一株提高蛋壳强度并改善蛋鸡生产性能的鼠李糖乳酸杆菌W27及其应用

摘要

本发明提供了一株提高蛋壳强度并改善蛋鸡生产性能的鼠李糖乳酸杆菌W27及其应用，鼠李糖乳酸杆菌W27的保藏编号为：CGMCC？No.？11387。本发明菌株是从健康动物分离出来的菌株，安全可靠，并且经过反复的检查筛选，证明其可靠稳定；所述鼠李糖乳酸杆菌W27是以针对提高蛋壳强度而开发的菌株，对于促进宿主钙磷吸收具有针对性，并且效果良好；本发明的鼠李糖乳酸杆菌Lactobacillus？rhamnosus？W27可以促进宿主钙磷吸收的益生菌，能够提高蛋壳强度，对于改善蛋鸡生产性能具有重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于动物饲料技术领域，涉及饲料添加剂，具体涉及一株提高蛋壳强度并改善蛋鸡生产性能的鼠李糖乳酸杆菌W27及其应用。

背景技术

血钙不足会对蛋壳质量形成不利影响，一个鸡蛋含有2克的钙，要保持好的蛋壳品质母鸡每天需要摄入4克的钙，日粮中的钙只有50-60%用于蛋壳的形成。产蛋鸡对钙的需求量是非产蛋鸡的4-6倍，在产蛋前19h，鸡蛋进入输卵管-子宫的壳腺区域，蛋壳不会在蛋白基质上沉积钙离子。在蛋壳形成的最后15h，通过壳腺的钙离子达到100-150mg/h。钙来源于两个方面：日粮和骨骼。一般血钙水平是20-30mg/dl，而母鸡日粮中钙的含量是2%，大约还要从骨骼中动员30-40%的钙，此时血钙浓度是3.56%或者更高。因此在小母鸡阶段就需要在机体中贮存高水平的钙。当壳腺未激活时，肠道从日粮中吸收的钙是40%，激活后达到72%。

蛋壳中磷的含量很少，只有20mg。磷在蛋壳内外层分布不均，磷元素影响CaCO₃的吸收，参与蛋壳形成的最后阶段。血液中的磷含量水平过高会影响骨骼中钙的代谢，钙和磷的吸收相互关联，会受到钙磷的来源和形式、肠道pH值、钙磷的比例、维生素D3等因素的影响。

益生素是活的微生物，它能够做成不同类型的产品，包括食品、药品和食品添加剂。通常用于益生素的菌株为乳酸杆菌和双歧杆菌，但也有啤酒酵母和一些大肠杆菌和芽孢杆菌被用于益生素。千百年来乳酸杆菌被利用通过发酵来进行食品保存，乳酸杆菌具有双重的作用不仅用于食品发酵还有利于人类健康。严格来讲，名词“益生素”应该是能促进人类健康的活的微生物。发酵食品不仅具有特别的味道并且低pH值还能抑制有害微生物的污染。发酵已被不同国家的人用于初级农产品的保存（谷物、根茎、块茎，水果和蔬菜，牛奶，肉，鱼等）。

有许多研究表明益生素能够促进骨骼增长，可能是因为益生菌能够产生酶类和维生素或者能够释放代谢产物，有相当多的维生素像维生素C、D或K有助于骨基质的形成并促进骨骼的生长。益生素菌株产生的短链脂肪酸有助于提高矿物质的溶解度，益生菌的发酵副产物如丁酸和乳酸可促进肠细胞的繁殖从而增加整个吸收表面。有证据表明当益生菌添加剂量合适时宿主机体与钙结合和吸收相关的蛋白就会大量表达。并且，许多最新研究进展明确的证明了益生菌在改善骨矿物质密度方面的作用。研究表明发酵乳中的瑞士乳酸杆菌有助于绝经期妇女钙的代谢，这种细菌能够降低宿主体内的甲状旁腺素，并增加血浆中钙的水平。钙代谢发生变化可能是因为肠细胞对钙的吸收增加，选择合适的益生菌菌株对于增进该的吸收非常重要，Gilman等研究发现不仅是婴儿双歧杆菌，唾液乳酸杆菌也能用于促进钙的吸收。发表于细胞生理学的一项研究表明罗伊氏乳酸杆菌可提高血浆中的成骨细胞数量，并促进骨质的形成。

发明内容

本发明的目的在于提供了一株提高蛋壳强度并改善蛋鸡生产性能的鼠李糖乳酸杆菌W27及其应用。该菌株能显著提高产蛋鸡蛋壳破碎强度、蛋壳密度和蛋壳相对重量，并显著降低破软壳率；同时该菌株提高了蛋鸡的产蛋率，并降低了料蛋比。

为实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供了一株鼠李糖乳酸杆菌W27，其分类命名为Lactobacillusrhamnosus，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11387。

进一步的：所述鼠李糖乳酸杆菌W27革兰氏染色阳性，呈细长丝状杆菌；乳白色菌落，菌落圆形隆起，菌落边缘整齐。

进一步的：所述鼠李糖乳酸杆菌W27兼性厌氧菌生长，生长温度范围为26-73℃，生长pH值范围为pH5.6-8.7。

进一步的：所述鼠李糖乳酸杆菌W27的氧化氢酶试验、硝酸盐试验检验均为阴性。

本发明还提供了所述的鼠李糖乳酸杆菌W27在制备用于提高蛋壳强度的微生态制剂中的应用。

进一步的：所述鼠李糖乳酸杆菌W27的添加量为1.0×10⁴CFU/g全价料~1.0×10⁶CFU/g全价料。

本发明还提供了所述的鼠李糖乳酸杆菌W27在制备用于改善蛋鸡生产性能的微生态制剂中的应用。

进一步的：所述鼠李糖乳酸杆菌W27的添加量为1.0×10⁴CFU/g全价料~1.0×10⁶CFU/g全价料。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1).本发明的鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27是一株可以促进宿主钙磷吸收的益生菌，能够提高蛋壳强度，对于改善蛋鸡生产性能具有重要的意义。

2).本发明菌株是从健康动物分离出来的菌株，安全可靠，并且经过反复的检查筛选，证明其可靠稳定。

3).本发明菌株是以针对提高蛋壳强度而开发的菌株，对于促进宿主钙磷吸收具有针对性，并且效果良好。

附图说明

图1为鼠李糖乳酸菌LactobacillusrhamnosusW27的菌体形态显微镜照片；

图2为鼠李糖乳酸菌LactobacillusrhamnosusW27的生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1、鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27的筛选

1、鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27从健康鸡的盲肠食糜中分离得到：用无菌载玻片刮取盲肠黏膜于无菌水中，振荡混匀进行梯度稀释，MRS培养基倾注培养筛选“溶钙圈”明显的菌落，多次纯化后得到单菌落，命名为W27，保存。

2、鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27的主要特性

菌体形态特征：革兰氏染色阳性，呈细长丝状杆菌，如图1所示。

菌落形态特征：乳白色菌落，圆形隆起，边缘整齐。

生长特征：兼性厌氧菌生长，生长温度范围为26-73℃（最适温度为38℃），生长pH值范围为pH5.6-8.7（最适pH6.3）。

生长曲线：使用MRS液体培养基（蛋白胨2g/L；酵母浸膏2g/L；氯化钠0.1g/L；K₂HPO₄0.04g/L；KH₂PO₄0.04g/L；CaCl₂·6H₂O0.01g/L；MgSO₄·7H₂O0.01g/L；NaHCO₃2g/L；吐温-802mL/L；氯化血红素0.02g/L；维生素K110μL/L；半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；胆盐0.5g/L）37℃条件下培养，结果表明，3h-12h为对数生长期，12h进入平台期，细菌几乎停止生长，活菌数量和凋亡细菌处于一个平衡时期，如图2所示。

3、生化鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》，做如下生化试验：经过氧化氢酶试验、硝酸盐试验检验均为阴性，且不液化明胶，不产生吲哚和硫化氢，判定所筛选出的LactobacillusrhamnosusW27菌株属于乳酸菌（Lactobacillus）属。

4、16SrRNA基因测序

使用细菌通用引物（Lane，1991）扩增细菌16SrRNA基因全长序列，PCR反应参照宝生物公司rTaqDNA聚合酶的使用说明书进行，PCR反应体系（50uL）为：Buffer5uL；dNTP4uL；上下游引物各1uL；Taq酶0.25uL；水37.75uL；模板1uL。扩增细菌16SrRNA基因全序列，扩增产物进行测序（Invitrogen，上海）。所述鼠李糖乳酸杆菌亚种（LactobacillusrhamnosusW27）的16SrRNA基因全序列如SEQIDNo:1所示。序列的同源性通过互联网与GenBank进行比较（网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov），比较结果显示出所筛选出的LactobacillusrhamnosusW27菌株与鼠李糖乳酸杆菌相似度最高，说明其为鼠李糖乳酸杆菌。

将筛选到的菌株W27进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月16日；鼠李糖乳酸杆菌Lactobacillusrhamnosus的保藏编号为CGMCCNo.11387。

实施例2、动物试验

试验选择540只22周龄体重整齐的海兰褐蛋鸡，采用三层全阶梯式笼养鸡舍（40×42×48cm），试验随机分为对照组、低剂量试验组和高剂量试验组，每个处理组6个重复，每个处理组60只笼，每只笼3只鸡。10只临近的笼子（共30只鸡）被认为是一个试验重复。各处理组饲喂等能等氮日粮，对照组日粮中不添加任何微生态或添加剂，试验组日粮中添加LactobacillusrhamnosusW27，低剂量试验组的添加剂量为1.0×10⁴CFU/g全价料，高剂量试验组的添加剂量为1.0×10⁶CFU/g全价料，试验在半开放式鸡舍进行，在9月份和来年的4月份之间的冬春季节进行，蛋鸡舍室温在12°C到24°C之间，试验持续28周。益生菌剂首先用混合机与2kg麸皮进行预混，再与试验饲料进行混合，饲料每周制作两次，并且在密封容器中保存，在蛋鸡生长期间不添加任何益生菌和生长促进剂，饲料和饮水自由采食，每天的光照时间为17h。

在试验的开始和结束时对每只母鸡进行称重，以确定平均体重，在22周龄到49周龄时每天记录产蛋率和破损鸡蛋的数量，在这个期间每周有连续两天每天每个处理组随机抽取32只鸡蛋，因此共计收集了5376只鸡蛋以测定蛋品质，每周统计一次饲料消耗，以摄食的饲料克数比上产蛋克数作为饲料转化率。试验的第20，40天采集血样，清晨喂料前，每个重复随机取10只，心脏采血5mL注入试管，标号离心分装于eppendorf管中，-20℃冰箱保存备检。

1、生产性能测定

根据产蛋个数、蛋重及耗料量计算产蛋率、平均蛋重、料蛋比以及破软壳率。生产性能各指标测定方法如下：

（1）平均蛋重：在22周龄到49周龄时每周固定连续两天，在相同时间采集鸡蛋，用电子天平秤每重复的总蛋重，计算每重复平均蛋重。平均蛋重=总产蛋重/总产蛋数

（2）产蛋率：每天相同时间对每组各重复的产蛋数进行记录，计算当天每重复的产蛋率和各组日产蛋率均值。日产蛋率=日产蛋数/蛋鸡数量×100%

（3）日采食量：每周统计蛋鸡耗料量，余料回收，计算日平均采食量。日采食量=（每周饲喂量-每周余料量）/饲喂天数

（4）料蛋比（饲料转化率）：根据日采食量和日平均蛋重计算其比值。

表1.日粮中添加LactobacillusrhamnosusW27对蛋鸡生产性能的影响

指标对照组低剂量组高剂量组产蛋率（%）72.53±1.64^a76.82±2.98^b81.73±3.21^c平均蛋重（g）61.73±1.3762.41±0.2462.39±1.26日采食量（g）133.47±3.65134.61±4.82133.62±5.34料蛋比2.81±0.13^b2.64±0.26^a,b2.41±0.73^a

注：同行上标小写字母不同表示差异显著（P<0.05），同行上标字母相同或无标注则表示差异不显著（P>0.05）。

表1试验结果表明，试验组蛋鸡的产蛋率显著高于对照组（P<0.05），而料蛋比显著低于对照组（P<0.05），说明日粮中添加鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27可以有效提高蛋鸡的生产性能。

2、蛋壳质量测定

在22周龄到49周龄时每周有连续两天每天每个处理组随机抽取32只鸡蛋进行蛋壳质量测定，测定顺序及方法如下：

（1）蛋壳破碎强度：将完整的鸡蛋置于蛋壳强度测定仪（QC-SPA）上，选择相应程序进行测定。

（2）蛋壳相对重：将鸡蛋打碎，去除蛋黄和蛋清以及蛋壳内表层的蛋膜，将全部蛋壳放置已知重量的开盖培养皿中，置于45℃恒温干燥箱中过夜，至恒重后称重，计算蛋壳相对重。蛋壳相对重=蛋壳重/全蛋重×100%

（3）蛋壳厚度：使用蛋壳厚度计测定蛋的锐端、钝端和中部3部分的蛋壳厚度，取其平均值作为蛋壳厚度。

（4）蛋壳密度：称蛋壳重，测蛋长径、短径，按公式1蛋壳密度（mg/cm²）=蛋壳重（mg）/蛋壳表面积（cm²）和公式2蛋壳表面积（cm²）=3.279B（L+B/2）进行计算并统计，其中B为蛋的短径（cm），L为蛋的长径（cm）。

（5）破软壳率：每天相同时间对每组中各重复的破软壳蛋数目进行记录，计算当天每重复的破软壳率。破软壳率=破软壳数目/日产蛋数

表2.日粮中添加LactobacillusrhamnosusW27对产蛋鸡蛋壳质量的影响

指标对照组低剂量组高剂量组蛋壳破碎强度（g/cm²）2.87±0.31^a3.17±0.17^b3.36±0.62^c蛋壳相对重量（%）9.93±0.17^>10.73±0.24^>10.82±0.31^>蛋壳厚度（mm）0.37±0.240.38±0.110.38±0.21蛋壳密度（mg/ cm²）70.31±2.17^a75.26±1.34^b74.64±2.06^b破软壳率（%）1.72±0.64^b0.63±0.41^a0.64±0.37^a

注：同行上标小写字母不同表示差异显著（P<0.05），同行上标字母相同或无标注则表示差异不显著（P>0.05）。

表2试验结果表明，试验组鸡蛋的蛋壳破碎强度、蛋壳相对重量和蛋壳密度均显著高于对照组（P<0.05），而破软壳率显著低于对照组（P<0.05），说明日粮中添加鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27可以有效改善鸡蛋蛋壳品质并提高蛋壳强度。

3、血液生化指标测定

试验的第20，40天采集血样，清晨喂料前，每个重复随机取10只，心脏采血5mL注入试管，标号离心分装于eppendorf管中，-20℃冰箱保存备检。采用全自动生化分析仪测定血清钙（邻甲酚酞络合铜比色法）、磷（钼蓝法）和碱性磷酸酶（AKP）活性；血清钙、磷和碱性磷酸酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所，操作按照试剂盒上的说明书进行。

表3.日粮中添加LactobacillusrhamnosusW27对产蛋鸡血清钙磷含量的影响

指标对照组低剂量组高剂量组钙（mM）4.67±0.43^a5.27±0.31^b5.53±0.47^c磷（mM）2.26±0.132.25±0.312.24±0.14碱性磷酸酶（U/L）546.37±34.21^>527.31±46.28^>486.26±52.11^>

注：同行上标小写字母不同表示差异显著（P<0.05），同行上标字母相同或无标注则表示差异不显著（P>0.05）。

表3试验结果表明，日粮中添加LactobacillusrhamnosusW27对血清磷含量没有显著影响（P>0.05），试验组血清钙含量比对照组分别提高12.8%（低剂量组）和18.4%（高剂量组），血钙含量直接关系到蛋壳质量和产蛋量。而碱性磷酸酶作为成骨细胞成熟的标志，也是反映骨骼代谢的一项重要指标，而蛋鸡血清碱性磷酸酶主要来自骨骼，血液中钙离子含量升高，促使成骨细胞活动增强，骨骼钙化和矿化作用随之增强，所以血清碱性磷酸酶活性显著降低（P<0.05）。

综上所述，所述的鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27可以用于制备提高蛋壳强度和改善蛋鸡生产性能的饲料添加剂。

乳酸杆菌的抗逆性差，因此乳酸杆菌的应用过程中使用剂量和保护技术至关重要，乳酸杆菌首先经过胃液的低pH值，以及肠道中各种消化酶的不利作用才能到达肠道的特定位置，在这个过程中菌种的存活率和代谢活性都受到很大的影响。并且只有当动物摄入的乳酸杆菌数量足够时，乳酸杆菌才能发挥正常的生理功能。

目前提供乳酸杆菌在动物肠道中的存活率是研究的重点，提高乳酸杆菌存活率的方法有很多种，比如选择耐受性强的菌株，在益生菌中添加化学益生素或其他物质，提高乳酸杆菌对不良环境的抗逆能力。然而，这些方法与微胶囊包被技术相比有一定的局限性，微胶囊技术是领用合成或天然的高分子材料，将益生菌菌株包裹呈微笑颗粒的技术。它能够使菌株与外界环境隔绝，从而起到保护作用。利用微胶囊包被技术制备的乳酸杆菌微胶囊不仅要耐低pH值环境、胆汁以及各种消化酶的作用，还要能在特定的肠道位点快速释放发挥有益作用。

因此可以进一步将用于提高蛋壳强度、改善蛋鸡生产性能的鼠李糖乳酸杆菌LactobacillusrhamnosusW27制备成微胶囊制剂，应用于临床生产和商业应用，通过微胶囊技术可以提高乳酸杆菌耐受胃酸、胆盐和各种消化酶的能力，还可提高乳酸杆菌定植于肠道中的数量。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

SEQUENCELISTING

<110>青岛根源生物技术集团有限公司

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