一种检测人膀胱移行细胞癌细胞的核酸适配体及其在制备检测制剂中的应用

摘要

本发明公开了一种能够用于检测人膀胱移行细胞癌细胞(T24)的核酸适配体及其在制备检测制剂中的应用。同现有的一些技术相比，本发明的优点在于：寻找到的核酸适配体具有比相关蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对核酸适配体的不同部位进行修饰和取代，同时序列稳定，便于保存；方便标记等优势。采用本发明的核酸适配体进行人膀胱移行细胞癌细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸适配体及其应用，特别是涉及一种可用于人膀胱移行细胞癌 细胞及临床样本组织检测的核酸适配体及其制备检测试剂的应用方法。

背景技术

膀胱癌是我国泌尿外科临床上最常见的肿瘤之一，是一种直接威胁患者生存的疾 病。在世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位，在男性排名第六位，女性排在第十 位之后。在欧美，膀胱癌发病率居男性恶性肿瘤的第四位，位列前列腺癌、肺癌和结肠癌之 后，在女性恶性肿瘤亦排在十位以后。2002年世界膀胱癌年龄标准化发病率男性为10.1/10 万，女性为2.5/10万，年龄标准化死亡率男性为4/10万，女性为1.1/10万。美国男性膀胱癌 发病率为24.1/10万，女性为6.4/10万。美国癌症协会预测2010年美国膀胱癌新发病例数为 70530例(男52760例，女17770例)，死亡病例数为14680例(男10410例，女4270例)。在我国， 男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第八位，女性排在第十二位以后，发病率远低于西方国 家，2002年我国膀胱癌年龄标准化发病率男性为3.8/10万，女性为1.4/10万。近年来，我国 部分城市肿瘤发病率报告显示膀胱癌发病率有增高趋势。膀胱癌男性发病率为女性的3-4 倍。且城市居民膀胱癌死亡率明显高于农村。2009年我国城市居民膀胱癌年龄标准化死亡 率男性为3.79/10万，女性为1.30/10万；而农村男性居民膀胱癌年龄标准化死亡率为2.42/ 10万，女性为0.81/10万。

膀胱癌患者会出现膀胱纤维化，膀胱容量减少，甚至出现输尿管尿液回流，并伴随 肾水肿与肾脏发炎，出现尿血，甚至肾脏坏死和尿毒症，危及生命。另据有关报道表明，膀胱 癌会引发结核病，有结核病史的患者经过积极抗菌治疗后，仍有尿路刺激症状或尿沉渣异 常。此外，膀胱癌患者在胀尿时疼痛会加倍，必须等到排尿后疼痛才会稍缓。生活上的各种 压力都会使膀胱癌患者的病情加重或复发，大大降低了患者的生活质量。

膀胱癌有多种类型，其中包括尿路上皮(移行)细胞癌、鳞状细胞癌和腺细胞癌，其 次还有较少见的小细胞癌、混合型癌、癌肉瘤及转移性癌等。在这当中，膀胱尿路上皮癌最 为常见，占膀胱癌的90％以上；膀胱鳞状细胞癌比较少见，约占膀胱癌的3％～7％。

现如今，尿细胞学检查是膀胱癌诊断和术后随诊的主要方法之一。尿标本的采集 一般是通过自然排尿，也可以通过膀胱冲洗，这样能得到更多的癌细胞，利于提高诊断率。 尿细胞学检测膀胱癌的敏感性为13％～75％，特异性为85％～100％。敏感性与癌细胞恶性 分级密切相关，分级低的膀胱癌敏感性较低，一方面是由于肿瘤细胞分化较好，其特征与正 常细胞相似，不易鉴别，另一方面由于癌细胞之间黏结相对紧密，没有足够多的癌细胞脱落 到尿中而被检测到，所以尿细胞学阴性并不能排除低级别尿路上皮癌的存在。此外，尿标本 中癌细胞数量少、细胞的不典型或退行性变、泌尿系感染、结石、膀胱灌注治疗和检查者的 技术差异等因素会影响尿细胞学检查结果。虽然大部分尿液膀胱癌标记物显示出了较高的 敏感性，但是其特异性却普遍低于尿细胞学检查，到目前为止，仍然没有一种理想的标记物 能够取代膀胱镜和尿细胞学检查而对膀胱癌的诊断、治疗、术后随诊和预后等方面做出足 够的判断。因此，寻找出一种理想的标记物进而能够开发出快速、准确诊断以及治疗膀胱癌 的方法就显得尤为重要。

核酸适配体(nucleicacidaptamer)是从人工合成的随机单链核酸库中筛选出 来的能高亲和性结合靶分子的20-50碱基的寡聚核苷酸，包括DNA适体和RNA适体。适配体因 其结构的多样性而具有靶分子广、亲和力高、特异性强等特点，同时，相比传统抗体，适配体 分子量小、易改造修饰、制备方便且无免疫原性。因此，适配体在基础研究、临床诊断、药物 研制等方面展现了广阔的应用前景。利用这些适配体对其所结合的细胞表面的靶分子进行 表征和检测，有助于发现新的生物标志物。核酸适配体已经被广泛应用于识别各种癌症靶 标分子，发现新的生物标志物。

由于各类癌症之间会有一定蛋白表达的相似性，因此，我们使用到了一个文库，这 个文库是利用核酸适配体筛选技术(CELL-SELEX)对另外一个癌症细胞系所筛选出来的结 合能力最强的文库。我们利用这个文库与大量的癌症细胞系结合，试图寻找到与该文库能 够良好结合的癌症细胞系。经过大量的细胞系筛选，最终发现人膀胱移行细胞癌细胞与该 文库结合能力非常好，同时特异性也非常强。之后我们通过分析该文库的高通量测序结果 进行分析和验证之后，最终挑选出了D7这条序列。D7表现出了与人膀胱移行细胞癌细胞的 高亲和性以及特异性，非常适合进行人膀胱移行细胞癌细胞表征和检测，以及今后表面癌 症靶标分子的寻找。

发明内容

本发明的目的提供一种高度特异性、稳定性、可用于人膀胱移行细胞癌细胞检测 的适配体及其制备检测试剂的应用方法。

一种检测人膀胱移行细胞癌细胞的核酸适配体，序列如下：

5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACC AGCACGTCCATGAG-3’。

所述的检测人膀胱移行细胞癌细胞的核酸适配体，还可以是在保持下划线部分的 保守核苷酸序列D7不变的情况下将核酸适配体进行修饰和改造，具体包括以下三种中的任 一种：

a)核酸适配体下划线部分的保守核苷酸序列D7不变，不变序列两端的核苷酸进行 删减；

b)核酸适配体下划线部分的保守核苷酸序列D7不变，不变序列两端核苷酸的碱基 进行人工碱基替换；

c)核酸适配体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记。

所述的检测人膀胱移行细胞癌细胞的核酸适配体的应用方法，将所述的核酸适配 体用于制备检测人膀胱移行细胞癌细胞的制剂。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明通过筛选得到的核酸适配体具有比 蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够体外化学合成，分子量小，可以对不同 部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存；便于标记等优势。采用本发明的核酸适配体 进行人膀胱移行细胞癌细胞检测时，操作更为简单、迅速，并且本发明核酸适配体的合成成 本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。

附图说明

图1为最初用于筛选各种细胞系的文库与人膀胱移行细胞癌细胞(T24)以及正常 的人膀胱移行细胞(SV-HUC-1)的结合情况；

图2为通过分析高通量测序结果后，挑选出几条具有代表性的序列与T24的结合情 况；

图3为从文库当中挑选出的D7与人膀胱移行细胞癌细胞(T24)以及正常的人膀胱 移行细胞(SV-HUC-1)的结合情况；

图4人膀胱移行细胞癌细胞在经过蛋白酶K以及胰酶处理之后，D7与人膀胱移行细 胞癌细胞的结合情况。(a)T24经过蛋白酶K处理后与D7的结合情况；(b)T24经过胰酶处理后 与D7的结合情况；

图5D7与人膀胱移行细胞癌细胞结合的激光共聚焦图；

图6D7加上两端引物序列后经过一系列的删减后与人膀胱移行细胞癌细胞的结 合情况；

图7(a)不同浓度梯度的D7与人膀胱移行细胞癌细胞的结合情况；(b)根据图(a)所 计算出来的D7与T24的亲和力常数；

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实 验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：

本实验所用到的细胞系人膀胱移行细胞癌细胞(T24)以及正常的人膀胱移行细胞 (SV-HUC-1)均来源于中科院上海细胞库。

实施例1：高通量检测与数据分析

经过反复验证确定对另外一个癌症细胞系所筛选出来的结合能力最强的文库与 T24细胞系有很强的特异性结合，我们将该文库送至生工测序部，利用Illumina公司Miseq 或者是Hiseq2000平台进行测序，产生了超过15万条的原始数据.。我们通过对原始数据的 分析并结合每一条序列出现次数挑选出出现次数最多的前100条序列，并对这100条序列进 行同源性对比将同源性接近的序列划归为一族。最后，从每一族当中挑选具有代表性的序 列并结合出现次数的排列顺序挑选出下一步验证的10条序列(见表1)。

表1

实施例2：确定与T24细胞系特异性结合能力最强的序列

首先，用0.2％EDTA和2％EDTA将贴壁状态的T24细胞从培养皿上消化下来，分别将 细胞收集到离心管中，并用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)离心洗涤几 次；其次，将终浓度为250nM的10条序列以及随机文库分别加入到结合缓冲液(D-PBS，含 0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁，100mg/LtRNA，1g/LBSA)浸泡的T24细胞中；然后放置于4℃ 摇床孵育40min；孵育完成之后并用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)离心 洗涤两次，并通过流式细胞仪进行荧光检测(结果见图2，图中只显示了几条具有代表性的 序列)。检测结果显示D7与T24细胞结合能力最强。

实施例3：D7特异性识别人膀胱移行细胞癌细胞

该实验与细胞筛选技术(CELL-SELEX)中的某些处理步骤有相似之处。首先，用 0.2％EDTA和2％EDTA分别将贴壁状态的T24和SV-HUC-1从培养皿上消化下来，分别将细胞 收集到离心管中，并用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)离心洗涤几次；分 别向T24和SV-HUC-1中加入等量的结合缓冲液(D-PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁， 100mg/LtRNA，1g/LBSA)，并分别投入终浓度为250nM的D7与随机文库；然后放置于4℃摇 床孵育40min；孵育完成之后并用洗涤缓冲液(PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)离心洗 涤两次，并通过流式细胞仪进行荧光检测(结果见图3)。结果显示D7具有高亲和力且特异的 与T24细胞结合，而不与正常的SV-HUC-1细胞结合。

实施例4：D7序列加上两边的引物全序列的删减方法

由于我们不清楚全序列当中到底是哪一段序列与T24结合强，所以我们通过如下 的删减方法来进行序列的优化：

(下划线部分为D7的保守核苷酸序列)

D7序列加上两边的引物全序列为：

ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCACGTCCAT GAG

D7a：(左边引物区删减8个碱基，右边引物区删减15个碱基)

ATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCAC

D7b：(左边引物区删减18个碱基，右边引物区删减18个碱基)

AGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGT

D7c：(左边引物区删减8个碱基，右边引物区删减10个碱基)

ATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCA

D7d：(左边引物区删减5个碱基，右边引物区删减15个碱基)

CGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCAC

D7e：(左边引物区删减5个碱基，右边引物区删减10个碱基)

CGGATGCCACTACAGGTTGGGGTCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAACGAGAGGTCACCAGCA

我们将上述一系列删减后的序列和加上两边的引物全序列与T24孵育后进行流式 细胞仪检测(结果见图6)，发现D7e的结合能力最强，但还是没有加上两边的引物全序列结 合能力好。

实施例5：探究D7是否结合在T24细胞表面的膜蛋白上

首先，将贴壁状态的T24细胞用0.2％EDTA从细胞培养皿上消化下来，用六个离心 管收集。其中两管细胞中加入蛋白酶K，两管细胞中加入胰酶，所有细胞均同时放置于37℃ 细胞培养箱当中。设定两个处理时间分别为5min和20min，处理完毕之后用洗涤缓冲液 (PBS，含0.45％的葡萄糖，5mM氯化镁)离心洗涤，然后向五管细胞加入250nMD7，另外的一 管没有处理过的细胞中加入250nM的随机文库，放置在4℃摇床中孵育40min，孵育完毕后用 洗涤缓冲液离心洗涤两次，最后用流式细胞仪进行荧光信号检测(结果如图4)。流式细胞仪 的结果显示，经过蛋白酶K以及胰酶处理之后D7与T24的结合量会有所下降，说明D7有一部 分是结合在T24细胞膜表面的蛋白上。并且通过激光共聚焦显微镜的结果(图5)也能够清晰 的看到D7大部分是结合在T24细胞的表面。