸附柱放入收集管。

在吸附柱中加入500μLW1液，离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。在吸附柱中加入500μLW1液，静置1min后，离心15s。倒掉收集管中液体，将吸附柱放入收集管。离心1min。将吸附柱放入一个干净的1.5mL的离心管中，在吸附膜中央加入20uLEB液，37℃5min后，离心1min，取3μL回收溶液电泳检测回收结果。将DNA贮存于-20℃保存备用。将PCR产物用EcoRI(宝生生物)和BamHI(宝生生物)对质粒进行双酶切，酶切的反应体系如下：5μL10×KBuffer，2.5μLEcoRI，2.5μLBamHI，15μL质粒DNA，25μLddH₂O，37℃酶切3h。酶切后进行电泳检测，连接到用EcoRI(宝生生物)和BamHI(宝生生物)对质粒进行双酶切pBlueScript-sk(+)载体中，并转化入DH-5α感受态细胞(天根公司)中。

4.质粒的获得及测序。

铺平板(内含IPTG、X-gal和100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。挑取白色菌落于预先分装的3mL含有100μg/mL氨苄青霉素的试管中，37℃培养过夜，碱裂解法提取质粒，具体如下：将1.5mL过夜培养的菌液，5000rpm离心5min，除去上清；加入200μLBuffer1(50mMGlucose,25mMTris-Hcl(pH8.0),10mMEDTA(pH8.0))，重悬菌体。加200μLBuffer2(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，轻轻混匀，冰上放置5min；200μLBuffer3(3MNaAc,pH5.2)，充分混匀，冰上放置5min；12000rpm离心5min，取上清至一新的离心管，加入等体积异丙醇，混匀；冰上放置5min。12000rpm离心5min，除去上清，沉淀用300μL70％乙醇洗涤，7500rpm离心5min。除去上清，室温晾干后加40μL灭菌双蒸水溶解质粒。除去上清，室温晾干后加40μL灭菌双蒸水溶解质粒。用EcoRI(宝生物)对质粒进行酶切，酶切的反应体系如下：1μL10×MBuffer，0.5μLEcoRI，3μL质粒DNA，6.5μLddH₂O，37℃酶切2h。酶切后进行电泳检测，将阳性克隆菌株送到测序。将获得序列与已有的部分序列进行比较分析，从而获得如SEQIDNo.1所示的Dnd序列。

SEQIDNo.1

ATGAGGGTGTGGGCACAGGGCTTAGTGAGGAGTGAAGGGTGCCACTGTCCAATAATGGGACTGATCCAGATGCAGCCGCGGGGCGACAGAGAGGCGTCACAGAACCCAGCGATGGAGGAGGAGGTGATGGAGGCCGCGCAGAGCCAGGTCCTGAACTTTGAGCCGGTGCCAGCGCTGGAAACCTGGCTGAAAACAACCAATACACAACTGATTCAAGTAAACGGCCAGAGGAAGTATGGAGGACCACCTGAGGGTTCTGCGTGTGCTGACTGAGGGCGTGCAGAAAGTGTCTCTGACAGCCGGGCCTGGTATCGAGGGGGTGTCGGCCATAGTAGCCTTCTCATCCCACTACACTGCTTCTATGGCCAAGAAGATGCTGGTTGAAGTGTTCAAGAAGCAGTTTGCACTGAATATCTCAATCGTATGGCATCCAGACGAATCGCTGTCTCCAAACAAGCCTCCGAAGAGCCCTCTGGCATCTCCCCTGAAGCCACCATGCCACATCCTGAAGTCTCCACAGCCCTCAGTCCCGCCTCCACATCTCGCCCATCATTCACCCACCCCCCCAAGTTTCTGCAGAGCAGTGGGCGGACCTACGACCTTTTCACACCCTCACTGTCCCCACCACTTCACTTTTTCCTCTTCGCAGGGGGACCGAGTGCCTGTTGAATCCCCAGTGATGCTCCTGAGTAAGGTGTGTGAGGTGACGGGGGTTGGTCAGCCACGCTATGAGATGTCCTACAGCCACACTGGAAGAAATGGATTCCTCTACTTCGACTACACAGTGTGTATCCCCAGGATAACCACTCCTTTCAAAGGGCTGGTCATGACCTTGCCAGGACCCACTGCCAGCACCGTGCATGAGGAAGCTGGGCAGGCTGCAGCCCAACAGGTCCTGAAGAGAATTTACAACAACCAGTGATCCGAGTGACGAGCTCATCAACGAGAGCCTCCTCCTGTAGCACTG

(a)序列特征：

●长度：967

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：牙鲆

实施例2

根据上述SEQIDNo.1中所示的核苷酸序列，本领域技术人员可通过人工化学合成方式获得siRNA；即siRNA序列的Sense(5'-3')序列为：CCACCUGAGGGUUCUGCGUG；Antisense(5'-3')序列为：CACGCAGAACCCUCAGGUGG。

而后以上述获得20bp的siRNA序列为核心序列为基础按照现有技术的方式进行修饰获得25bpsiRNA，其中Sense(5'-3')序列为：ACCACCUGAGGGUUCUGCGUGUGCU；Antisense(5'-3')序列为：AGCACACGCAGAACCCUCAGGUGGU。

同时，也可按照生物的合成方式获得。

并且设置同等长度的对照siRNA，其中Sense(5'-3')序列为：UAAAUGUACUGCGCGUGGAGAGGAA；Antisense(5'-3')序列为：UUCCUCUCCACGCGCAGUACAUUUA。

实施例3

1.注射siRNA及样品收集

将上述获得的DndsiRNA(25bpsiRNA)及其对照siRNA注射到48日龄(1.9-2.2cm)的牙鲆幼鱼中，注射前采用MS222麻醉并测量体重，以剂量为0.2nmol/g进行注射，注射后放入温度范围为18-24℃的海水中养殖，充入空气，正常饲养，120天后麻醉、测量体长并分离性腺。

2.提取RNA

同实施案例1步骤1

3.合成cDNA及检测

同实施案例1步骤2

4.抑制靶基因效率的检测

通过PCR检测靶基因表达是否被降低或者完全抑制，所用引物如下：5'端引物5'-CACCTGAGGGTTCTG-3',3'端引物5'-CAGTGATGCTCCTGAGTAAG-3'。

PCR混合物体系如下：

试剂 体积(ul) cDNA 2 2x Taq Mix 12.5 5'端引物 0.5 3'端引物 0.5 水 9.5 总和 25.0

PCR按照如下程序进行：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃40s，反应45个循环；72℃10min，4℃+∞；反应结束后取出10μL在1.0％的琼脂糖电泳检测，PCR产物应在500bp左右的片段(图1)。由图1可见SiRNA的确能够将目的基因的表达抑制，效率大约在87.5％。

实施例4

将上述所注射的牙鲆通过测量体长分析生长状况(图2)，结果表明对照组全长(Totallength±SD)为14.78±0.41(n＝15)，试验组全长(Totallength±SD)为16.28±0.34(n＝20)。

由图2可见注射SiRNA牙鲆的全长比对照组的全长有大约20％增加，经分析发现两者之间有显著性差异(p＜0.01),因此注射SiRNA能够增加牙鲆的生长。