肺炎链球菌烯醇化酶与热休克蛋白DnaJ的结合及结合位点鉴定

摘要

目的：明确肺炎链球菌糖酵解关键酶烯醇化酶（enolase,Eno）和热休克蛋白DnaJ是否有直接结合及结合位点。方法：原核表达并纯化Eno全长蛋白,鉴定其酶活性,利用重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠制备特异性抗血清,分析其胞外分泌情况;采用生物膜层干涉（biolayer interferometrvy,BLI）技术和直接结合实验鉴定Eno和DnaJ两者之间是否存在直接相互作用;在前者结果阳性的基础上,截短表达Eno蛋白,通过直接结合实验鉴定Eno蛋白结合DnaJ的位点。结果：成功表达重组Eno蛋白,纯度达90%,该蛋白具有酶活性;重组Eno蛋白皮下免疫昆明小鼠后,获得效价达1∶7.68×106的特异性抗血清;Western blot分析显示,7种不同血清型肺炎链球菌培养上清中均在分子量约47 k D处出现特异性反应带;直接结合试验显示,随着Eno蛋白浓度增加,Eno与DnaJ的结合量也相应增加（r=0.920,P=0.000）,其吸光度值从0.222±0.042（12.5μg/ml）增加到0.569±0.099（200.0μg/ml）;BLI技术测定两者结合的亲和常数为926 nmol/L;截短的Eno（aa1-aa100）与DnaJ的结合量2.25±0.38高于其他截短序列的结合量0.94±0.25、1.08±0.09、0.75±0.12,差异具有统计学意义（P=0.000,P=0.001,P=0.000）。结论：肺炎链球菌Eno蛋白与DnaJ蛋白存在直接结合作用,结合位点主要位于其N端的1～100个氨基酸序列。