一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

摘要

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中以非经典分泌途径进行分泌的异源蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用。来源于瘤胃菌Ruminococcus？sp.？5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE本身不带有任何信号肽或分泌信号，却可以大量分泌到胞外；通过实验证明了RDPE并非通过Sec途径或Tat途径进行分泌，也不是因为细胞自溶和裂解而泄漏到胞外。因此，RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白。将RDPE分别与18种目标蛋白进行融合，尝试以RDPE作为转运信号实现目标蛋白的分泌表达，16种融合蛋白均在胞内有明显的表达，9种融合蛋白被成功分泌到胞外，其中2种融合蛋白的分泌水平占相应融合蛋白总量的比例大于50%。所以，本实验发展了一种实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表达的新策略。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种在枯草芽孢杆菌中通过非经典分泌途径 进行分泌的异源蛋白，以及利用该蛋白作为转运信号实现蛋白质在枯草芽孢杆菌中分泌表 达的一种新型策略。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是工业生产中重要的蛋白质生产菌株。因为 强大的蛋白质分泌能力、安全菌种的定位（GRAS,generallyrecognizedassafe）、遗传 易操作性、无密码子偏好性以及发酵成本低廉等特征，枯草芽孢杆菌吸引了众多科学研究 者的目光。在枯草芽孢杆菌中，大多数蛋白质以未折叠状态通过Sec途径被转运到胞外，少 数蛋白（如PhoD和YwbN）以折叠状态通过Tat途径分泌到培养基中，还有一些蛋白通过ABC转 运子途径、Com途径和ESX途径等方式进行分泌。目前，在蛋白分泌相关研究中，绝大多数蛋 白是在经典信号肽（Sec信号肽或Tat信号肽）的指导下分泌到胞外，但是大多蛋白质的分泌 效果往往并不理想。在经典分泌途径（Sec途径和Tat途径等）中的每一过程均可能成为限制 蛋白质分泌的因素。此外，一般情况下，细胞质蛋白即使在信号肽的指导下也很难被分泌到 细胞外的培养基中。以上因素限制了枯草芽孢杆菌在蛋白质生产上的应用。

除了可通过上述已知分泌途径分泌的蛋白，细菌中还存在一些不带有任何信号肽 及其它分泌信号的分泌型蛋白，这些蛋白的分泌机制尚不清楚，因此被称为非经典分泌蛋 白。通过计算机软件计算，枯草芽孢杆菌可以分泌大约300种蛋白质。到目前为止，在枯草芽 孢杆菌中，通过2D-电泳和质谱技术已鉴定出113种分泌蛋白，其中84种含有经典的信号肽 （Sec信号肽和Tat信号肽）并在信号肽的指导下分泌到胞外；而其它分泌蛋白却均不含有任 何经典的信号肽或分泌信号序列。Antelman等通过蛋白质组学鉴定出了17种可分泌到胞外 的典型细胞质蛋白（Antelmanetal.MicrobialProteomics:FunctionalBiologyof WholeOrganisms2006,JohnWiley&Sons,Inc.,Hoboken,NJ,USA）；Tjalsma等列 举了24种不带有信号肽且可分泌到胞外的蛋白质，并认为在细菌中不依赖信号肽的蛋白分 泌现象可能比之前认为的更为普遍（Tjalsmaetal.Microbiol.Mol.Biol.Rev. 2004,68:207）。Vitikainen等在枯草芽孢杆菌中对折叠酶PrsA进行结构功能分析时发现 了一些非经典分泌蛋白，比如糖类代谢相关的蛋白Eno、PdhB、PdhD和CitH，目前尚不知这些 蛋白在胞外是否具有功能（Vitikainenetal.JBiolChem2004,279:19302-19314）。 Antelman等最初发现涉及氨基酸代谢的酶RocA和RocF是通过非经典途径分泌的（Antelman etal.GenomeRes2001,11:1484-502），但是后来Vitikaimen证明只有RocF是非经典分 泌蛋白。Hirose等鉴定出具有运动性和趋药性的蛋白Hag是存在胞外的（Hiroseetal. Microbiology2000,146:65-75），随后同类蛋白FlgK和FliD也被鉴定位于胞外（Antelman etal.GenomeRes2001,11:1484-502），这三种蛋白在胞外均具有已知功能。过氧化氢 酶KatA缺少信号肽，因此开始被认为是一种胞内酶，但是其后来被证明同样可以分泌到胞 外（占总蛋白的56%）（Naclerioetal.ApplEnvironMicrobiol1995,61:4471-4473）。 此外，SodA、YceD、Ef-G和GroEL等蛋白也被不同研究人员在胞外检测到。当然，在胞外环境 中检测到非经典分泌蛋白很容易被认为是细胞裂解而导致细胞质蛋白发生泄漏的缘故。然 而，Yang等人已证实一种异源的蛋白Est55和几种不含有信号肽的自身细胞质蛋白不是因 为细胞裂解而泄漏到胞外，而是通过一种或某种未知的分泌途径被转运到胞外环境中 （Yangetal.JournalofBacteriology2011,193:5607-5615）。事实上，众多来自不同 研究组关于不同菌种的研究已表明非经典分泌蛋白在枯草芽孢杆菌中是真实存在的。

尽管非经典分泌的机制尚未清楚，但是研究人员已开始尝试将非经典分泌系统应 用到蛋白生产中。最近，Wang等人选择了4种枯草芽孢杆菌自身非经典分泌蛋白来尝试引导 异源蛋白分泌，结果4种蛋白均可以引导Nsp（Nucleoskeletallikeprotein）分泌到胞外， 其中2种可以指导碱性磷酸酶PhoA的分泌，一种可以将耐高温β-半乳糖苷酶BgaB转运到胞 外（Wangetal.MicrobCellFact2015,14:179）。尽管这些蛋白的分泌量大多很低，只 能用Western-blotting的方法进行检测，但是证明了非经典分泌蛋白可以应用在蛋白质分 泌表达中。因此，为了补充枯草芽孢杆菌的蛋白分泌途径，以及拓展枯草芽孢杆菌表达系统 的使用范围，更多的非经典分泌蛋白需要被发掘并应用到重组蛋白的生产中。本发明证明 了来源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向异构酶RDPE是一种 在枯草芽孢杆菌中的非经典分泌蛋白，并以该非经典分泌蛋白为分泌信号引导多个不同来 源的目标蛋白实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。

发明内容

本发明的目的之一是证明来源于瘤胃菌Ruminococcussp.5_1_39B_FAA的D-阿 洛酮糖3-差向异构酶RDPE是一种在枯草芽孢杆菌中可通过非经典分泌途径进行分泌的蛋 白。

所述的非经典分泌途径不是枯草芽孢杆菌中Sec途径和Tat途径等已知经典分泌 途径，也不是因为细胞自溶和裂解而导致的胞内蛋白泄漏的现象，而是一种未知的全新的 蛋白分泌途径。

所述的异源蛋白RDPE的核酸序列如SEQIDNO.1所示，且其不含有经典的信号肽 和分泌信号序列。

所述的枯草芽孢杆菌可以是枯草芽孢杆菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104 或以上菌株后代细胞中的一种。

本发明的目的之二是提供一种利用非经典分泌蛋白RDPE并通过非经典分泌途径 实现蛋白分泌表达的方法，即非经典分泌蛋白RDPE在蛋白分泌表达中的应用，是将RDPE与 候选目标蛋白进行融合并构建一系列重组表达质粒pMA5-RDPE-TP，分别转化到枯草芽孢杆 菌菌株后进行筛选培养，多达50%的目标蛋白可成功分泌到胞外。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP包含非经典分泌蛋白RDPE的编码序列、21-bp 的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合而获得的DNA序列。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP中的21-bp的柔性Linker序列为5’- GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3’。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP中的目标蛋白分别为来枯草芽孢杆菌来源的 GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、XylA、Pel、PhoA(BS)、LipA、PhoD、YwbN和PrsA，其它细菌来源的 LacZ、PhoA(EC)、BgaB、AmyS和AmyL以及真核生物来源的GFP和RFP。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP还包含组成型强启动子P_HpaII。

所述的重组表达质粒pMA5-RDPE-TP还包含氨苄青霉素和卡那霉素抗性选择标记 基因。

本发明的目的之三是提供一种构建重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的方法，是构建包 含非经典分泌蛋白RDPE的编码序列、21-bp的柔性Linker序列和目标蛋白的编码序列融合 而获得的DNA序列的质粒。

所述构建重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的方法包括如下步骤：

1、以各相应来源菌种的基因组或质粒，利用对应引物扩增groES,groEL,dnaK, dnaJ,xylA,pel,phoA(BS),lipA,phoD,ywbN,prsA,lacZ,phoA(EC),bgaB, amyS,amyL,gfpandrfp基因，通过胶回收分别获得相应基因片段。

2、以pMA5-RDPEL为模板，使用相应引物进行PCR，通过胶回收获得线性化的载体 pMA5-RDPEL。

3、将各基因片段分别与线性化的载体pMA5-RDPEL进行POE-PCR（Prolonged overlapextensionPCR）,得到融合产物。

(1)将融合产物直接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，分别得到对应的重组表达质 粒pMA5-RDPE-GroES、pMA5-RDPE-GroEL、pMA5-RDPE-DnaK、pMA5-RDPE-DnaJ、pMA5-RDPE- XylA、pMA5-RDPE-Pel、pMA5-RDPE-PhoA(BS)、pMA5-RDPE-LipA、pMA5-RDPE-PhoD、pMA5- RDPE-YwbN、pMA5-RDPE-PrsA，pMA5-RDPE-lacZ、pMA5-RDPE-PhoA(EC)、pMA5-RDPE-BgaB、 pMA5-RDPE-AmyS、pMA5-RDPE-AmyL、pMA5-RDPE-GFP和pMA5-RDPE-RFP。

本发明的目的之四是提供一种表达融合蛋白RDPE-TP的方法，是以重组表达了融 合蛋白RDPE-TP的枯草芽孢杆菌为生产菌株，发酵生产融合蛋白RDPE-TP。

所述的方法是，构建表达融合蛋白RDPE-TP的重组枯草芽孢杆菌菌株；发酵培养基 为2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%~0.9%磷酸氢二钾，pH7.2；活化所构建 重组枯草芽孢杆菌菌株，于37℃、200rpm条件下进行摇瓶发酵。

附图说明

图1为重组质粒pMA5-RDPE的构建流程。

图2为基因工程菌株B.subtilis1A751-HR分泌表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶 的SDS-PAGE图谱。1A751为负对照；1A751C为将pMA5空质粒转化1A751得到的菌株，也作为负 对照；1A751-HR为将pMA5-RDPE转化1A751得到的菌株。Marker表示蛋白分子质量标准。箭头 所指示的条带为D-阿洛酮糖3-差向异构酶蛋白。

图3为证明RDPE并非通过Sec途径和Tat途径而分泌到胞外。A：RDPE在Sec信号肽 的引导下的表达情况。1A751为负对照；1A751C为带有空质粒pMA5的1A751菌株，也作为负对 照；WT，为不带有信号肽的RDPE。B：RDPE在Tat途径缺失菌株中的表达情况。1A751为负对照； 1A751C为带有空质粒pMA5的1A751菌株，也作为负对照。

图4为证明RDPE不是因细胞裂解而泄漏到胞外。1A751为负对照。

图5为重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的构建流程。

图6为各融合蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达情况。A：来源于枯草芽孢杆菌的蛋白 与RDPE融合后的表达情况。B：来源于其它细菌的蛋白与RDPE融合后的表达情况。C：来源于 真核生物的蛋白与RDPE融合后的表达情况。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地阐述本发 明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

表1本发明中所用引物

Prmier Sequence(5’-3’) pMA5-RDPE-F1 AAATATGGTATTTATTACGCTTATTG pMA5-RDPE-R1 TAAATCGCTCCTTTTTAGGTGGCAC SacB-F GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAAC SacB-R CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCGCAAACGCTTGAGTTGCGCCTCCTG AprE-F GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAG AprE-R CCAATAAGCGTAATAAATACCATATTTAGCCTGCACAGACATGTTGCTGAACG AmyL-F GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGAAACAACAAAAACGGCTTTATGC AmyL-R CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCGCCGCTGCTGCAGAATGAGGCAGC AmyE-F GTGCCACCTAAAAAGGAGCGATTTACATATGTTTGCAAAACGATTCAAAACCTC AmyE-R CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTAGCACTCGCAGCCGCCGGTCCTGCCAG UP1-F CGGCATTCCCTTGGGTTGTAACTTGG UP1-R GAAGTCACCGGGTGGTACGCTGCACTAAATTTCCACTCCTTAATTCGTGATT DN1-F AATCACGAATTAAGGAGTGGAAATTTAGTGCAGCGTACCACCCGGTGACTTC DN1-R GAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAACGATGCTACAGAAACCAGTGCATCAG CR1-F CTGATGCACTGGTTTCTGTAGCATCGTTCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC CR1-R CAAGCCCGGTATTCCAATGTTTGAAAACATTTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC G1-F GTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGTTTTCAAACATTGGAATACCGGGCTTG G2-R AGCGGCCGCCGCTGTTTCTTCCCTC UP2-F GGCAGGCATTATGGCCGCAAAGCAAAC UP2-R CTCGCATGAGAAATGGATTTTTTATTAATTTGGGCTCCTCCTTTCCCTCTATTC DN2-F GAATAGAGGGAAAGGAGGAGCCCAAATTAATAAAAAATCCATTTCTCATGCGAG DN2-R GAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGATGAACGAAACCCACTTAACAAAGGAG CR2-F CTCCTTTGTTAAGTGGGTTTCGTTCATCTTCAACTAAAGCACCCATTAGTTC CR2-R CAAGGCTTCCAGGACCGATCGGCATTTATTCATTCAGTTTTCGTGCGGAC G2-F GTCCGCACGAAAACTGAATGAATAAATGCCGATCGGTCCTGGAAGCCTTG G2-R TTGCCCAGAAGACACGTCCCGATCG 4 -->pMA5-RDPE-F2 ATGAAATATGGTATTTATTACGCTTATTG pMA5-RDPE-R2 TGAGTATAACACACTATACTTTATATTCATAAAGTGTG Spac-F CTTTATGAATATAAAGTATAGTGTGTTATACTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACC Spac-R CAATAAGCGTAATAAATACCATATTTCATATGTCACCTCCTTAAGCTTAATTGTTATCC pMA5-RDPE-F3 GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC pMA5-RDPE-R3 GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTCAAATACATGTTTTACAAAG pMA5-RDPEL-F GGATCCTCTAGAGTCGAGCTCAAGC pMA5-RDPEL-R GCTGCCACCTCCACCGCTACCGACTTC groES-F ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCTTGTTAAAGCCATTAGGTGATCGCGTTG groES-R CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAGCCGATAACAGCTAAAATGTCGC groEL-F TTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGGCAAAAGAAATTAAGTTTAGTGAAG groEL-R AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTACATCATTCCACCCATACCGCCCATG dnaK-F ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGTGAGTAAAGTTATCGGAATCGACTTAG dnaK-R AAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTTTTGTTTTGGTCGTCGTTTAC dnaJ-F TTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAGTAAGCGTGATTACTATGAAGTGC dnaJ-R AAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAATCGCCTTTAAACGCGCGTTTTAC xylA-F ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGGCTCAATCTCATTCCAGTTCAATC xylA-R TAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATACTTCTAAAATGTATTGGTTCAATATCG pel-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCTGATTTAGGCCACCAGACGTTGG pel-R CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAATTTAATTTACCCGCACCCGCTTG phoA(BS)-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGAGCTTCAGCAAACAGAAAAGGCCAG phoA(BS)-R CTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTTCCAGTTTTTAAAATCTTAAATATG lipA-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG lipA-R AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAATTCGTATTCTGGCCCCCGCCGTTC phoD-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCGCCTAACTTCTCAAGCTATCC phoD-R CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTCATCGGATTGCTTCACCCCGCCTTG ywbN-F TTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCTAAGCCATCGAAAAAGGATGAAAAAG ywbN-R CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATGATTCCAGCAAACGCTGGGCAA prsA-F ATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAAGAAAATCGCAATAGCAGCTATC prsA-R CTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTAGAATTGCTTGAAGATGAAGAAGTG lacZ-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGACCATGATTACGGATTCACTGG lacZ-R GCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTTTGACACCAGACCAACTGGTAATG phoA(EC)-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCCGGACACCAGAAATGCCTGTTCTG phoA(EC)-R CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTATTTCAGCCCCAGAGCGGCTTTC bgaB-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAATGTGTTATCCTCAATTTGTTACGGAG bgaB-R CAAGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCCTAAACCTTCCCGGCTTCATCATGC amyS-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCCGCACCCTTTAACGGCACC amyS-R AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAAGGCCATGCCACCAGTCTAG amyL-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGC amyL-R AGCTAGCTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCCTATCTTTGAACATAGATCGAAACCGAC 5 -->gfp-F GAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG gfp-R GAGCTCGACTCTAGAGGATCCCTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG rfp-F GTATTTGAAGTCGGTAGCGGTGGAGGTGGCAGCATGGCGAGTAGCGAAGACGTTATC rfp-R CTTGAGCTCGACTCTAGAGGATCCTTAAGCACCGGTGGAGTGACGACC

实施例1RDPE在枯草芽孢杆菌的分泌表达

根据来源于瘤胃菌（Ruminococcussp.5_1_39B_FAA）的DPEase编码基因rdpe序列进 行全基因合成，并在该基因核苷酸序列的5’和3’端分别引入NdeI和BamHI限制性酶切位点， 以方便后续的表达载体构建。合成好的基因连接到pUC57载体上，命名为pUC57-RDPE。

将质粒pUC57-RDPE和pMA5分别进行NdeI和BamHI双酶切处理；双酶切反应条件为 37℃水浴3h。将双酶切产物分别进行胶回收，得到两端分别带有NdeI和BamHI酶切位点的 rdpe片段和线性化的pMA5载体，将两者以T4连接酶在室温条件下连接30min；连接产物转 化大肠感受态细胞DH5α，以氨苄霉素（100μg/mL）进行抗性筛选，通过菌落PCR筛选阳性克 隆，并提取质粒进行测序验证。质粒构建结果见图1，所构建的含有该rdpe基因的重组表达 质粒命名为pMA5-RDPE。

将重组表达质粒pMA5-RDPE通过Spizizen转化方法（Spizizenetal.ProcNatl AcadSci1958,44:1072-1078）转入1A751感受态细胞，涂布于卡那霉素（50μg/mL）平板 过夜培养，以菌落PCR筛选阳性克隆，得到重组菌株1A751R。将重组菌株1A751R接种于含5 mLSR培养基（1.5%蛋白胨，3.0%酵母提取物和0.3%K₂HPO₄，pH7.2）的试管中，并添加50μ g/mL卡那霉素用于维持质粒稳定，在37℃、200rpm条件下培养18h。随后，取300μL试管 中菌液接种于装有30mL2×SR培养基（3.0%蛋白胨，6.0%酵母提取物和0.6%K₂HPO₄,pH 7.2）的摇瓶（250mL）中，并添加50μg/mL卡那霉素，在37℃、200rpm条件下培养72h。随 后取出发酵液，12000rpm离心5min得到发酵液上清，即为粗酶液；将离心后的菌体用PBS 重悬，进行超声破碎，12000rpm离心5min得到破碎细胞上清。上述相关方法均采用常规操 作步骤。

取粗酶液和破碎细胞上清分别进行酶活测定，结果显示胞外和胞内RDPE活性分别 为17U/mL和4U/mL；SDS-PAGE分析显示胞内和胞外在相对分子质量约33kDa处均有明显 的条带，与RDPE分子质量理论值大小一致，且胞外目标蛋白量明显多于胞内（如图2所示）。 综上可知，大部分表达的RDPE被分泌到胞外。

实施例2SignalP预测RDPE的信号肽或信号序列

使用信号肽预测软件SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对 RDPE的氨基酸序列进行分析，发现RDPE的N端不存在典型的信号肽，在其它区域也不存在任 何分泌信号序列。

实施例3RDPE不能通过Sec和Tat分泌途径进行分泌

该部分重组质粒构建方法依据文献中方法（Youetal.ApplEnvironMicrobiol 2012,78:1593-5）。以枯草芽孢杆菌168或地衣芽孢杆菌CICC10181基因组为模板，使用对 应的引物分别扩增四个Sec信号肽（SP_sacB、SP_AprE、SP_AmyL和SP_AmyE，核酸序列分别如SEQID NO.2、3、4和5所示），对克隆得到的PCR产物分别进行胶回收。以pMA5-RDPE为模板，使用引 物扩增线性化的载体pMA5-RDPE，将所得PCR产物进行胶回收。将以上4个信号肽片段与线性 化的载体pMA5-RDPE分别进行POE-PCR（ProlongedoverlapextensionPCR）,将得到的 融合产物分别直接转化大肠感受态细胞DH5α，分别得到重组表达质粒pMA5-SP_sacB-RDPE、 pMA5-SP_AprE-RDPE、pMA5-SP_AmyL-RDPE和pMA5-SP_AmyE-RDPE。构建的质粒经测序验证正确。将以 上重组表达质粒分别转化枯草芽孢杆菌1A751，经菌落PCR验证获得重组菌株1A751R1、 1A751R2、1A751R3和1A751R4并进行摇瓶发酵，具体的摇瓶发酵方法同于实施例1。SDS-PAGE 分析显示，RDPE分别融合上四个Sec信号肽后，不但不能分泌到胞外，在胞内也不能表达（如 图3A所示）。以上结果说明，RDPE并不能通过Sec途径分泌到胞外。

敲除了枯草芽孢杆菌中Tat途径相关基因tatAd-tatCd和tatAy-tatCy（敲除方法 参考Liuetal.Microbiology(2008),154,2562-2570），构建了Tat途径缺失菌株，命 名为1A751D。将重组表达质粒pMA5-RDPE转化1A751D，获得重组菌株1A751DR。同时，构建了 包含PhoD和YwbN基因的重组表达质粒pMA5-PhoD和pMA5-YwbN，构建方法同于前面所述重组 质粒的构建方法；将该两种质粒分别转化Tat途径缺失菌株1A751D，获得重组菌株1A751DP 和1A751DY。将重组菌株1A751DR、1A751DP和1A751DY分别进行摇瓶培养，培养方法同于实施 例1。发酵24h取样进行SDS-PAGE分析，结果显示敲除Tat途径后，RDPE仍可以分泌到胞外； 而依赖Tat途径分泌的PhoD和YwbN在敲除Tat途径后却不能分泌到胞外（如图3B所示）。以上 结果说明RDPE是不依赖Tat途径而分泌到胞外的。

实施例4胞外的RDPE不是因为细胞裂解而泄漏到胞外

虽然RDPE不含有自身的信号肽或分泌信号，且不依赖于Sec和Tat分泌途径，但是不能 排除其是因细胞裂解而泄漏到胞外的可能。P_spac为IPTG诱导的启动子（核酸序列如SEQID NO.6所示），其完整序列中包含LacI基因，编码一种仅在胞内表达的蛋白。因此将重组表达 质粒pMA5-RDPE上的启动子P_HpaII替换为P_spac，具体步骤如下：

以质粒pHCMC05为模板，使用相应引物扩增启动子P_spac，将PCR产物进行胶回收；以 pMA5-RDPE为模板，使用相应引物扩增线性化的载体pMA5-RDPE，PCR产物进行胶回收；将 P_spac片段与线性化的载体pMA5-RDPE分别进行POE-PCR,将得到的融合产物分别直接转化 大肠感受态细胞DH5α，得到重组表达质粒pMA5-P_spac-RDPE，经测序验证正确。

将重组表达质粒pMA5-P_spac-RDPE转化枯草芽孢杆菌1A751，得到重组菌株 1A751SR，进行摇瓶发酵，在发酵液OD₆₀₀达到0.8的时候添加100mMIPTG进行诱导，其它发 酵方法同于实施例1。SDS-PAGE分析（如图4所示）显示LacI在胞内可以组成型大量表达，而 不能分泌到胞外；在IPTG诱导下，RDPE可以在胞内表达，同时有更多的RDPE被分泌到胞外。 综上所述，可知RDPE并不是因为细胞裂解而泄漏到胞外，而是通过某种未知分泌途径而分 泌到胞外的。

实施例5重组表达质粒pMA5-RDPE-TP的构建

实施例1-4可证明RDPE在枯草芽孢杆菌中是一种非经典分泌蛋白，我们使用该蛋白作 为分泌信号以实现不同来源目标蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，因此选择了18种蛋白 作为目标蛋白，具体如下表所示：

表2目标蛋白列表

NO. Gene Localisation Function Source Molecular mass (kDa) Gene length (bp) Secretion pathway 1 groES Intracellular Chaperone B. subtilis 10 285 2 groEL Intracellular Chaperone B. subtilis 60 1635 3 dnaK Intracellular Chaperone B. subtilis 67 1836 4 dnaJ Intracellular Chaperone B. subtilis 41 1119 5 xylA Intracellular Xylose isomerase B. subtilis 49 1338 7 -->6 pel Extracellular Pectate lyase B. subtilis 44 1200 Sec pathway 7 phoA Extracellular Alkaline phosphatase A B. subtilis 47 1293 Sec pathway 8 lipA Extracellular Lipase B. subtilis 20 546 Sec pathway 9 phoD Extracellular Phosphodiesterase B. subtilis 55 1503 Tat pathway 10 ywbN Extracellular Unknown function B. subtilis 41 1119 Tat pathway 11 prsA Membrane Chaperone B. subtilis 32 879 12 lacZ Intracellular β-galactosidase E. coli 113 3075 13 phoA Extracellular Alkaline phosphatase A E. coli 50 1353 Sec pathway 14 bgaB Intracellular β-galactosidase G. stearothermophilus 74 2019 15 amyS Extracellular α-amylase G. stearothermophilus 57 1548 Sec pathway 16 amyl Extracellular α-amylase B. licheniformis 53 1452 Sec pathway 17 gfp Intracellular Green fluorescent protein Aequorea victoria 26 717 18 rfp Intracellular Red fluorescent protein Discosoma coral 25 678

以质粒pMA5-RDPE为模板，设计引物pMA5-RDPE-F3/pMA5-RDPE-R3，上游引物5’端含有 21bp的Liker序列，扩增线性化的载体pMA5-RDPE3，将PCR产物进行胶回收。将线性化的载 体pMA5-RDPE3以T4多聚核苷酸激酶进行处理，条件为37℃水浴30min；然后加入T4连接酶 以使载体自连，条件为室温30min；将连接体系转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质 粒pMA5-RDPEL（如图5所示），经测序验证正确。

以枯草芽孢杆菌168基因组为模板，使用相应引物扩增基因groES,groEL,dnaK, dnaJ,xylA,pel,phoA(BS),lipA,phoD,ywbN和prsA；以大肠杆菌Escherichiacoli MG1655基因组为模板，使用相应引物扩增基因lacZ和phoA(EC)；以嗜热脂肪芽孢杆菌 BacillusstearothermophilusATCC31195基因组为模板，使用相应引物扩增基因bgaB和 amyS；以地衣芽孢杆菌BacilluslicheniformisCICC10181为模板，使用相应引物扩增基 因amyL；使用质粒pDG和pDR（实验室自有）为模板，使用相应引物扩增基因gfp和rfp；将以 上PCR产物进行胶回收。以pMA5-RDPEL为模板，使用相应引物扩增线性化的载体pMA5- RDPEL，PCR产物进行胶回收。将以上基因片段和线性化载体pMA5-RDPEL分别进行POE-PCR， 将得到的融合产物分别直接转化大肠感受态细胞DH5α，得到重组表达质粒pMA5-RDPE- GroES、pMA5-RDPE-GroEL、pMA5-RDPE-DnaK、pMA5-RDPE-DnaJ、pMA5-RDPE-XylA、pMA5-RDPE- Pel、pMA5-RDPE-PhoA(BS)、pMA5-RDPE-LipA、pMA5-RDPE-PhoD、pMA5-RDPE-YwbN、pMA5- RDPE-PrsA，pMA5-RDPE-lacZ、pMA5-RDPE-PhoA(EC)、pMA5-RDPE-BgaB、pMA5-RDPE-AmyS、 pMA5-RDPE-AmyL、pMA5-RDPE-GFP和pMA5-RDPE-RFP（如图5所示），经测序验证以上质粒均正 确。

实施例6融合蛋白RDPE-TP的表达

将所构建18种重组表达质粒转化枯草芽孢杆菌1A751，涂布含卡那霉素（50μg/mL）的 LB平板，37℃过夜培养，以菌落PCR进行验证，获得18种重组菌株，分别命名为1A751RL1、 1A751RL2、1A751RL3、1A751RL4、1A751RL5、1A751RL6、1A751RL7、1A751RL8、1A751RL9、 1A751RL10、1A751RL11、1A751RL12、1A751RL13、1A751RL14、1A751RL15、1A751RL16、 1A751RL17和1A751RL18。将以上重组菌株分别进行摇瓶培养，培养方法同于实施例1，发酵 72h取样进行SDS-PAGE分析。

如图6所示，融合蛋白RDPE-DnaJ和RDPE-LacZ在胞内和胞外均没有被检测到；融合 蛋白RDPE-GroES、RDPE-GroEL、RDPE-DnaK、RDPE-XylA、RDPE-Pel、RDPE-PhoA(BS)、RDPE- LipA、RDPE-PhoD、RDPE-YwbN、RDPE-PrsA、RDPE-PhoA(EC)、RDPE-BgaB、RDPE-AmyS和RDPE- AmyL、RDPE-GFP和RDPE-RFP均成功在胞内表达，且大多表达水平较高；融合蛋白RDPE- GroES、RDPE-DnaK、RDPE-Pel、RDPE-PhoA(BS)、RDPE-YwbN、RDPE-PhoA(EC)、RDPE-AmyL、 RDPE-GFP和RDPE-RFP均成功分泌到胞外，其中分泌的RDPE-DnaK和RDPE-RFP分别占总融合 蛋白的比例均大于50%。以上结果说明非经典蛋白RDPE作为分泌信号成功地将大约50%的目 标蛋白分泌到胞外。

实施例7生物活性检测

将实施例6中所取样品在10000rpm、4℃条件下离心15min，保留发酵液上清，收集菌 体，然后用PBS洗涤三次，并重悬于等体积的PBS中。然后加入20mg/mL的溶菌酶，37℃水浴 保温30min，使用超声波破碎菌体（5min，300W，JY92-11N），10000rpm、4℃条件下离心 15min，保留破碎细胞上清液。对融合蛋白的RDPE酶活以及相应目标蛋白的酶活进行测定

RDPE酶活测定方法：取200μL粗酶液与800μL2%的D-果糖溶液（50mMTris-HCl，pH 8.0）于55℃反应10min，然后煮沸5min终止反应。用0.45μm的微孔滤膜过滤后进行高效 液相色谱分析。高效液相色谱条件如下：安捷伦高效液相色谱仪1200；分析柱：Sugar-PaKTM 分析柱（6.5mm×300mm；Waters）；流动相：超纯水；流速:0.4mL/min；柱温：80℃；检测 器：示差折光检测器。以Sigma公司生产的D-果糖和D-阿洛酮糖为标准品，将上述样品进行 分析，上样量为20μL。

可进行酶活测定的蛋白质XylA、Pel、PhoA、LipA、LacZ、BgaB和AmyS（AmyL）的酶活 测定方法分别依据文献中的方法（Meetal.EnzymeMicrobTechnol2014,64-65:1-5, Diaoetal.ApplEnvironMicrobiol2012,78:651-659,Liuetal.Biotechnol Lett2012,34:109-115,Luetal.JIndMicrobiolBiotechnol2010,37:919-925, Dwyeretal.JBacteriol2014,196:3343-3350,Phanetal.MicrobCellFact 2015,14:72,Chenetal.MicrobCellFact2015,14:92）。

荧光强度测定方法：将发酵液在10000rpm、4℃条件下离心10min，保留发酵液上 清；同时菌体用等体积的PBS缓冲液重悬。吸取200μL待测样品用NUNC96孔黑色酶标板进 行荧光检测，检测时每个样品做4个平行，所用仪器为SpectraMaxM5多功能酶标仪，操作软 件为Gen5。荧光强度参数设置为，绿色荧光，激发：488nm，发射：520nm；红色荧光，激发： 550nm，发射：550nm；顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。

酶活测定结果如下表所示：

表3融合蛋白的酶活测定结果

名称 胞内RDPE酶活 U/mL 胞外RDPE酶活 U/mL 胞内目标蛋白酶活 U/mL 胞外目标蛋白酶活 U/mL RDPE-GroES √ √ - - RDPE-GroEL √ - - - RDPE-DnaK √ √ - - RDPE-DnaJ - - - - RDPE-XylA √ - 1830 - RDPE-Pel √ √ - 180 RDPE-PhoA(BS) √ √ - 145 RDPE-LipA √ - - - RDPE-PhoD √ - - - RDPE-YwbN √ √ - - RDPE-PrsA √ - - - RDPE-LacZ - - - - 9 -->RDPE-PhoA(EC) √ √ - 870 RDPE-BgaB √ - 18 0.08 RDPE-AmyS √ - - - RDPE-AmyL √ √ - 63 RDPE-GFP √ √ - - RDPE-RFP √ √ - -

√表示具有RDPE活性

-表示没有检测到酶的活性或不可检测酶活

表4融合蛋白的荧光活性检测(RFU)

名称 RDPE RDPE-GFP RDPE-RFP 胞内 0 2210 3430 胞外 0 640 7600

<110>中科院天津工业生物技术研究所

<120>一种非经典分泌蛋白及其在蛋白分泌表达中的应用

<130>2016

<160>6

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>876

<212>DNA

<213>Ruminococcussp.

<400>1

atgaaatatggtatttattacgcttattgggaaaaggaatggaatggagattacaaatat60

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<210>2

<211>87

<212>DNA

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<210>3

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<210>4

<211>87

<212>DNA

<213>Bacilluslicheniformis

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<211>99

<212>DNA

<213>Bacillussubtilis

<400>5

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<210>6

<211>1636

<212>DNA

<213>未知

<400>6

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