非肽类蛋白酶体抑制剂、其药物组合物、制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种非肽类蛋白酶体抑制剂、其药物组合物、制备方法和应用。本发明的化合物结构新颖，可在体外或体内抑制蛋白酶体介导的肽水解或蛋白质降解的能力，从而有效治疗经由受蛋白酶体活性调控的蛋白质所介导的病症的药物和/或癌症。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及化合物及其制备方法与应用，特别是涉及一种非肽类 蛋白酶体抑制剂、其药物组合物、制备方法和应用。

背景技术

泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasomepathway，UPP)由泛素、蛋白酶体和 一系列的酶(泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3)组成。蛋白酶体是多亚基大分子 复合物，具有多个酶活性位点，能降解泛素化的胞内蛋白，在UPP中发挥着关键作用。26S蛋 白酶体由20S核心颗粒和1～2个19S调节复合物组成。19S调节复合物能特异性识别泛素化 的靶蛋白，并改变其构象，使靶蛋白脱泛素进入20S核心颗粒。20S核心颗粒由4个并列的中 空圆柱状颗粒构成：两端各有一个α环，α环由7个不同的α亚基(α1-α₇)构成；中间有两个β 环，β环由7个不同的β亚基(β₁-β₇)构成。β亚基中有3类亚基具有催化活性：分别是β₁，半胱天 冬酶样或肽酰谷氨酰多肽水解酶(CaspaseLikeorPeptidylGlutamyl-Peptide Hydrolysin，C-LorPGPH)位点，水解酸性氨基酸；β₂，胰蛋白酶样(TrypsinLike，T-L)位 点，水解碱性氨基酸；β₅，糜蛋白酶样(ChymotrypsinLike，CT-L)位点，水解疏水性氨基酸。

泛素-蛋白酶体途径在各种重要生理过程中起关键作用，如调控细胞周期、肿瘤生 长和转移等。在细胞周期期间许多关键调控蛋白质(包括细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依 赖性激酶p21和p27^KTP1)通过泛素-蛋白酶体途径而暂时性地被降解。细胞需要这些蛋白质 的有序降解以加快细胞周期并进行有丝分裂。转录调控也需要泛素-蛋白酶体途径。转录因 子NF-κB的活化受到蛋白酶体介导的抑制蛋白IκB降解的调控。NF-κB又对调控涉及免疫反 应和炎症反应的基因起重要作用。肿瘤抑制因子p53是一种转录因子，控制着细胞周期的启 动，当细胞损伤较大、不能够被修复时，p53蛋白会促使细胞进行凋亡。p53蛋白可促进MDM2 (E3泛素连接酶)的表达，并与MDM2结合，形成泛素化p53蛋白，泛素化p53蛋白能很快被蛋白 酶体降解。细胞粘附分子(例如E-选择蛋白、TCAM-1和VCAM-1)的表达需要泛素-蛋白酶体途 径。细胞粘附分子通过引导肿瘤细胞向体内远处组织位点粘附和外渗以及从脉管系统向体 内远处组织位点粘附和外渗而涉及于体内(invivo)肿瘤转移和血管生成。蛋白酶体抑制 剂已成为抗肿瘤的重要策略，并且在自身免疫性疾病及炎症领域的应用也已有所尝试 (Verbruggeetal.ArthritisResearch&Therapy，2015，17：17)。

蛋白酶体抑制剂主要有肽醛类、肽硼酸类、肽环氧酮类、肽乙烯基砜类、β内酯类及 其它类化合物。肽硼酸类蛋白酶体抑制剂硼替佐米((Bortezomib)商品名VELCADE：N-2-吡 嗪羰基-L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸)是第一个用于临床的蛋白酶体抑制剂，在 2003年和2006年分别通过美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗多发性骨髓瘤(MM) 和套细胞淋巴瘤(MCL)。肽环氧酮类肽蛋白酶体抑制剂卡非佐米((Carfilzomib)商品名 Kyprolis)于2012年经FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤(MM)，成为第二个上市的蛋白酶体类 抗肿瘤药物。肽硼酸类蛋白酶体抑制剂埃沙佐米((Ixazomibcitrate)商品名Ninlaro)于 2015年经FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤(MM)，成为第二个上市的肽硼酸类蛋白酶体抑制 剂。已上市药物及已报道的硼酸类蛋白酶体抑制剂如WO1996/013266，WO2005/021558， WO2005/016859，WO2006/086600，WO2009/020448，WO2010/012222，WO2011/109355，WO2011/ 026349，WO2011/087822，WO2013/092979等多为肽类骨架，体内稳定性不高，在血浆中的半 衰期过短，清除率很快(Milleretal.JMedChem，2015，58：2036-41)，而非肽类骨架的蛋 白酶体抑制剂可克服以上缺陷，具有明显优势。具有非肽类骨架且有较好活性的蛋白酶体 抑制剂并不多，如β内酯类的SalinosporamideA(NPI-0052)(Felingetal.AngewChem IntEd，2003，115：369-371)，而非肽硼酸类蛋白酶体抑制剂则更加少见。上述现状亟待解 决。

发明内容

本发明提供了一种结构新颖的非肽类蛋白酶体抑制，其药物组合物、制备方法和 应用。本发明的非肽类蛋白酶体抑制剂能够抑制体外(invitro)和体内(invivo)蛋白酶 体活性。

本发明提供了一种通式(I)所示的化合物，其药学上可接受的盐、硼酸酐或硼酸 酯：

其中：

R₁为氢、取代或未取代的C_1-12烷基、取代或未取代C_3-12环烷基、卤素、羟基或 巯基

R₂为氢、取代或未取代的C_1-12烷基、取代或未取代C_3-12环烷基、取代或未取代的 C_6-20芳基或者取代或未取代的C_2-20杂环基；所述的取代或未取代的C_2-20杂环基是指杂原子 为N、O或S，杂原子数为1-4个的取代或未取代的C_2-20杂环基；

R₁和R₂中，所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳 基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代是指被下列取代基中的一个或多个所取代(当 取代基为多个时，所述的取代基相同或不同)：C_1-6烷基、C_6-14芳基取代的C_1-6烷基、C_3-8环烷 基、C_1-6烷基取代的C_3-8环烷基、C_2-8烯基、C_2-8炔基、氰基、羧基、硝基、卤素取 代的C_1-6烷基、卤素、C_1-6烷氧基、C_6-14芳基取代的C_1-6烷氧基、C_6-14芳基、C_1-6烷基取代的C_6-14芳基、卤素取代的C_6-14芳基、羟基、C_1-6烷基硫基、C_1-6烷基亚磺酰基、C_1-6烷基磺酰基、C_6-14芳 基硫基、C_6-14芳基亚磺酰基或C_6-14芳基磺酰基；其中，R^a和R^b独立地为氢、C_1-6烷基或C_6-14芳基 取代的C_1-6烷基；R^c为C_1-6烷氧基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷基所取代时，所述的C_1-6烷基优选 C_1-4烷基。所述的C_1-4烷基优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_6-14芳基取代的C_1-6烷基所取代时，所述 的C_6-14芳基取代的C_1-6烷基中，所述的C_6-14芳基优选苯基、萘基、蒽基或菲基；所述的C_1-6烷基 优选C_1-4烷基；所述的C_1-4烷基优选甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。所 述的C_6-14芳基取代的C_1-6烷基优选苯甲基、苯乙基或萘甲基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_3-8环烷基所取代时，所述的C_3-8环烷基 优选C_3-6环烷基。所述的C_3-6环烷基优选环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷基取代的C_3-8环烷基所取代时，所 述的C_1-6烷基取代的C_3-8环烷基中，所述的C_1-6烷基优选C_1-4烷基，所述的C_1-4烷基优选甲基、 乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基；所述的C_3-8环烷基优选C_3-6环烷基。所述的 C_3-6环烷基优选环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_2-8烯基所取代时，所述的C_2-8烯基优选 C_2-4烯基。所述的C_2-4烯基优选乙烯基、丙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基或2-甲基丙烯 基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_2-8炔基所取代时，所述的C_2-8炔基优选 C_2-4炔基。所述的C_2-4炔基优选乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基或3-甲基- 二丙炔基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被所取代，R^a和R^b独立地为C_1-6烷 基时，R^a和R^b中，所述的C_1-6烷基优选C_1-4烷基。所述的C_1-4烷基优选甲基、乙基、正丙基、异丙 基、正丁基、异丁基或叔丁基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被所取代，R^a和R^b独立地为C_6-14芳 基取代的C_1-6烷基时，R^a和R^b中，所述的C_6-14芳基取代的C_1-6烷基中所述的C_6-14芳基优选苯 基、萘基、蒽基或菲基；所述的C_1-6烷基优选C_1-4烷基。所述的C_1-4烷基优选甲基、乙基、正丙 基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。所述的C_6-14芳基取代的C_1-6烷基优选苯甲基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被所取代，R^c为C_1-6烷氧基时，R^c中， 所述的C_1-6烷氧基优选C_1-4烷氧基。所述的C_1-4烷氧基优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧 基、正丁氧基、异丁氧基或叔丁氧基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被卤素取代的C_1-6烷基所取代时，所述的 卤素取代的C_1-6烷基优选被一个或多个F、Cl、Br或I所取代的C_1-4烷基。所述的被一个或多个 F、Cl、Br或I所取代的C_1-4烷基优选三氟甲基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被卤素所取代时，所述的卤素优选F、Cl、 Br或I。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷氧基所取代时，所述的C_1-6烷氧基 优选C_1-4烷氧基。所述的C_1-4烷氧基优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异 丁氧基或叔丁氧基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_6-14芳基取代的C_1-6烷氧基所取代时，所 述的C_6-14芳基取代的C_1-6烷氧基中，所述的C_6-14芳基优选苯基、萘基、蒽基或菲基；所述的C_1-6烷氧基优选C_1-4烷氧基。所述的C_1-4烷氧基优选甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧 基、异丁氧基或叔丁氧基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_6-14芳基所取代时，所述的C_6-14芳基优 选苯基、萘基、蒽基或菲基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷基取代的C_6-14芳基所取代时，所述 的C_1-6烷基取代的C_6-14芳基中所述的C_1-6烷基优选C_1-4烷基。所述的C_1-4烷基优选甲基、乙基、 正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。所述的C_6-14芳基优选苯基、萘基、蒽基或菲基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被卤素取代的C_6-14芳基所取代时，所述的 卤素取代的C_6-14芳基优选被一个或多个F、Cl、Br或I取代的C_6-14芳基；所述的C_6-14芳基优选 苯基、萘基、蒽基或菲基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷基硫基所取代时，所述的C_1-6烷基 硫基是指巯基上的氢被C_1-6烷基所取代。所述的C_1-6烷基硫基优选C_1-4烷基硫基。所述的C_1-4烷基硫基优选

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷基亚磺酰基所取代时，所述的C_1-6烷基亚磺酰基是指亚磺酰基上的氢被C_1-6烷基所取代。所述的C_1-6烷基亚磺酰基优选C_1-4烷 基亚磺酰基。所述的C_1-4烷基亚磺酰基优选

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_1-6烷基磺酰基所取代时，所述的C_1-6烷 基磺酰基是指磺酰基中的氢被C_1-6烷基所取代。所述的C_1-6烷基磺酰基优选C_1-4烷基磺酰基。 所述的C_1-4烷基磺酰基优选

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_6-14芳基硫基所取代时，所述的C_6-14芳 基硫基是指巯基上的氢被C_6-14芳基所取代。所述的C_6-14芳基硫基优选苯基巯基或萘基巯基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_6-14芳基亚磺酰基所取代时，所述的 C_6-14芳基亚磺酰基是指亚磺酰基上的氢被C_6-14芳基所取代。所述的C_6-14芳基亚磺酰基优选 苯基亚磺酰基或萘基亚磺酰基。

R₁和R₂中，当所述的取代的C_1-12烷基、所述的取代的C_3-12环烷基、所述的取代的C_6-20芳基和所述的取代的C_2-20杂环基中所述的取代为被C_6-14芳基磺酰基所取代时，所述的C_6-14芳基磺酰基是指磺酰基中的氢被C_6-14芳基所取代。所述的C_6-14芳基磺酰基优选苯基磺酰基 或萘基磺酰基。

R₁和R₂中，所述的取代或未取代的C_1-12烷基优选取代或未取代的C_1-6烷基。所述的 取代或未取代的C_1-6烷基优选取代或未取代的C_1-4烷基。所述的取代或未取代的C_1-4烷基优 选取代或未取代的甲基(例如)、取代或未取代的乙基、取代或未取代的正丙基、取代或 未取代的异丙基(例如)、取代或未取代的正丁基、取代或未取代的异丁基(例如)或者取代或未取代的叔丁基。所述的取代的C_1-12烷基优选

R₁和R₂中，所述的取代或未取代C_3-12环烷基优选取代或未取代的C_3-8环烷基。所述 的取代或未取代的C_3-8环烷基优选取代或未取代的环丙基、取代或未取代的环丁基、取代或 未取代的环戊基或者取代或未取代的环己基。

R₁中，所述的卤素优选F、Cl、Br或I。

R₂中，所述的取代或未取代的C_6-20芳基优选取代或未取代的C_6-14芳基。所述的取代 或未取代的C_6-14芳基优选取代或未取代的苯基、取代或未取代的萘基、取代或未取代的蒽 基或者取代或未取代的菲基。

R₂中，所述的取代或未取代的C_2-20杂环基优选取代或未取代的C_2-14杂环基。所述的 取代或未取代的C_2-20杂环基中所述的C_2-20杂环基可以是饱和的或不饱和的，优选包括吡啶 基，嘧啶基，呋喃基，噻吩基，吡咯基，吡唑基，咪唑基，四唑基，苯并呋喃基，苯并噻吩基，吲 哚基，二氢吲哚基，喹啉基吡咯烷基，异喹啉基，苯并咪唑基，哌啶基，吡咯烷基，四氢呋喃 基，四氢喹啉基，四氢异喹啉基，十氢喹啉基，八氢异喹啉基，三嗪基，噻蒽基，吡喃基，哒嗪 基，嘌呤基，喹唑啉基，吩噻嗪基，苯并二氢吡喃基，吡咯烷基，咪唑烷基，吡唑烷基，哌嗪基 或吗啉基。

本发明所述的通式(I)所示的化合物的药学上可接受的盐，通常是指通式(I)所示 的化合物与药学上可接受的酸或碱形成的盐。其中所述的酸可为本领域常规的酸，例如无 机酸或有机酸。所述的无机酸优选盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸或硫酸。所述的有机酸优选甲 酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1，5)、亚细亚酸、甘珀酸、甘草次酸、齐墩果酸、山楂酸、熊 果酸、科罗索酸、白桦酸、桃檬酸、乳香酸、草酸、酒石酸、乳酸、水杨酸、苯甲酸、戊酸、二乙基 乙酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、庚二酸、己二酸、马来酸、苹果酸、氨基磺酸、环己烷氨基磺 酸、新戊酸、苯丙酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸或氨基 酸。所述的碱可为本领域常规的碱，优选氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠或氨基化合 物(如胆碱氢氧化物，Tris，bis-Tris，N-甲基葡糖胺或精氨酸)。

本文中所用的术语“硼酸”是指含有-B(OH)₂基团的化合物。在一些实施例中，硼酸 化合物可通过使硼酸部分脱水而形成寡聚酸酐。举例来说，斯奈德(Snyder)等人，美国化学 会志(J.Am.Chem.Soc.)80：3611(1958)报导了寡聚芳基硼酸。

本文中所使用的术语“硼酸酐”是指由两个或两个以上硼酸化合物分子结合同时 失去一个或多个水分子所形成的化合物。当与水混合时，硼酸酐化合物被水化而释放游离 硼酸化合物。在各种实施例中，硼酸酐可含有两个、三个、四个或四个以上硼酸单元，并且可 具有环状或线性构型。在一些实施方案中，硼酸酐化合物几乎以单一低聚形式存在；然而， 硼酸酐也包括不同低聚硼酸酐及游离硼酸的混合物。本发明硼酸化合物的寡聚硼酸酐非限 制性实例如下所示。

在式(1)和(2)中，代号n为0至约10的整数，优选为0、1、2、3或4；

W表示式(II)：

其中各基团R₁，R₂的定义如前所述。

本发明硼酸化合物的硼酸酯可通过硼酸化合物的酸基团与羟基化合物进行缩合 反应制备。在各种情况下，本发明硼酸化合物的硼酸酯中与硼连接的羟基化合物部分的原 子为氧原子。

在某些实施例中，与硼酸化合物的酸基团反应的羟基化合物是二羟基化合物，优 选频哪醇，全氟频哪醇，蒎烷二醇，乙二醇，二甘醇，1，2-环己烷二醇，1，3-丙二醇，2，3-丁二 醇，甘油或二乙醇胺。

在某些实施例中，与硼酸化合物的酸基团反应的羟基化合物是α-羟基羧酸。α-羟 基羧酸是指含有直接与相对于羧酸基位于α位置的碳原子连接的羟基的化合物，但不限于 仅具有一个羟基及一个羧酸基的化合物，如乳酸、乙醇酸、苹果酸、六氢扁桃酸、柠檬酸、2- 羟基异丁酸、扁桃酸、2-羟基-3，3-二甲基丁酸、2-羟基-3-甲基丁酸、2-羟基异己酸、二苯基 乙醇酸及酒石酸。

在某些实施例中，与硼酸化合物的酸基团反应的羟基化合物是β-羟基羧酸。β-羟 基羧酸是指含有直接与相对于羧酸基位于β位置的碳原子连接的羟基的化合物，但不限于 仅具有一个羟基及一个羧酸基的化合物，如苹果酸、柠檬酸、3-羟基丁酸、β-羟基异戊酸、水 杨酸及酒石酸。

在某些实施例中，硼酸酯部分为5元环。在某些其它实施例中，硼酸酯部分为6元 环。在某些其它实施例中，硼酸酯部分为5元环与6元环的混合物。

在本发明一优选实施方式中，所述的通式(I)所示的化合物，其药学上可接受的 盐、硼酸酐或硼酸酯中，R₁优选氢或者取代或未取代的C_1-12烷基；R₂优选氢、卤素或者取代或 未取代的C_1-12烷基。

所述的通式(I)所示的化合物优选为下列任一化合物：

本发明还提供了一种所述的通式(I)所示的化合物的制备方法，其包括下列步骤： 溶剂中，在硼酸酯交换剂存在的条件下，在酸的作用下，将如式(III)所示的化合物进行如 下所示的水解反应，制得通式(I)所示的化合物：

其中，R₁和R₂的定义均同前所述。

所述的通式(I)所示的化合物的制备方法中，所述的水解反应的条件可为有机合 成领域此类反应常规的条件。本发明优选下列条件：所述的溶剂优选水和有机溶剂的混合 溶剂。所述的有机溶剂优选C₁-C₄醇类溶剂和/或烷烃类溶剂，进一步优选C₁-C₄醇类溶剂和 烷烃类溶剂的混合溶剂。所述的C₁-C₄醇类溶剂优选甲醇和/或乙醇。所述的烷烃类溶剂优选 正己烷。所述的C₁-C₄醇类溶剂和烷烃类溶剂的混合溶剂中，所述的C₁-C₄醇类溶剂和所述的 烷烃类溶剂的用量关系可不作具体限定，只要不影响反应的进行，即可，二者体积比优选1∶ 1。所述的水和有机溶剂的混合溶剂中，水和有机溶剂的用量关系可不作具体限定，只要不 影响反应的进行，即可。所述的溶剂的用量可不作具体限定，只要不影响反应的进行，即可， 所述的溶剂与如式(III)所示的化合物的体积摩尔比优选为15mL/mmol-25mL/mmol。所述的 硼酸酯交换剂可为有机合成领域此类反应常规的交换剂，优选C₁-C₄的烷基硼酸和/或苯硼 酸，进一步优选异丁基硼酸。所述的交换剂与所述的如式(III)所示的化合物的用量可为有 机合成领域此类反应常规的用量，所述的交换剂与所述的如式(III)所示的化合物的摩尔 比优选3∶1-10∶1，进一步优选4∶1-6∶1(例如5∶1)。所述的酸可为有机合成领域此类反应常 规的酸，优选无机酸。所述的无机酸优选盐酸水溶液。所述的盐酸水溶液的摩尔浓度优选 1mol/L。所述的酸的用量可为有机合成领域此类反应常规的用量，其与如式(III)所示的化 合物的摩尔比优选2∶1-3∶1，优选2.5∶1。所述的水解反应的温度优选为-10℃-35℃，进一步 优选-5℃-25℃。所述的水解反应的进程可采用本领域常规的检测方法进行监测(例如TLC、 HNMR、HPLC或GC等)，一般以如式(III)所示的化合物消失时作为反应的终点。所述的水解反 应的时间优选10-25小时。

所述的水解反应结束后，还可进一步包含后处理的操作。所述的后处理的方法和 条件可为有机合成领域此类反应后处理常规的方法和条件，本发明优选包括下列步骤：将 上述水解反应结束后的反应液，分液，有机层用烷烃类溶剂萃取，除去有机层中的有机溶 剂，向浓缩物中加入水和卤代烃类溶剂(例如二氯甲烷)，除去有机层(除去卤代烃溶剂)中 的有机溶剂，得粗品，用醚类溶剂(例如乙醚)洗涤，即得通式(I)所述的化合物。

本发明通式(I)所示的化合物的合成路线优选为：

该反应式中各基团R₁，R₂的定义如前所述，X为氢或氯。

其中所用(TPLM)可通过所属领域技术人员已知的方法来制备。参 见，例如亚当斯(Adams)等人的美国专利第5,780,454号；皮格斯吉尔(Pickersgill)等人的 国际专利公开案WO2005/097809。

本发明还提供了一种所述的通式(I)所示的化合物、其药学上可接受的盐、硼酸酐 或硼酸酯作为蛋白酶体抑制剂在制备用于治疗经由受蛋白酶体活性调控的蛋白质所介导 的病症的药物和/或癌症药物中的应用。

因此，在另一方面中，本发明提供一种抑制细胞中蛋白酶体的一种或多种肽酶活 性的方法，其包含使需要蛋白酶体抑制的细胞与本文所述的化合物或其药学上可接受的 盐、硼酸酯或硼酸酐相接触。

本发明化合物适用于治疗经由受蛋白酶体活性调控的蛋白质(例如，NFκB、p27^kip、 p21^WAF/CIP1、p53)所介导的病症。相关病症包括炎性病症(例如，类风湿性关节炎、炎症性肠 病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨关节炎、皮肤病(例如，异位性皮炎、牛皮癣))、血管增 殖性病症(例如，动脉粥样硬化症、再狭窄)、眼部增殖性病症(例如，糖尿病性视网膜病变)、 良性增殖性病变(例如，血管癌)、自身免疫疾病(例如，多发性硬化、组织和器官排斥反应)， 以及与感染相关的炎症(例如，免疫反应)、神经退行性病症(例如，阿尔兹海默症 (Alzheimer’sdisease)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease)、运动神经元疾病、神经病理 性疼痛、三联体重复病症(tripletrepeatdisorder)、星形细胞瘤和由酒精性肝病导致的 神经退化)、缺血性损伤(例如，中风)和恶病质(例如，伴随各种生理病理状态的加速肌肉蛋 白降解(例如，神经损伤、绝食、发烧、酸中毒、HIV感染、癌症和某些内分泌病))。

本发明化合物特别适用于治疗癌症。本文中所使用的术语“癌症”是指一种细胞病 症，其特征为不受控制或失调的细胞增殖、降低的细胞分化、不适当地侵袭周围组织的能 力/或在异位位点形成新的生长能力。术语“癌症”包括(但不限于)实体肿瘤或血液肿瘤。术 语“癌症”涵盖皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”还包括原发癌和 转移癌。所述的癌症的肿瘤细胞优选白血病细胞(例如HL60)、骨髓瘤细胞(例如RPMI 8226)、非小细胞肺癌细胞(例如A549)、乳腺癌细胞(例如MDA-MB-231)和卵巢癌细胞(例如 A2780)中的一种或多种。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述的通式(I)所述的化合物、其药学上 可接受的盐、硼酸酐和硼酸酯中的一种或多种。

在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳 实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明的非肽类蛋白酶体抑制剂结构新颖，可在体外或体内抑制蛋白酶体介导的 肽水解或蛋白质降解的能力。

具体实施方式：

缩略语：

TPLM：(R)-1-氨基-3-甲基丁基硼酸蒎烷二醇酯三氟乙酸盐

TBTU：O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺

DCM：二氯甲烷

IBBA：异丁基硼酸

Et：乙基

实施例一：N-2-(3-氯-1，4-萘醌)-甘氨酸-L-亮氨酸硼酸(1a)的合成

步骤1：N-2-(3-氯-1，4-萘醌)-甘氨酸(1a-1)的合成

在100ml的圆底烧瓶中，加入500mg(2.20mmol)2，3-二氯-1，4-萘醌(1)，25mL乙醇。 495mg(6.60mmol)甘氨酸(Gly)溶于5.5mL1NNaOH(5.5mmol)，搅拌下滴加入上述溶液，室 温搅拌4h。加入20mL水，1N盐酸调pH值为3，减压浓缩除去乙醇，低温放置1小时，抽滤，真空 干燥，得红色粉末450mg，收率88.0％。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ7.99(brd，1H，J＝6.78Hz)，δ7.96(brd，1H，J＝ 6.78Hz)，7.84(dt，1H，J＝6.78Hz，0.72Hz)，7.76(dt，1H，J＝6.78Hz，0.72Hz)，7.59(brs， 1H，加D₂O消失)，4.33(d，2H，J＝6.12Hz)。

步骤2：(1S，2S，3R，5S)-蒎烷二醇-N-2-(3-氯-1，4-萘醌)甘氨酸-L-亮氨酸硼酸酯 (1a-2)的合成

向氮气保护的100mL三颈瓶中加入129mg(0.48mmol)1a-1，273mg(0.72mmol)TPLM， 170mg(0.53mmol)TBTU以及25mLDCM。降温至0℃，缓慢滴加165μL(1.44mmol)DIPEA(溶于 5mLDCM)，反应2h浓缩，加入10mL乙酸乙酯，有机层依次以水洗(20mLx3)，3％柠檬酸洗 (20mLx3)，水洗(20mLx3)。有机层以无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离，洗脱剂为石油醚∶ 乙酸乙酯＝3∶1(v/v)，得橘黄色固体120mg，收率48.1％。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.07(brd，1H，J＝7.53Hz)，7.99(brd，1H，J＝ 7.53Hz)，7.68(dt，1H，J＝7.53Hz，0.69Hz)，7.59(dt，1H，J＝7.53Hz，0.69Hz)，6.70(brs， 1H，加D₂O后消失)，5.58(brs，1H，加D₂O后消失)，4.43(d，2H，J＝5.19Hz)，4.27(d，1H，J＝ 7.41Hz)，3.41(d，1H，J＝6.99Hz)，2.27(m，1H)，2.15(m，1H，)，1.97(t，2H，J＝4.86Hz)，1.81 (t，2H，J＝5.58Hz)，1.60(t，2H，J＝6.30Hz)，1.46(t，2H，J＝7.56Hz)，1.35(s，3H)，1.23(s， 3H)，0.87(d，6H，J＝6.33Hz)，0.78(s，3H)。

步骤：3：N-2-(3-氯-1，4-萘醌)-甘氨酸-L-亮氨酸硼酸(1a)的合成

向氮气保护的50ml三颈瓶中加入350mg(0.68mmol)的1a-2，7.5mL甲醇，7.5mL正己 烷，搅拌，加入347mg(3.41mmol)IBBA。降温至0℃，缓慢滴加1.7mL1NHCl，滴毕室温反应 18.5h。分液，甲醇层用正己烷萃取(10mLx3)，浓缩甲醇层。加入10mL水和10mLDCM，分液，浓 缩有机层，得粗品，粗品用乙醚洗涤。得红色粉末172mg，收率66.6％。

m.p.182℃-185℃。

IR(KBr)：3303，2957，2868，2366，2356，1672，1607，1576，1220，711，682。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.75(brs，1H，加D₂O后消失)，7.91(brd，1H，J＝ 7.05Hz)，7.89(brd，1H，J＝7.05Hz)，7.76(dt，1H，J＝7.05Hz，1.26Hz)，7.69(dt，1H，J＝ 7.05Hz，1.26Hz)，7.51(brs，1H，-NH-)，4.39(d，2H，J＝6.57Hz)，2.53(m，1H)，1.51-1.45 (m，1H)，1.26-1.09(m，2H)，0.77(t，3H，J＝6.30Hz)，0.70(d，3H，J＝6.30Hz)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ180.231，176.007，171.894，167.879，135.298， 133.325，132.110，130.453，126.927，126.236，46.997，45.251，43.329，25.459，23.172， 22.322。

ESI-MS：m/z401(M+Na)⁺。

HRMS(ESI-TOF)(M-H)^-m/z：376.1124(计算值：376.1117相对误差＝1.71ppm)。

实施例二N-2-(3-甲基-1，4-萘醌)-L-亮氨酸-L-亮氨酸硼酸(2c)的合成

步骤1：N-2-(3-甲基-1，4-萘醌)-L-亮氨酸(2c-1)的合成

在250ml的圆底烧瓶中，加入1000mg(5.81mmol)甲萘醌(2)，50ml乙醇。2282mg (17.42mmol)L-亮氨酸(Leu)溶于14.5mL1NNaOH(14.5mmol)，搅拌下滴加入上述溶液，室 温搅拌24h。浓缩，加入20mL水，抽滤，滤液用乙酸乙酯洗涤(20mLx3)，水层加入1N盐酸调pH 值为3，乙酸乙酯提取(20mLx3)，浓缩乙酸乙酯层，柱层析分离，洗脱剂为DCM∶甲醇＝20∶1 (v/v)，真空干燥，得红色固体445mg，收率24.7％。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ12.8(s，1H，加D₂O后消失)，7.93(brd，1H，J＝ 6.69Hz)，7.90(brd，1H，J＝6.69Hz)，7.72(dt，1H，J＝6.69Hz，1.2Hz)，7.64(dt，1H，J＝ 6.69Hz，1.2Hz)，6.01(brs，1H，加D₂O后消失)，4.59(m，1H)，1.92(s，3H)，1.67(m，2H)，1.09 (m，1H)，0.85(q，6H)。

步骤2：(1S，2S，3R，5S)-蒎烷二醇-N-2-(3-甲基-1，4-萘醌)甘氨酸-L-亮氨酸硼酸 酯(2a-2)的合成

采用与1a-2相同的方法，以150mg(0.40mmol)2c-1，212mg(0.56mmol)TPLM，141mg (0.44mmol)TBTU，140μL(1.20mmol)DIPEA，25mlDCM为原料，得橘黄色固体145mg，收率 66.5％。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.05(brd，1H，J＝6.90Hz)，7.99(brd，1H，J＝ 6.90Hz)，7.67(dt，1H，J＝6.90Hz，0.90Hz)，7.58(dt，1H，J＝6.90Hz，0.90Hz)，6.49(brs， 1H，加D₂O后消失)，5.55(brs，1H，加D₂O后消失)，4.27(t，1H，J＝7.20Hz)，4.17(d，1H)，3.24 (q，1H)，2.33(m，1H)，2.21(m，1H)，2.10(s，3H)，1.99(m，1H)，1.86(m，2H)，1.81(m，2H)，1.71 (m，1H)1.52(q，2H)，1.40(q，2H)，1.36(s，3H)，1.27(s，3H，)，1.24(s，3H)，0.92(d，3H，J＝ 6.60Hz)，0.83(s，3H)，0.78(s，3H)。

步骤3：N-2-(3-甲基-1，4-萘醌)-L-亮氨酸-L-亮氨酸硼酸(2c)的合成

采用与1a相同的方法，以300mg(0.54mmol)的2c-2，6ml甲醇，6ml正己烷，278mg (2.73mmol)IBBA，1.4mL1NHCl为原料，DCM∶异丙醚＝1∶6洗涤，得红色粉末113mg，收率 50.2％，mp143℃-145℃。

IR(KBr)：3421，2970，2362，2344，1670，1560，1508，1121，721，669。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.70(brs，1H，加D₂O后消失)，7.93(brd，1H，J＝ 6.90Hz)，7.90(brd，1H，J＝6.90Hz)，7.78(dt，1H，J＝6.90Hz，0.72Hz)，7.70(dt，1H，J＝ 6.90Hz，0.72Hz)，6.14(brs，1H，加D₂O后消失)，4.60(s，1H)，2.53(s，1H，)，1.99(s，3H)， 1.79-1.63(m，1H)，1.60-1.50(m，2H)，1.31-1.10(m，1H)，1.09(m，2H)，0.90(d，3H，J＝ 5.70Hz)，0.81(d，3H，J＝5.70Hz)，0.73(d，6H，J＝4.80Hz)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ182.851，182.211，171.834，146.592，135.042， 133.008，132.863，130.466，126.052，125.998，114.012，56.645，43.035，25.196，24.736， 23.587，23.219，22.529，22.069，11.219。

ESI-MS：m/z437(M+Na)⁺。

HRMS(ESI-TOF)(M-H)^-m/z：412.2286(计算值：412.2290相对误差＝0.76ppm)。

实施例三N-(2-1，4-萘醌)-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(3e)的合成

步骤1：N-(2-1，4-萘醌)-L-苯丙氨酸(3e-1)的合成

在250ml的圆底烧瓶中，加入1000mg(6.32mmol)1，4-萘醌(3)，55mL乙醇。1566mg (9.48mmol)L-苯丙氨酸(Phe)溶于6.32mL1NNaOH(6.32mmol)，搅拌下滴加入上述溶液，室 温搅拌10min。浓缩，加入20mL水，抽滤，滤液用乙酸乙酯洗涤(20mLx3)，水层加入1N盐酸调 pH值为3，乙酸乙酯提取(20mLx3)，浓缩乙酸乙酯层，DCM重结晶，得红棕色粉末560mg，收率 27.5％。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ7.90(brd，1H，J＝7.08Hz)，δ7.85(brd，1H，J＝ 7.08Hz)，7.75(dt，1H，J＝7.08Hz，0.99Hz)，7.67(dt，1H，J＝6.90Hz，0.99Hz)，7.25-7.08 (m，5H)，7.06(brs，1H，加D₂O后消失)，5.68(s，1H)，4.49-4.39(m，1H)，3.17(d，2H，J＝ 4.38Hz)。

步骤2：(1S，2S，3R，5S)-蒎烷二醇-N-(2-1，4-萘醌)-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸酯 (3e-2)的合成

采用与1a-2相同的方法，以260mg(0.81mmol)3e-1，398(1.05mmol)TPLM，286mg (0.89mmol)TBTU，280μL(2.43mmol)DIPEA，60mLDCM为原料，得橘黄色固体250mg，收率 54.3％。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.02(brd，1H，J＝6.00Hz)，7.96(brd，1H，J＝ 6.00Hz)，7.71(dt，1H，J＝6.00Hz，1.35Hz)，7.61(dt，1H，J＝6.00Hz，1.35Hz)，7.22(s，5H)， 6.09(brs，1H，加D₂O后消失)，6.00(brs，1H，加D₂O后消失)，5.72(s，1H)，4.20(d，1H，J＝ 8.4Hz)，3.80(s，1H)，3.32(d，1H，J＝7.5Hz)，2.20(t，1H，J＝6.93Hz)，2.01(m，1H)，1.78(d， 2H，J＝5.91Hz)，1.72(s，1H)，1.39(q，2H，J＝7.59Hz)，1.26(s，3H)，1.14(s，2H)，0.95(d， 3H，J＝6.09Hz)，1.03(d，2H，J＝10.5Hz)，0.86(d，6H，J＝6.18Hz)，0.73(s，3H)。

步骤3：N-(2-1，4-萘醌)-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸(3e)的合成

采用与1a相同的方法，以250mg(0.44mmol)的3e-2，5mL甲醇，5mL正己烷，223mg (2.19mmol)IBBA，1.1mL1NHCl为原料，DCM∶乙醚＝1∶6洗涤，得红色粉末82mg，收率 42.9％，m.p.165℃-167℃。

IR(KBr)：2997，2926，2448，1676，1607，1571，1508，1343，1121，779，726。

¹H-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ8.83(brs，1H，加D₂O后消失)，7.83(brd，1H，J＝ 7.38Hz)，7.79(brd，1H，J＝7.38Hz)，7.70(dt，1H，J＝7.38Hz，1.44Hz)，7.62(dt，1H，J＝ 7.38Hz，1.44Hz)，7.52(brs，1H，加D₂O后消失)，7.07-7.18(m，5H)，5.57(s，1H)，4.37(d， 1H，J＝7.44Hz)，4.18(s，1H)，3.05(s，2H)，2.53(s，1H)，1.46-1.24(m，1H)，1.23-0.92(m， 2H)，0.72(brd，3H，J＝8.97Hz)，0.63(brd，3H，J＝8.97Hz)。

¹³C-NMR(DMSO-d₆，300MHz)：δ182.302，181..338，172.410，147.924，137.882， 136.922，135.376，132.843，130.593，129.689，128.633，126.924，126.382，125.793， 101.298，57.136，54.764，25.866，25.278，23.532，22.611。

ESI-MS：m/z457(M+Na)⁺。

HRMS(ESI-TOF)(M+Na)⁺m/z：456.1942(计算值：456.1942相对误差＝1.71ppm)。

以与实施例1，2或3类似的方法由适当的起始物质制备下表中的化合物。

实施例四20S蛋白酶体抑制活性检测

20S蛋白酶体试剂盒APT280购自Chemicon(Millipore)(默克密理博公司)，化合物 对蛋白酶体CT-L活性测试按以下步骤进行：(1)按照试剂盒说明稀释并分装试剂。(2)绘制 AMC标准曲线：以1∶2的比例稀释试剂盒中AMC标准液，8个浓度(12.5μM～0)，在荧光96孔板 中每孔加入100μL，380/460nm的波长下检测荧光强度。按照浓度梯度以及荧光强度绘制AMC 标准曲线。(3)自提蛋白酶体活性检测：NB4细胞株生长满后收于EP管中，以400μL裂解液重 悬，液氮反复冻融3次，在4℃，12000rpm下离心30min，分装待用。按照1∶2的比例稀释自提蛋 白酶体储备液，配置为4个浓度梯度，每孔加入10μL蛋白酶体和80μL1Xassay，之后加入蛋 白酶体底物工作液10uL，37℃避光孵育1.5h，在380/460nm的波长下检测荧光强度。(4)候选 化合物对蛋白酶体活性抑制作用检测：设置空白对照组、底物组、蛋白酶体组、蛋白酶体和 15个化合物以及阳性药物硼替佐米的混合物组。候选化合物用1Xassay稀释10倍。按照阳 性20S蛋白酶体的荧光强度，对自提蛋白酶体进行稀释。在荧光96孔板中依次加入下表中物 质，其中前三项依次加入后，室温孵育15min；之后加入蛋白酶体荧光底物，37℃避光孵育 1.5h，在380/460nm的波长下检测荧光强度。(5)检测的荧光强度按如下公式计算抑制率，对 4个浓度的抑制率使用SPSS软件进行计算得其IC₅₀值。

部分化合物的20S蛋白酶体抑制活性结果如下表：

化合物编号 100nM下抑制率，％ IC₅₀(SD)^a，nM 1a 67.65 n.d.^b1b 64.79 n.d. 1c 43.48 n.d. 1d 47.35 n.d. 1e 86.70 24.58(2.7) 2a 65.88 n.d. 2b 52.30 n.d. 2c 31.45 n.d. 2d 42.31 n.d. 2e 84.71 25.93(3.1) 3a 84.88 23.17(2.1) 3b 67.53 n.d. 3c 79.81 44.25(4.6) 3d 69.19 n.d. 3e 90.29 11.42(2.8) 硼替佐米 92.50 4.68(0.5)^c

^a每个IC₅₀值根据五个浓度梯度获得，每个浓度梯度平行测定两次。

^bn.d.＝未测定。

^c在当时实验条件下测得的阳性对照药硼替佐米的IC₅₀值。

实施例五抗增殖测定

通过实验测定酶活性较好的3a、3e化合物和上市硼酸药物硼替佐米(Bortezomib) 对不同组织来源的人肿瘤细胞株体外增殖能力的抑制作用。具体实验过程如下：

1.实验材料

1.1受试物：

Bortezomib、3a和3e化合物，DMSO配制，低温避光保存。

1.2试验试剂：

磺酰罗丹明B(SulforhodamineB，SRB)粉末：Sigma公司购买，保存于室温。

二甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司购买，保存于室温。

1.3实验用人肿瘤细胞株

实验所用细胞株购买自中科院上海细胞库，培养于RPMI1640、DMEM或F12的培养液 中，并加入10％灭活的胎牛血清(杭州四季青)，L-谷氨酰胺(GIBCO)2nmol/L，青霉素100IU/ mL和链霉素100g/mL。

2.实验内容

2.1人肿瘤细胞的接种

根据预实验测定细胞生长速率的结果，接种一定数量的肿瘤细胞于96孔培养板， 保证在整个试验中细胞处于对数生长期。

2.2给药

对于每次实验，设置阴性对照组(DMSO)，6、12和16号化合物处理组。6、12和16号化 合物设置5个以上浓度梯度，倍半稀释。每个浓度三个复孔。

2.3药液配制

称取6、12和16号化合物适量，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成1mM的原液，分装 保存于-20℃。临用前用新鲜培养液稀释成工作浓度。给药72小时后，检测细胞存活率。

2.4磺酰罗丹明B法(SRB法)测定6、12和16号化合物对细胞增殖的抑制作用

采用磺酰罗丹明B法(SRB)测定6、12和16号化合物对细胞增殖的抑制作用。6、12和 16号化合物作用细胞72小时后，弃去培养液，每孔加入预冷的10％三氯醋酸(TCA)溶液100μ L固定细胞，4℃冰箱放置1个小时，培养板各孔以去离子水洗涤5遍，以去除三氯醋酸溶液， 在空气中干燥后，每孔加入1％乙酸配制的SRB溶液(4mg/mL)50μL，室温下放置20分钟，弃去 各孔内液体后用1％乙酸洗涤5遍，洗净未结合的SRB染料后空气干燥，每孔加入pH＝10.5的 10mMTris-base(三羟甲基胺基甲烷)溶液100μL溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，酶标仪 515nm波长下测定吸光度OD值。

2.5结果处理：

根据酶标仪测定的OD值，按下列公式计算抑制率：抑制率(％)＝(OD对照-OD给 药)/OD对照×100％。用软件Calcusyn计算IC₅₀。实验重复三次以上，计算平均值和标准差， 数据表示为：平均值±标准差。

所得实验结果如下表：

可见，本发明化合物3a、3e对不同来源的人肿瘤细胞株，其中包括白血病HL60、骨 髓瘤RPMI8226、非小细胞肺癌A549、乳腺癌MDA-MB-231和卵巢癌A2780细胞均表现出一定 程度的增殖抑制作用。