一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-B3h基因的分子标记及应用

摘要

本发明公开了一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-B3h基因的分子标记及应用。所述分子标记由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成。实验证明：通过该分子标记能快速筛选出具有Glu-B3h基因的小麦品种，相应的面粉品质也会提高，从而加速含有优质基因的小麦新品种的育成步伐。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-B3h基因的分子标记及应用。

背景技术

小麦作为世界三大谷物之一，总产量仅次于水稻和玉米，是世界约35％人口的主粮。小麦的营养价值高，籽粒富含蛋白质、脂肪和糖类三大营养物质，同时富含钙、铁等无机盐矿物质以及硫胺素、核黄素、烟酸及维生素A等。小麦蛋白是人类重要的植物蛋白质来源，约占谷物蛋白质的38.4％。由于小麦自身所特有的蛋白质面筋成分赋予其良好的加工特性，小麦面粉可用来制作面包、面条、饼干、包子、蛋糕、馒头、烧饼等专用食物。小麦面粉的加工特性主要取决于籽粒贮藏蛋白的种类和特性，贮藏蛋白包括麦醇溶蛋白(Gliadins)和麦谷蛋白(Glutenins)两大类，占小麦种子蛋白总量的85％左右，其中麦醇溶蛋白主要影响面团的延展性，而麦谷蛋白主要决定面团的粘弹性。根据电泳迁移率的不同，麦谷蛋白分为高分子量谷蛋白亚基(Highmoleculargluteninsubunits,HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚基(Lowmoleculargluteninsubunits,LMW-GS)两大类，HMW-GS主要影响面团的弹性，LMW-GS决定面团的粘性，对面团强度和面包品质亦有重要作用。

LMW-GS含量较高，约占整个种子贮藏蛋白的1/3，占麦谷蛋白含量的60％。LMW-GS基因不含有内含子，基因较小，大部分在900-1200bp之间，而且LMW-GS基因拷贝数较多，大概有10-15个或35-40个，大部分位于第1部分同源染色体短臂上的Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3位点上。小麦LMW-GS存在广泛的等位变异，早在1990年，已有人在普通小麦中鉴定并命名了20个低分子量谷蛋白亚基，其中6个由Glu-A3编码，9个由Glu-B3编码，5个由Glu-D3编码；最近，在小偃54小麦品种中，也鉴定到了14个低分子量谷蛋白亚基，有4个在Glu-A3位点，3个在Glu-B3位点，7个在Glu-D3位点。

低分子量谷蛋白亚基含量、亚基类型及编码位点均与品质密切相关，不同的低分子量谷蛋白的数量和组成对小麦品质具有不同的影响。研究表明，拥有1B染色体上LMW-2特异等位亚基的硬粒小麦加工的比萨品质最好，而具有LMW-1等位亚基的小麦加工品质则较差。LMW-2和LMW-1结构差异很小，只有重复区15个氨基酸残基的替换，造成品质差异的原因主要是LMW-2含量比LMW-1丰富。另外，在标准面粉中添加等量的但不同的诱导亚基，发现不同的亚基其揉面参数也不同。同时，一些研究认为有些LMW-GS编码位点间存在互作效应，亚基组合为Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3b的品种具有最好的延伸性，亚基组合为Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3c的品种的延伸性也较好，亚基组合为Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3b，Glu-A3b、Glu-B3b和Glu-D3c以及Glu-A3c、Glu-B3b和Glu-D3c的品种，其面包品质最好。由此可见，LMW-GS与小麦品质之间具有密切的关系，不同亚基的影响也不尽相同。

由于HMW-GS基因拷贝数较少，易于区分，其等位基因变异以及与小麦品质的关系已得到了较为深入的研究，针对其重要亚基的功能标记也已经开发并应用，与HMW-GS相比，LMW-GS存在更丰富的等位变异，迁移率具有较高的相似性，且数目较多、分子量小、在电泳图谱上与大量的醇溶蛋白相互重叠，因此对LMW-GS及其编码基因与品质参数之间关系的研究相对较少。随着研究方法的不断改进，大量的LMW-GS及其基因得到鉴定与克隆，且对品质具有重要作用亚基的功能标记也被开发和应用。随着社会的进步与人民生活质量的提高，人们对小麦面粉品质提出了更高的要求，总体来说，小麦面粉品质的主要影响因素包括蛋白质含量和组成、淀粉组成和特性、以及籽粒硬度等，其中种子贮藏蛋白特别是麦谷蛋白的组成，仍是国内外小麦品质改良的研究热点，而培育出优质的小麦新品种对于育种工作者也是迫在眉睫。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦品种的加工品质的方法。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测小麦品种的加工品质的方法包括如下步骤：检测待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因，含有Glu-B3h基因的小麦的加工品质高于不含有Glu-B3h基因的小麦的加工品质。

上述方法中，所述检测待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因的方法为如下(1)或(2)：

(1)直接测序；

(2)以待测小麦的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，根据所述PCR扩增产物确实所述待测小麦是否含有Glu-B3h基因；

所述PCR扩增的引物为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列X所示的单链DNA分子和序列Y所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列X为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列Y为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

若所述PCR扩增产物含有大小为881bp的条带，则待测小麦品种含有或候选含有Glu-B3h基因；

若所述PCR扩增产物不含有大小为881bp的条带，则待测小麦品种不含有或候选不含有Glu-B3h基因。

本发明的另一个目的是提供检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质的新用途。

本发明提供了检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质在鉴定或辅助鉴定待测小麦品种的加工品质中的应用。

本发明还提供了检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测小麦品种的加工品质的产品中的应用。

本发明还提供了检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质在小麦育种中的应用。

本发明还提供了检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质在制备小麦育种的产品中的应用。

本发明还提供了检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质在选育加工品质高的小麦中的应用。

本发明还提供了检测待测小麦是否含有Glu‐B3h基因的物质在制备选育加工品质高的小麦的产品中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测小麦品种的加工品质的产品。

本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测小麦品种的加工品质的产品为检测待测小麦品种是否含有Glu‐B3h基因的物质。

上述应用或上述产品中，所述检测待测小麦品种是否含有Glu-B3h基因的物质为如下1)或2)或3)或4)：

1)由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成的引物对A；

2)由序列X所示的单链DNA分子和序列Y所示的单链DNA分子组成的引物对B；

所述序列X为将序列1删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列1具有相同功能的核苷酸；

所述序列Y为将序列2删除或增加或改变一个或几个核苷酸，且与序列2具有相同功能的核苷酸；

3)含有1)所述引物对A或2)所述引物对B的PCR试剂；

4)含有1)所述引物对A或2)所述引物对B或3)所述PCR试剂的试剂盒。

本发明的最后一个目的是提供一种选育加工品质高的小麦的方法。

本发明提供的选育加工品质高的小麦的方法包括选择含有Glu-B3h基因的小麦进行育种。

上述方法或上述应用或上述产品中，所述Glu-B3h基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；所述加工品质为吸水率、延展性、面包重量、面包体积和/或面包分数。

本发明提供了一种普通小麦低分子量谷蛋白Glu-B3h基因的分子标记，该分子标记由由序列1所示的单链DNA分子和序列2所示的单链DNA分子组成。实验证明：通过该分子标记能快速筛选出具有Glu-B3h基因的小麦品种，相应的面粉品质也会提高，从而加速含有优质基因的小麦新品种的育成步伐。

附图说明

图1为在28个含有不同的低分子量谷蛋白亚基的品种中分子标记的检测结果。

图2为分子标记在重组自交系中的检测结果。其中，图2A为重组自交系的SDS-PAGE图；图2B为分子标记在重组自交系中的扩增结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的实验材料CB037B和CB037C均在文献“YuZT,HanCX,YanX,LiXH,JiangGL,andYanYM,RapidCharacterizationofWheatLowMolecularWeightGluteninSubunitsbyUltraperformanceLiquidChromatography(UPLC),JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2013,61,4026-4034.”中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。

下述实施例中的表2中编号为1-2---1-27的材料均在文献“WangL,LiG,RJ,XiaXC,HeZH,DevelopmentofSTSmarkersandestablishmentofmultiplexPCRforGlu-A3allelesincommonwheat(TriticumaestivumL.).JournalofCerealScience,2010,51(3):305-312.”中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。

下述实施例中的宁春4号在文献“GeP,MaCY,WangSL,GaoLY,LiXH,GuoGF,MaWJ,YanYM,Comparativeproteomicanalysisofgraindevelopmentintwospringwheatvarietiesunderdroughtstress.AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2012,402(3):1297-1313.”中公开过，公众可从首都师范大学生命科学学院获得。

实施例1、鉴定小麦品种中是否含有Glu-B3h基因的方法

1、DNA提取

用CTAB法提取普通小麦叶片的基因组DNA，用ddH₂O溶解提取的基因组DNA，并将其经1％琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，要求提取的基因组DNA无明显杂质、条带清晰、无降解。

2、PCR扩增

以上述步骤1获得的基因组DNA为模板，采用表1中的分子标记Glu-B3hF和Glu-B3hR进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

表1、用于鉴定小麦Glu-B3h基因等位变异的分子标记

PCR体系为：模板DNA约100ng，TaqPlus酶(天根生化技术有限公司，ET105)0.5μL，GCbufferII25μL(Takara，DRR20GCI)，dNTP(Takara，D4030RA)3μL，上、下游引物(引物序列见表1，浓度10μM)各1μL，用无菌超纯水补充反应体系至50μL。

PCR反应程序：94℃，4min；94℃，45s；57℃，50s；72℃，30s；72℃，10min，循环数为30，4℃保温。

3、电泳

取6μL步骤2获得的PCR扩增产物，加2μL上样指示剂(10×LoadingBuffer)，1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。若PCR扩增产物的大小为881bp的条带，说明该小麦品种中含有Glu-B3h基因，Glu-B3h基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

4、测序

选取部分样品切胶送公司测序(北京诺塞基因组研究中心有限公司)，进一步确认验证扩增条带为目标条带。测序结果表明：PCR扩增得到大小为881bp的条带，其核苷酸序列如序列表中序列3第115-995位核苷酸分子所示。

因此可以用如下方法鉴定待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因：

(1)提取待测小麦品种的基因组DNA；

(2)以基因组DNA为模板，采用分子标记Glu-B3hF和Glu-B3hR进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；若PCR扩增产物大小为881bp，则待测小麦品种含有或候选含有Glu-B3h基因。Glu-B3h基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

实施例2、分子标记的应用

一、分子标记在鉴定待测小麦是否含有Glu-B3h基因中的应用

1、用实施例1中的鉴定待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因的方法检测28个具有不同低分子量谷蛋白(LMW-GS)组成的材料(表2中材料编号1-1～1-28)中是否含有Glu-B3h基因，来验证实施例1中的分子标记是否正确。

检测结果如图1和表2所示，泳道1-泳道28对应表2中材料编号1-1～1-28。只有在含有Glu-B3h基因的材料中能扩出881bp的特异条带，而在其他品种中不能得到条带，说明本发明的方法可有效的鉴定待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因。

2、用宁春4号和普通小麦品系CB037B(含Glu-B3h)进行人工杂交，后代分离得到F₁代，从F₂代起用单粒传法构建了杂交后代重组自交系群体(RIL)直到F₅代，用实施例1的鉴定待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因的方法对重组自交系后代的样本材料(公众可从首都师范大学生命科学学院获得)进行检测。

检测结果如图2和表2所示。其中，图2A(SDS-PAGE图)和图2B(琼脂糖凝胶电泳图)中的泳道1：CB037B；泳道2：CB037C；泳道3-17对应表2中的编号2-3～2-17。从图2和表2可以看出，只有在含有Glu-B3h基因的材料中能扩出881bp的特异条带，而在其他品种中不能得到条带。说明本发明的方法可有效的鉴定待测小麦品种中是否含有Glu-B3h基因。

表2、用于检测Glu-B3h基因等位变异特异性引物的材料

二、分子标记在鉴定待测小麦加工品质中的应用

对不同地点(北京和青海)生长的小麦材料CB037B(含Glu-B3h)和CB037C(不含Glu-B3h)小麦加工品质参数(吸水率、延伸性、面包重量、面包体积、面包分数)进行检测。检测的具体步骤参考文献“WangSL,YuZT,CaoM,ShenXX,LiN,LiXH,MaWJ,WeiβgerberH,ZellerFriedrich,HsamSai,YanYM,MolecularmechanismsofHMWgluteninsubunitsfrom1S^lgenomeofAegilopslongissimapositivelyaffectingwheatbreadmakingquality.PLoSOne,2013,8(4):e58947.”中的方法。

小麦材料CB037B和CB037C的小麦加工品质参数检测结果如表3所示：从表中可以看出，CB037B(含Glu-B3h)的吸水率、延展性、面包重量、面包体积和面包分数高于CB037C(不含Glu-B3h)。说明含有Glu-B3h的材料的小麦加工品质参数都比不含有Glu-B3h的材料要高，且差异显著，不含有Glu-B3h基因的小麦加工品质下降。由此得出结论：Glu-B3h基因对小麦的加工品质具有非常重要的作用。

表3、不同地点生长的CB037B和CB037C的加工品质检测结果比较

不同小写字母表示差异显著P＝0.05。