肺炎链球菌非经典分泌蛋白GAPDH的分泌机制及其与热休克蛋白DnaJ的相互作用研究

摘要

目的：明确肺炎链球菌非经典分泌蛋白GAPDH的分泌是否由细菌裂解引起，并确定 GAPDH分泌必需结构域。同时，验证该蛋白与热休克蛋白的DnaJ的相互作用，为深入研究GAPDH的分泌机制奠定基础。
　　方法：原核表达GAPDH重组蛋白并制备其多克隆抗体，利用该多克隆抗体通过Western Blot评价GAPDH在肺炎链球菌中的保守性。缺失肺炎链球菌主要自溶酶 LytA使其丧失自溶能力，通过 Western Blot比较野生菌和LytA缺陷菌GAPDH的分泌是否存在差异。同时以只在细胞内表达的CodY蛋白为参照，鉴定肺炎链球菌对数生长早期GAPDH的分泌是否伴有细菌裂解。利用Jpred3软件分析GAPDH二级结构和功能结构域，利用Swiss-Model软件对GAPDH进行同源模建，根据生物信息学结果进行截短表达设计。利用分子克隆技术将不同GAPDH截短表达基因片段克隆到异位表达载体pJW-v25质粒，经测序鉴定后将重组质粒转化肺炎链球菌D39，采用0.15mm Zn2+诱导表达含有GFP标签的GAPDH。分离亚组份，采用Western Blot检测截短表达的GAPDH在肺炎链球菌的定位，初步确定分泌必需结构域。采用结构替代和氨基酸突变两种方法进一步验证分泌必需结构域在GAPDH分泌中的作用，并确定参与GAPDH分泌的关键性氨基酸。将肺炎链球菌 GAPDH分泌必需结构域和枯草芽孢杆菌168菌株的GAPDH同源序列进行替换，评价该分泌必需结构域是否具有普遍性。在肺炎链球菌中，将GAPDH的结构域I进行直接连接或柔性结构连接后，与GFP标签蛋白融合表达，观察融合蛋白的分泌及表面定位情况，以确定结构域I能否作为一个信号肽介导蛋白质的分泌。在肺炎链球菌中异位表达枯草芽孢杆菌168菌株 GAPDH，观察其分泌情况，探讨GAPDH在肺炎链球菌和枯草芽孢杆菌中是否具有共同的分泌途径。采用大肠杆菌双杂交系统、直接结合实验、生物膜干涉技术验证GAPDH和热休克蛋白DnaJ的相互作用，并初步探讨DnaJ对GADPH分泌的影响。
　　结果：获得了纯度达90％的GAPDH重组蛋白，并制备了效价达107的抗GAPDH多克隆抗体。Western blot结果显示，在对数生长早期二型肺炎链球菌荚膜型D39和荚膜缺陷型R6细胞壁及培养上清中均检测到GAPDH的表达，但是并没有检测到CodY的表达。同时，主要自溶酶 LytA缺失后，培养上清依旧检测到 GAPDH的表达，与野生菌相比无明显差异。提示，肺炎链球菌GAPDH的分泌不是由于细菌自溶引起。用Jpred3软件分析发现，GAPDH具有两个结构域：结构域I和II。结构域I由N末端的1-150aa和C末端α螺旋（317-335aa）构成。结构域II由151-316aa构成。对GAPDH进行同源建模，也发现GAPDH N末端和C末端在空间上相互靠近构成结构域I。根据以上生物信息学结果我们设计了GAPDH截短表达。Western blot结果显示，结构域I的 N末端1-30aa和（或） C末端α螺旋缺失后， GAPDH都不能定位于细菌表面及分泌到培养上清，提示结构域 I是GAPDH在细胞表面定为及分泌的必需结构域。氨基酸突变结果显示， N末端的氨基酸3VKVGIN9、18GGG20和C末端325RTLEYF330突变后GAPDH的表面定位和胞外分泌都缺失，提示这些氨基酸是 GAPDH的表面定位和分泌的关键氨基酸。此外10F突变后，GAPDH在上清中消失，但仍出现于细胞表面，提示该突变只影响了GAPDH在上清的分泌，并不影响 GAPDH在细胞表面的定位；而322QLV324突变后， GAPDH不能定位到细胞表面，但是可以分泌到培养上清，提示该突变只影响了GAPDH在细胞表面的定位，并不影响GAPDH在上清的分泌。单独的结构域I与GFP融合后，其只表达于胞内，上清中没有检测到融合蛋白，柔性结构连接的结构域I也不能分泌到胞外，提示单独的结构域 I不能介导蛋白质的分泌。枯草芽孢杆菌168菌株GAPDH在肺炎链球菌中能够表达，但在细胞表面和上清中均检测不到该蛋白，提示其在肺炎链球菌中不能定位到细胞表面及分泌到胞外，表明GAPDH在枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌中的分泌途径存在差异。大肠杆菌双杂交、ELISA直接结合实验和BLI生物膜干涉技术结果显示GAPDH和热休克蛋白DnaJ具有直接的相互作用。
　　结论：肺炎链球菌GAPDH的分泌并不是细菌自身裂解引起的，结构域I的是其表面定位及分泌所必需的，但不足以使蛋白分泌到胞外。N末端氨基酸3VKVGIN9、18GGG20和C末端325RTLEYF330是GAPDH的表面定位和分泌的关键氨基酸。肺炎链球菌和枯草芽孢杆菌中的GAPDH分泌途径存在差异。另外，GAPDH和热休克蛋白DnaJ具有直接的相互作用。这些结果为进一步研究肺炎链球菌非经典分泌蛋白GAPDH的分泌奠定了坚实的实验基础和理论基础。

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前言

第一部分 肺炎链球菌GAPDH蛋白的原核表达、抗血清制备、保守性分析及分泌机制初探

1 实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

第二部分 GAPDH分泌必需结构域的鉴定

1 实验材料

2 实验方法

3实验结果

4讨论

第三部分GAPDH和热休克蛋白DnaJ的相互作用

1实验材料

2实验方法

3实验结果

4讨论

全文总结

参考文献

文献综述: 非经典分泌蛋白研究进展

致谢

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