一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用。本发明的引物组合由引物对I和引物对II组成。引物对I由引物ChPV-F和ChPV-R组成，分别如序列表1、2所示。引物对II由引物ARV-F和ARV-R组成，分别如序列表3、4所示。本发明还保护所述引物组合在鉴别鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒中的应用、鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒中的应用、鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒中的应用。本发明建立的二重PCR可用于快速检测鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的混合感染，适于大批量检测，既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用

背景技术

鸡细小病毒(Chinckenparvovirus，ChPV)是一种单链DNA病毒，为引起鸡肠道 疾病的主要病原体之一，可以引起以腹泻、精神抑郁、体温调节障碍、生长迟缓、增 加饲料消耗等为特征的急性或慢性肠道性疾病、矮小综合症、营养不良综合症。ChPV 在鸡群中普遍存在，主要侵害雏鸡，但以商品肉鸡感染率较高、蛋鸡或种鸡次之，给 养鸡业造成巨大的经济损失。自2010年以来，北美、波兰、匈牙利、克罗地亚、南韩 等国家相继暴发了该病，给养鸡业造成较大的经济损失。禽呼肠孤病毒(Avian reoviruses，ARV)是引起禽类法氏囊胸腺收缩、关节炎、骨骼异常发育、产蛋率下降 以及营养吸收障碍综合征等疾病的一种双链RNA病毒，不同性别和日龄的鸡群均可感 染。ChPV与ARV是危害养鸡业发展的主要病原，均能引起雏鸡肠道性疾病、矮小综合 症以及营养吸收障碍综合征等疾病，因此建立一种ChPV与ARV快速鉴别诊断方法对养 鸡业的健康发展具有重要意义。

目前，实验室诊断检测上述两种病原的方法以传统的病毒分离、琼脂扩散试验、 间接荧光试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等为主，但这些检测方法存在耗时长、敏 感性低、标准化难等缺点，在实际应用中具有一定的局限性，因此越来越多的学者致 力于PCR检测方法。与常规PCR相比，多重PCR具有可同时检测、鉴别多种病原体的 特点，在多种病原混合感染的鉴别诊断中具有独特的优势和很高的临床实用价值，但 目前尚无可快速鉴别诊断ChPV与ARV的多重PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的引物组合及其应用。

本发明提供了一种引物组合，由引物对I和引物对II组成；

所述引物对I由引物ChPV-F和引物ChPV-R组成；

所述引物ChPV-F为如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具 有相同功能的DNA分子；

所述引物ChPV-R为如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具 有相同功能的DNA分子；

所述引物对II由引物ARV-F和引物ARV-R组成；

所述引物ARV-F为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具 有相同功能的DNA分子；

所述引物ARV-R为如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具 有相同功能的DNA分子。

所述引物组合的用途为如下(c1)至(c6)中的任意一种：

(c1)鉴别鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒；

(c2)制备用于鉴别鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的试剂盒；

(c3)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒；

(c4)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒的试剂盒；

(c5)鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒；

(c6)制备用于鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒的试剂 盒。

本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(c1)至(c6)中的任意一种：

(c1)鉴别鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒；

(c2)制备用于鉴别鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒的试剂盒；

(c3)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒；

(c4)制备用于鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒的试剂盒；

(c5)鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒；

(c6)制备用于鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒的试剂 盒。

所述(c3)或所述(c4)中，所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、禽呼肠孤病毒、 马立克病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或传染性支气 管炎病毒。

所述(c5)或所述(c6)中，所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡口腔拭子、 鸡泄殖腔拭子、生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。

本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(d1)或(d2) 或(d3)：

(d1)鉴别鸡细小病毒和禽呼肠孤病毒；

(d2)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒；

(d3)鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒。

所述(d2)中，所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒、 传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或传染性支气管炎病毒。

所述(d3)中，所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡口腔拭子、鸡泄殖腔拭子、 生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种鉴别待测病毒为鸡细小病毒还是禽呼肠孤病毒的方法(方法 甲)，包括如下步骤：

(1)将待测病毒的基因组DNA和所述待测病毒的cDNA混合，得到混合样本；

(2)以步骤(1)得到的混合样本为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如 果采用所述引物对I可以实现对所述模板的特异性扩增、待测病毒为鸡细小病毒，如 果采用所述引物对II可以实现对所述模板的特异性扩增、待测病毒为禽呼肠孤病毒。

所述方法甲中，所述待测病毒为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒。

本发明还保护一种鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒或禽呼肠孤病毒的方法(方法 乙)，包括如下步骤：

(1)将待测病毒的基因组DNA和所述待测病毒的cDNA混合，得到混合样本；

(2)以步骤(1)得到的混合样本为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如 果采用所述引物对I可以实现对所述模板的特异性扩增、待测病毒为或候选为鸡细小 病毒，如果采用所述引物对II可以实现对所述模板的特异性扩增、待测病毒为或候选 为禽呼肠孤病毒，如果采用所述引物对I不能实现对所述模板的特异性扩增且采用所 述引物对II不能实现对所述模板的特异性扩增、待测病毒为或候选为非鸡细小病毒且 非禽呼肠孤病毒的病毒。

所述方法乙中，所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒、 传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或传染性支气管炎病毒。

本发明还保护一种鉴定待测样本是否感染鸡细小病毒和/或禽呼肠孤病毒的方法 (方法丙)，包括如下步骤：

(1)将待测样本的总DNA和所述待测样本的cDNA混合，得到混合样本；

(2)以步骤(1)得到的混合样本为模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如 果采用所述引物对I可以实现对所述模板的特异性扩增、待测样本感染或疑似感染鸡 细小病毒，如果采用所述引物对II可以实现对所述模板的特异性扩增、待测样本感染 或疑似感染禽呼肠弧病毒述引物对I可以实现对所述模板的特异性扩增且采用所述引 物对II可以实现对所述模板的特异性扩增、待测样本感染或疑似感染鸡细小病毒和禽 呼肠孤病毒，如果采用所述引物对I不能实现对所述模板的特异性扩增且如果采用所 述引物对II不能实现对所述模板的特异性扩增、待测样本疑似未感染鸡细小病毒且疑 似未感染禽呼肠孤病毒。

所述方法丙中，所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡口腔拭子、鸡泄殖腔拭子、 生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。

本发明还保护所述引物对I。

本发明还保护所述引物对I的应用，为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；

(e2)鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒。

本发明还保护含有所述引物对I的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)：

(e1)鉴定待测病毒是否为鸡细小病毒；

(e2)鉴定待测样本是否感染了鸡细小病毒。

所述(e1)中，所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒、 传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或传染性支气管炎病毒。

所述(e2)中，所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡口腔拭子、鸡泄殖腔拭子、 生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。

本发明还保护所述引物对II。

本发明还保护所述引物对II的应用，为如下(e3)或(e4)：

(e3)鉴定待测病毒是否为禽呼肠孤病毒；

(e4)鉴定待测样本是否感染了禽呼肠孤病毒。

本发明还保护含有所述引物对II的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(e3)或(e4)：

(e3)鉴定待测病毒是否为禽呼肠孤病毒；

(e4)鉴定待测样本是否感染了禽呼肠孤病毒。

所述(e3)中，所述待测病毒具体可为鸡细小病毒、禽呼肠孤病毒、马立克病毒、 传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒或传染性支气管炎病毒。

所述(e4)中，所述待测样本具体可为鸡病料，例如鸡口腔拭子、鸡泄殖腔拭子、 生鲜鸡肉、生鲜鸡内脏、鸡肉加工品、鸡内脏加工品等。

以上任一所述“采用所述引物对I可以实现对所述模板的特异性扩增”具体可体 现为得到大小为199bp-209bp的DNA片段。所述DNA片段可为如下(f1)或(f2)：(f1) 序列表的序列5所示的DNA分子；(f2)与序列表的序列5具有98％以上同源性的DNA 分子。

以上任一所述“如果采用所述引物对II可以实现对所述模板的特异性扩增”具体 可体现为得到大小为400bp-410bp的DNA分子。所述DNA片段可为如下(f3)或(f4)： (f3)序列表的序列6所示的DNA分子；(f4)与序列表的序列6具有99％以上同源性 的DNA分子。

以上任一所述混合样本中，所述基因组DNA和所述cDNA等质量混合。

以上任一所述PCR扩增的退火温度具体为56.1℃。

以上任一所述PCR扩增的反应体系中，引物组合中的各条引物的浓度如下： 0.4pmol/μLChPV-F、0.4pmol/μLChPV-R、0.4pmol/μLARV-F、0.4pmol/μLARV-R。

以上任一所述PCR扩增的反应体系(25μL)具体可为：2×PCRMix12.5μL， ChPV-F、ChPV-R各1.0μL，ARV-F、ARV-R各1.0μL，模板2.0μL，ddH₂O补足至 25.0μL。

以上任一所述PCR扩增的反应程序具体可为：95℃预变性5min；95℃1min，56.1℃ 1min，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸10min。

目前，病毒的鉴定手段主要包括传统的病毒分离、琼脂扩散试验和ELISA等，但 这些方法通常具有耗时、费力且敏感性不高等缺点，而PCR具有操作简便快速、特异 性强、敏感性高、重复性好等优点。在临床检测中，常出现多种病原体混合感染，为 了用于多种病原的鉴别诊断，迫切需要一种高通量、低成本、高效率的检测方法进行 批量快速检测。二重(或多重)PCR采用多对引物同时扩增多个模板，克服了常规PCR 的不足。但是，二重(或多重)PCR是在同一体系中存在多种模板和引物，复合扩增 中引物之间、模板之间、引物与模板之间可能存在竞争抑制。因此试验中有必要对各 种条件进行优化，需要防止引物与模板间的非特异性结合，避免出现非特性条带，同 时要尽量避免产生引物二聚体。此外，目的片段要有合适的梯度，各引物退火条件尽 可能一致，以确保两种(或多种)扩增产物量的相对平衡。

本发明建立的二重PCR可用于快速检测ChPV和ARV的混合感染，适于大批量检测， 既可节约成本和节省时间，又能减少污染，具有很高的实用价值。

附图说明

图1为实施例2中引物浓度的优化对应的电泳图。

图2为实施例2中退火温度的优化对应的电泳图。

图3为实施例3中特异性检测对应的电泳图。

图4为实施例4中敏感性检测对应的电泳图。

图5为实施例5中临床样品检测对应的电泳图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

鸡细小病毒(chickenparvovirus，缩写为ChPV)：参考文献：DayJM，ZsakL. Determinationandanalysisofthefull-lengthchickenparvovirusgenome.[J]. Virology，2010，399(1)：59-64.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

禽呼肠孤病毒(ARV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫 病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008， 19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

鸡新城疫病毒(NDV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫 病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008， 19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

马立克病毒(MDV)：参考文献：邓显文，谢芝勋，谢志勤，等.鸡传染性贫血病毒 病LAMP快速可视化检测方法的建立[J].家畜生态学报，2011，32(6)：57-60.；公众 可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

H9亚型禽流感病毒(AIVH9)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和 新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008， 19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

传染性支气管炎病毒(IBV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和 新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008， 19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

传染性喉气管炎病毒(ILTV)：参考文献：谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和 新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008， 19(3)：410-413.；公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物设计

进行大量序列分析、比对获得了用于鉴定鸡细小病毒的若干引物和用于鉴定禽呼 肠孤病毒的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得 到用于鉴定鸡细小病毒的一对引物和用于鉴定禽呼肠孤病毒的一对引物。

用于鉴定鸡细小病毒的特异性引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

ChPV-F(序列表的序列1)：CGAAGAAGAGGAACCCACC；

ChPV-R(序列表的序列2)：TCTGGCTCGTCTGGTAATC；

用于鉴定禽呼肠孤病毒的特异性引物对由如下两条引物组成(5’→3’)：

ARV-F(序列表的序列3)：TCTATGAACGGCTGACCAA；

ARV-R(序列表的序列4)：CACTAAGTGGAGGCGAAAA。

用于鉴定鸡细小病毒的引物对命名为引物对I。

用于鉴定禽呼肠孤病毒的引物对命名为引物对II。

引物组合由引物对I和引物对II组成。

实施例2、二重PCR反应条件优化

一、模板的制备

1、提取鸡细小病毒的基因组DNA，得到样本A。

2、提取禽呼肠孤病毒的总RNA，并反转录成cDNA，得到样本B。

3、将样本A和样本B混合，得到混合样本。

二、引物浓度的优化

取步骤一得到的混合样本，作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCRMix12.5μL，步骤一得到的混合 样本2.0μL(2.0μL混合样本中，鸡细小病毒的基因组DNA的含量为0.58ng，禽呼 肠孤病毒的cDNA的含量为0.53ng)，引物对I和引物对II，最后用ddH₂O补足至25.0 μL。

根据引物对I和引物对II在反应体系中的浓度，设置9种不同的反应体系，具体 如下：

反应体系I：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.08pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.72pmol/μL。

反应体系II：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.16pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.64pmol/μL。

反应体系III：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.24pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.56pmol/μL。

反应体系IV：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.32pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.48pmol/μL。

反应体系V：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓度 均为0.4pmol/μL。

反应体系VI：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.48pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.32pmol/μL。

反应体系VII：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.56pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.24pmol/μL。

反应体系VIII：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.64pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.16pmol/μL。

反应体系IX：ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.72pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓 度均为0.08pmol/μL。

二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、56.1℃1min、72℃1min， 进行35个循环；72℃延伸10min。

将二重PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

设置用等体积水代替混合样本的阴性对照；阴性对照相应的反应体系中，ChPV-F 和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓度均为0.4pmol/μL。

结果见图1。图1中，泳道1-9依次对应采用反应体系I-IX时得到的二重PCR的 扩增产物，M对应100bpDNAMarker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。综合 考虑引物对I和引物对II的扩增效果，最佳引物浓度组合为：ChPV-F和ChPV-R的浓 度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓度均为0.4pmol/μL。

三、退火温度的优化

取步骤一得到的混合样本，作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCRMix12.5μL，步骤一得到的混合 样本2.0μL(2.0μL混合样本中，鸡细小病毒的基因组DNA的含量为0.58ng，禽呼 肠孤病毒的cDNA的含量为0.53ng)，引物对I和引物对II，最后用ddH₂O补足至25.0 μL。二重PCR的反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和 ARV-R的浓度均为0.4pmol/μL。

二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、退火1min、72℃1min，进 行35个循环；72℃延伸10min。

分别设置如下退火温度：

退火温度I：50.0℃；

退火温度II：50.7℃；

退火温度III：51.9℃；

退火温度IV：53.8℃；

退火温度V：56.1℃；

退火温度VI：58.0℃；

退火温度VII：59.2℃；

退火温度VIII：60.0℃。

将二重PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

设置用等体积水代替混合样本的阴性对照，其相应的退火温度为56.1℃。

结果见图2，图2中，泳道1-8依次对应退火温度I-VIII时得到的二重PCR的扩增 产物，M对应100bpDNAMarker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。综合考虑 引物对I和引物对II的扩增效果，最佳退火温度为56.1℃。

综合步骤二和步骤三，得到如下结论：二重PCR反应体系中，ChPV-F和ChPV-R 的优选浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的优选浓度均为0.4pmol/μL；二重PCR 的优选反应程序为：95℃预变性5min；95℃1min、56.1℃1min、72℃1min，进行 35个循环；72℃延伸10min。

实施例3、特异性

1、提取待测样本的基因组DNA。待测样本分别为：鸡细小病毒(ChPV)、马立克病 毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)。

2、提取待测样本的总RNA，并反转录成cDNA。待测样本分别为：禽呼肠孤病毒 (ARV)、鸡新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(AIVH9)、传染性支气管炎病毒(IBV)。

3、分别将步骤1得到的各个基因组DNA样本、步骤2得到的各个cDNA样本以及 实施例2的步骤一得到的混合样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重 PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCRMix12.5μL，模板2.0μL，引 物对I和引物对II，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系中，ChPV-F 和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓度均为0.4pmol/μL。设置 用等体积水代替混合样本的阴性对照。

模板为步骤1得到的各个基因组DNA样本时，2.0μL模板中的DNA含量0.58ng；

模板为步骤2得到的各个cDNA样本时，2.0μL模板中的DNA含量0.53ng；

模板为实施例2的步骤一得到的混合样本时，2.0μL模板中鸡细小病毒的基因组 DNA的含量为0.58ng、禽呼肠孤病毒的cDNA的含量为0.53ng。

二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、56.1℃1min、72℃1min， 进行35个循环；72℃延伸10min。

将二重PCR的扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

结果见图3。图3中，1为混合样本的二重PCR的扩增产物，2为ARV的cDNA的 二重PCR的扩增产物，3为ChPV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，4为NDV的cDNA 的二重PCR的扩增产物，5为MDV的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，6为AIVH9 的cDNA的二重PCR的扩增产物，7为IBV的cDNA的二重PCR的扩增产物，8为ILTV 的基因组DNA的二重PCR的扩增产物，M对应100bpDNAMarker，N对应阴性对照的 二重PCR的扩增产物。结果表明，ChPV扩增出204bp的特异性条带(经测序，如序列 表的序列5所示)，ARV扩增出405bp的特异性条带(经测序，如序列表的序列6所示)， 而NDV、MDV、AIVH9、IBV、ILTV均无特异性条带出现。

实施例4、敏感性

一、制备模板

1、提取鸡细小病毒的基因组DNA，得到DNA浓度为58.2ng/μL的DNA溶液。

2、提取禽呼肠孤病毒的总RNA，并反转录成cDNA，得到DNA浓度为53.0ng/μL 的DNA溶液。

3、将步骤1得到的DNA溶液和步骤2得到的DNA溶液混合。

4、用ddH₂O10倍梯度稀释步骤3得到的混合液，得到各个稀释液。

二、敏感性的检测

将步骤一得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCRMix12.5μL，步骤一得到的稀释 液1μL，引物对I和引物对II，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的反应体系 中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓度均为0.4pmol/ μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。

由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：

反应体系1中，鸡细小病毒DNA的初始含量为58.2ng、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为53.0ng；

反应体系2中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.8ng、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为5.3ng；

反应体系3中，鸡细小病毒DNA的初始含量为582pg、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为530pg；

反应体系4中，鸡细小病毒DNA的初始含量为58pg、禽呼肠孤病毒DNA的初始含 量为53pg；

反应体系5中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.8pg、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为5.3pg；

反应体系6中，鸡细小病毒DNA的初始含量为582fg、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为530fg；

反应体系7中，鸡细小病毒DNA的初始含量为58fg、禽呼肠孤病毒DNA的初始含 量为53fg；

反应体系8中，鸡细小病毒DNA的初始含量为5.8fg、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为5.3fg；

反应体系9中，鸡细小病毒DNA的初始含量为0.58fg、禽呼肠孤病毒DNA的初始 含量为0.53fg。

二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、56.1℃1min、72℃1min， 进行35个循环；72℃延伸10min。

将二重PCR的产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

结果见图4。图4中，泳道1-9依次对应采用反应体系1-9时二重PCR的扩增产 物，M对应100bpDNAMarker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物。结果表明， 最低能同时检测到58fg的ChPV和53fg的ARV。

实施例5、临床样品检测

2014年10月-2015年12月采集50份鸡病料(口腔+泄殖腔双棉拭子)，按如下步 骤进行鉴定：

1、取病料，提取总DNA。

2、取病料，提取总RNA并反转录得到cDNA。

3、将步骤1得到的基因组DNA(DNA含量为Xng)和步骤2得到的cDNA混合(DNA 含量也为Xng)，得到混合样本。

4、将步骤3得到的混合样本作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行二重 PCR。

二重PCR的反应体系(25.0μL)：包含2×PCRMix12.5μL，模板2.0μL(DNA 含量为0.5-2ng)，引物对I和引物对II，最后用ddH₂O补足至25.0μL。二重PCR的 反应体系中，ChPV-F和ChPV-R的浓度均为0.4pmol/μL，ARV-F和ARV-R的浓度均为 0.4pmol/μL。设置用等体积水代替混合样本的阴性对照。设置用等体积的实施例二步 骤一得到的混合样本代替步骤3得到的混合样本的阳性对照。

二重PCR的反应程序：95℃预变性5min；95℃1min、56.1℃1min、72℃1min， 进行35个循环；72℃延伸10min。

将二重PCR的产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳并拍照。

部分检测结果见图5。图5中，P对应阳性对照的二重PCR的扩增产物，M对应100bp DNAMarker，N对应阴性对照的二重PCR的扩增产物，泳道1-22依次对应50份鸡病 料中22份的检测结果(泳道5、11、13、14、15、17和18显示ChPV阳性结果)。统 计结果，50份鸡病料中共检出8份ChPV阳性病料，未检出ARV阳性病料。

五次重复检测，结果一致。

将显示ChPV阳性结果的泳道中的特异条带回收并测序，其测序结果与序列5的同 源性高达98％。

采用传统的病毒分离培养法鉴定上述50份样本，结果与本发明建立的方法的结果 完全一致。