1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用

摘要

本发明公开了1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应用。本发明也涉及编码该酶的核苷酸序列，被导入核苷酸序列的重组宿主以及利用重组宿主制备1,2,4-丁三醇的方法。本发明提供的酶可以催化木糖生物合成1,2,4-丁三醇途径中的关键步骤，该酶的应用显著提高了重组宿主1,2,4-丁三醇的生产能力。本发明还构建了利用木糖生产1,2,4-丁三醇能力提高的重组大肠杆菌。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中1,2,4-丁三醇相关蛋白在生物法制备1,2,4-丁三醇中的应 用。

背景技术

从自然资源中发掘新酶或人工设计新酶是合成生物技术的基础，自然界中的生物多样性 和丰富的基因资源为发掘具有心功能的酶提供了广阔的来源，通过挖掘新酶已经使人类能够 合成很多自然界中不存在的有用化学品。

1,2,4-丁三醇是一种在军工和民用上都具有重要用途的化学品。它是一种手性多羟基醇， 作为重要的有机合成中间体，可用于制备生物活性剂、医药用缓释剂、卷烟添加剂、抗菌剂、 彩色显影剂等。其硝化产物1,2,4-丁三醇三硝酸酯，可作为飞机、火箭、导弹等军事武器的 推进剂，较硝化甘油具有冲击敏感性低、热稳定性好等优点。目前，1,2,4-丁三醇的工业化 生产主要依靠化学合成法，缺点是副产物多，产物产率低，对环境有危害等，由此也限制了 1,2,4-丁三醇及1,2,4-丁三醇三硝酸酯的商业前景。

自然界不存在1,2,4-丁三醇的天然生物合成途径，所以生物法生产1,2,4-丁三醇的研究 进展比较缓慢。2003年，WeiNiu等使用双微生物工艺，以D-木糖和L-阿拉伯糖为碳源，建 立了1,2,4-丁三醇的生物合成途径(Niu,W.,Molefe,M.N.,Frost,J.W.Microbial synthesisoftheenergeticmaterialprecursor1,2,4-butanetriol.Journalofthe AmericanChemicalSociety.2003,125(43):12998-12999.)。随后进一步改良该方法，建 立了在大肠杆菌利用D-木糖合成1,2,4-丁三醇的生物合成系统(J·W·佛罗斯特，W·牛， D-1,2,4-丁三醇的微生物合成，中国专利申请号：200780032753.9，申请日：2007年7月19 日)。这些研究中，从木糖转化为1,2,4-丁三醇的生物反应途径主要包括脱氢、脱水、脱羧、 加氢4步反应，其中，第二步(脱水)和第四步(加氢)反应所需的酶在大肠杆菌中天然存 在，而第一步和第三步反应的酶需外源导入。前人研究中催化第一步脱氢反应的酶为木糖脱 氢酶(XDH)，来源于新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)；催化第三步反应的酶为2-酮 酸脱羧酶，是来自恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高生物法生产1,2,4-丁三醇的产量和得率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供1,2,4-丁三醇相关蛋白或其编码基因在制备 1,2,4-丁三醇中的应用。

本发明所提供的1,2,4-丁三醇相关蛋白在制备1,2,4-丁三醇中的应用中，所述1,2,4- 丁三醇相关蛋白的名称为BSRP，所述BSRP，是如下B1)或B2)的蛋白质：

B1)氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白质；

B2)在SEQIDNo.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有相同功能的由B1)衍生的蛋白质。

其中，SEQIDNo.1由548个氨基酸残基组成。

上述B2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述 B2)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸 残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

上述应用中，所述BSRP的基因为下述B11)-B13)中的任一种DNA分子：

B11)编码序列是SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸所示的cDNA分子或基因组DNA；

B12)在严格条件下与B11)限定的DNA分子杂交且编码所述BSRP的cDNA分子或基因组 DNA；

B13)与B11)或B12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述BSRP的cDNA 分子或基因组DNA。

其中，SEQIDNo.2由1726个核苷酸组成，SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸编码SEQ IDNo.1所示的氨基酸。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对 本发明的编码所述BSRP的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得 到的所述BSRP的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述BSRP，均是衍生于 本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“75％以上的同一性”包括 与本发明的编码BSRP的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％ 或更高，或97％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以 用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2 次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种构建用于生产1,2,4-丁三醇的重组细胞的方 法。

本发明所提供的构建用于生产1,2,4-丁三醇的重组细胞的方法，包括对受体细胞进行 A3)、A5)、A6)和A7)的改造得到重组细胞的步骤：

A3)将所述受体细胞的木糖异构酶基因敲除；

A5)向所述受体细胞中导入木糖脱氢酶基因；

A6)向所述受体细胞中导入醇脱氢酶基因；

A7)向所述受体细胞中导入1,2,4-丁三醇相关蛋白基因；

所述受体细胞为微生物细胞、非人动物细胞或植物细胞。

上述方法中，所述方法还包括对所述受体细胞进行A1)、A2)和A4)中任一种、任两种 或三种的改造得到重组细胞的步骤：

A1)将所述受体细胞的2-酮酸脱氢酶基因敲除；

A2)将所述受体细胞的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因敲除；

A4)将所述受体细胞的木酮糖激酶基因敲除；

上述方法中，所述微生物细胞可来自埃希氏菌属(Escherichia)，如大肠杆菌，具体可 为BL21(DE3)、大肠杆菌BW25113或大肠杆菌BW25113的突变体等。

由于在所述大肠杆菌中存在如图8所示的代谢途径，所以，上述方法中所述重组细胞可 为对受体细胞进行所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，所述 重组细胞还可为对受体细胞进行所述所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、 所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述A1)、所述A3)、所述 A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述A2)、所述A3)、 所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A3)、 所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述 所述A1)、所述A2)、所述A3)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造得到的重组细胞，或 对受体细胞进行所述所述A1)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6)和所述A7)的改造 得到的重组细胞，或对受体细胞进行所述所述A2)、所述A3)、所述A4)、所述A5)、所述A6) 和所述A7)的改造得到的重组细胞。

上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因为2-酮酸脱氢酶基因ycdW和yiaE；所述3-脱氧 -D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因为3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE和yjhH；所述木 糖异构酶基因为木糖异构酶基因xylA；所述木酮糖激酶基因为木酮糖激酶基因xylB；所述醇 脱氢酶基因为醇脱氢酶基因adhP；所述木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xdh。

上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE编码下述H1)或H2)的蛋白质：

H1)氨基酸序列为SEQIDNo.3的蛋白质；

H2)在SEQIDNo.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由H1)衍生的蛋白质；

所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW编码下述I1)或I2)的蛋白质：

I1)氨基酸序列为SEQIDNo.5的蛋白质；

I2)在SEQIDNo.5所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有2-酮酸脱氢酶功能的由I1)衍生的蛋白质；

所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE编码下述J1)或J2)的蛋白质：

J1)氨基酸序列为SEQIDNo.7的蛋白质；

J2)在SEQIDNo.7所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由J1)衍生的蛋白质；

所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH编码下述K1)或K2)的蛋白质：

K1)氨基酸序列为SEQIDNo.9的蛋白质；

K2)在SEQIDNo.9所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶功能的由K1)衍生的蛋白质；

所述木糖脱氢酶基因xdh编码下述L1)或L2)的蛋白质：

L1)氨基酸序列为SEQIDNo.11的蛋白质；

L2)在SEQIDNo.11所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有木糖脱氢酶功能的由L1)衍生的蛋白质；

所述醇脱氢酶基因adhP编码下述M1)或M2)的蛋白质：

M1)氨基酸序列为SEQIDNo.13的蛋白质；

M2)在SEQIDNo.13所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有醇脱氢酶功能的由M1)衍生的蛋白质；

所述木糖异构酶基因xylA编码下述O1)或O2)的蛋白质：

O1)氨基酸序列为SEQIDNo.17的蛋白质；

O2)在SEQIDNo.17所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有木糖异构酶功能的由O1)衍生的蛋白质；

所述木酮糖激酶基因xylB编码下述P1)或P2)的蛋白质：

P1)氨基酸序列为SEQIDNo.19的蛋白质；

P2)在SEQIDNo.19所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基 酸残基得到的具有木酮糖激酶功能的由P1)衍生的蛋白质。

上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE为下述H11)-H13)中的任一种DNA分子：

H11)编码序列是SEQIDNo.4的cDNA分子或基因组DNA；

H12)在严格条件下与H11)限定的DNA分子杂交且编码所述2-酮酸脱氢酶的cDNA分子 或基因组DNA；

H13)与H11)或H12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述2-酮酸脱氢酶 的cDNA分子或基因组DNA；

所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW为下述I11)-I13)中的任一种DNA分子：

I11)编码序列是SEQIDNo.6的cDNA分子或基因组DNA；

I12)在严格条件下与I11)限定的DNA分子杂交且编码所述2-酮酸脱氢酶的cDNA分子 或基因组DNA；

I13)与I11)或I12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述2-酮酸脱氢酶 的cDNA分子或基因组DNA；

所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE为下述J11)-J13)中的任一种DNA分子：

J11)编码序列是SEQIDNo.8的cDNA分子或基因组DNA；

J12)在严格条件下与J11)限定的DNA分子杂交且编码所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛 缩酶的cDNA分子或基因组DNA；

J13)与J11)或J12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述3-脱氧-D-甘 油-戊酮糖酸醛缩酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH为下述K11)-K13)中的任一种DNA分子：

K11)编码序列是SEQIDNo.10的cDNA分子或基因组DNA；

K12)在严格条件下与K11)限定的DNA分子杂交且编码所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛 缩酶的cDNA分子或基因组DNA；

K13)与K11)或K12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述3-脱氧-D-甘 油-戊酮糖酸醛缩酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述木糖脱氢酶基因xdh为下述L11)-L13)中的任一种DNA分子：

L11)编码序列是SEQIDNo.12的cDNA分子或基因组DNA；

L12)在严格条件下与L11)限定的DNA分子杂交且编码所述木糖脱氢酶的cDNA分子或 基因组DNA；

L13)与L11)或L12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木糖脱氢酶的 cDNA分子或基因组DNA；

所述醇脱氢酶基因adhP为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：

M11)编码序列是SEQIDNo.14的cDNA分子或基因组DNA；

M12)在严格条件下与M11)限定的DNA分子杂交且编码所述醇脱氢酶的cDNA分子或基 因组DNA；

M13)与M11)或M12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述醇脱氢酶的cDNA 分子或基因组DNA；

所述苯甲酰甲酸脱羧酶基因mdlC为下述M11)-M13)中的任一种DNA分子：

N11)编码序列是SEQIDNo.16的cDNA分子或基因组DNA；

N12)在严格条件下与N11)限定的DNA分子杂交且编码所述苯甲酰甲酸脱羧酶的cDNA 分子或基因组DNA；

N13)与N11)或N12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述苯甲酰甲酸脱 羧酶的cDNA分子或基因组DNA；

所述木糖异构酶基因xylA为下述O11)-O13)中的任一种DNA分子：

O11)编码序列是SEQIDNo.18的cDNA分子或基因组DNA；

O12)在严格条件下与O11)限定的DNA分子杂交且编码所述木糖异构酶的cDNA分子或 基因组DNA；

O13)与O11)或O12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木糖异构酶的 cDNA分子或基因组DNA；

所述木酮糖激酶基因xylB为下述P11)-P13)中的任一种DNA分子：

P11)编码序列是SEQIDNo.20的cDNA分子或基因组DNA；

P12)在严格条件下与P11)限定的DNA分子杂交且编码所述木酮糖激酶的cDNA分子或 基因组DNA；

P13)与P11)或P12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述木酮糖激酶的 cDNA分子或基因组DNA。

上述方法中，所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE的编码序列如SEQIDNo.4所示，编码由SEQ IDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶；2-酮酸脱氢酶基因ycdW的编码序列 如SEQIDNo.6所示，编码由SEQIDNo.5所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶； 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE的编码序列如SEQIDNo.8所示，编码由SEQIDNo.7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸 醛缩酶基因yjhH的编码序列如SEQIDNo.10所示，编码由SEQIDNo.9所示的氨基酸序列 组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；木糖脱氢酶基因xdh的编码序列如SEQID No.12所示，编码由SEQIDNo.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质木糖脱氢酶；醇脱氢酶基 因adhP的编码序列如SEQIDNo.14所示，编码由SEQIDNo.13所示的氨基酸序列组成的蛋 白质醇脱氢酶；木糖异构酶基因xylA的编码序列如SEQIDNo.18所示，编码由SEQIDNo.17 所示的氨基酸序列组成的蛋白质木糖异构酶；木酮糖激酶基因xylB的编码序列如SEQID No.20所示，编码由SEQIDNo.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质木酮糖激酶。

上述方法中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2 次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

上述方法中，所述A1)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因yiaE 替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱 氢酶基因yiaE敲除，和/或将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因ycdW替换为 两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基 因ycdW敲除；

所述A2)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因 yagE替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述大肠杆菌BW25113的所述3- 脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE敲除，和/或将所述大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧 -D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因从而将所述 大肠杆菌BW25113的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH敲除；

所述A3)、所述A4)、所述A5)和所述A6)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述木 糖异构酶基因xylA和所述木酮糖激酶基因xylB替换为含有所述醇脱氢酶基因adhP和所述木 糖脱氢酶基因xdh的DNA分子从而将所述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基因xylA和所 述木酮糖激酶基因xylB敲除并导入所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh；

所述A3)、所述A5)和所述A6)具体可为将所述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基 因xylA替换为含有所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh的DNA分子从而将所 述大肠杆菌BW25113的所述木糖异构酶基因xylA敲除并将所述醇脱氢酶基因adhP和所述木 糖脱氢酶基因xdh导入所述受体细胞中；

所述A7)具体可为将所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因bsrp或所述1,2,4-丁三醇相关蛋 白基因bsrp的优化的核苷酸序列导入目的受体细胞(宿主细胞)，得到重组细胞，导入方法 可以为重组到所述受体细胞的染色体上，或者以表达载体的形式，使bsrp存在于所述受体细 胞中，且能在所述受体细胞中进行功能性表达。

上述方法中，所述含有所述醇脱氢酶基因adhP和所述木糖脱氢酶基因xdh的DNA分子具 体可为核苷酸序列为SEQIDNo.21的DNA分子。

其中，SEQIDNo.21的第1-747位核苷酸与序列表中SEQIDNo.12位核苷酸一致，编 码SEQIDNo.11所示的氨基酸序列，SEQIDNo.21的第1315-2325位核苷酸与SEQIDNo.14 的第1-1011位核苷酸反向互补，SEQIDNo.21的第2349-2377位核苷酸与tac启动子的核 苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第896-924位核苷酸与rrnBT2终止子的核苷酸序列反 向互补，SEQIDNo.21的第1055-1009位核苷酸与rrnBT1终止子的核苷酸序列反向互补， SEQIDNo.21的第2334-2337位核苷酸与RBS的核苷酸序列反向互补。

上述方法中，所述受体细胞(宿主细胞)为能产生3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸的目的生物 细胞。

上述方法中，bsrp基因可通过bsrp表达盒导入。

上述方法中，可用现有的表达载体构建含有bsrp基因表达盒的重组载体。

上述方法中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述方法中，bsrp基因通过SEQIDNo.2的所示的DNA分子导入所述受体细胞。

在本发明的一个实施例中，bsrp基因是将SEQIDNo.2的SgrAI和NcoI的位点之间的 序列替换为质粒pET30a(+)的SgrAI和NcoI的之间的序列，保持pET30a(+)的其他序列 不变，得到名称为pET30a-miniPtac-bsrp的重组载体。其中，SEQIDNo.2由1726个核苷 酸组成，SEQIDNo.2的第18-46位核苷酸为minPtac启动子，SEQIDNo.2的第58-64位核 苷酸为RBS，SEQIDNo.2的第71-1717位核苷酸为bsrp基因的核苷酸序列，编码SEQIDNo.1 所示的氨基酸序列。

用上述方法构建的重组细胞，也属于本发明的保护范围。

用于构建所述重组细胞的生物材料，也属于本发明的保护范围。

上述生物材料为下述C1)或C2)：

C1)用于构建所述重组细胞的成套DNA分子，由所述木糖脱氢酶基因、所述醇脱氢酶基 因和所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因组成，这三个基因各自独立包装；

C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三个基因、或其中任两个基因或其中任一个基因 的载体。

上述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或上述重组细胞在生物转化D-木糖或L- 阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用，也属于本发明的保护范围。

上述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或上述重组细胞在生物转化D-木糖或L- 阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用，具体可包括下述步骤a)和b)：

a)用培养基培养上述重组细胞，收集培养物(如发酵液)；

b)从所述培养物中分离和/或纯化1,2,4-丁三醇，得到1,2,4-丁三醇。

上述重组细胞在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或上述重组细胞在生物转化D-木糖或L- 阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用中，所述培养基含有D-木糖或L-阿拉伯糖。

BSRP或其编码基因在制备1,2,4-丁三醇中的应用，或BSRP或其编码基因在生物转化D- 木糖或L-阿拉伯糖制备1,2,4-丁三醇中的应用，也属于本发明的保护范围。

实验证明，对受体细胞进行上述A1)-A7)的改造，得到的名称为重组菌BW-025的重组 细胞的1,2,4-丁三醇的产量为1.35g/L±0.146g/L，1,2,4-丁三醇的得率为0.17g/g± 0.021g/g；而将重组菌BW-025的BSRP基因替换为苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)基因，其它 基因不变得到的重组菌BW-011的1,2,4-丁三醇产量为0.49g/L±0.011g/L，1,2,4-丁三 醇的得率为0.08g/g±0.003g/g；重组菌BW-025的1,2,4-丁三醇的产量和得率是重组菌 BW-011的2.8倍和2.1倍。说明BSRP或其编码基因与来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱 羧酶(MDLC)或其编码基因相比，可大幅提高1,2,4-丁三醇的产量和得率，本发明的1,2,4- 丁三醇相关蛋白(BSRP)比已报道的来自恶臭假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)更有利 于1,2,4-丁三醇生物合成。本发明的1,2,4-丁三醇的相关蛋白或其编码基因可应用于 1,2,4-丁三醇的生物合成。

附图说明

图1为重组质粒pET30a-miniPtac-bsrp的结构图谱。

图2为重组质粒pET30a-miniPtac-mdlC的结构图谱。

图3为BW-011转化液的HPLC检测结果。

图4为BW-025转化液的HPLC检测结果。

图5为1,2,4-丁三醇标准品的HPLC检测结果。

图6为D-木糖标准品的HPLC检测结果。

图7为1,2,4-丁三醇的LC-MS检测结果。

图8为D-木糖的代谢途径。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本 发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，大肠杆菌BW25113(TomoyaBaba,TakeshiAra,MikiHasegawa,Yuki Takai,YoshikoOkumura,MikiBaba,KirillADatsenko,MasaruTomita,BarryLWanner, andHirotadaMori1.ConstructionofEscherichiacoliK-12in-frame,single-gene knockoutmutants:theKeiocollection.MolecularSystemsBiology(2006):1-11.) 是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌 BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验 所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pKD46质粒为Clontech公司产品；下述实施例中的pCP20为长沙赢润生 物技术有限公司产品，货号为VJC0522。

下述实施例中，ycdW表示2-酮酸脱氢酶的编码基因，yiaE表示2-酮酸脱氢酶的编码基 因，yagE表示3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶的编码基因，yjhH表示3-脱氧-D-甘油-戊酮 糖酸醛缩酶的编码基因，xdh表示木糖脱氢酶的编码基因，adhP表示醇脱氢酶的编码基因， xylA表示木糖异构酶的编码基因，xylB表示木酮糖激酶的编码基因，bsrp表示1,2,4-丁三 醇相关蛋白的编码基因，BSRP表示1,2,4-丁三醇相关蛋白，mdlC表示苯甲酰甲酸脱羧酶的 编码基因，MDLC表示苯甲酰甲酸脱羧酶。

下述实施例中，1,2,4-丁三醇相关蛋白基因的编码序列如SEQIDNo.2所示，编码由SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2-酮酸脱氢酶基因yiaE的编码序列如SEQIDNo.4 所示，编码由SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质2-酮酸脱氢酶；2-酮酸脱氢酶基 因ycdW的编码序列如SEQIDNo.6所示，编码由SEQIDNo.5所示的氨基酸序列组成的蛋白 质2-酮酸脱氢酶；3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE的编码序列如SEQIDNo.8所 示，编码由SEQIDNo.7所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶； 3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yjhH的编码序列如SEQIDNo.10所示，编码由SEQID No.9所示的氨基酸序列组成的蛋白质3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶；木糖脱氢酶基因xdh 的编码序列如SEQIDNo.12所示，编码由SEQIDNo.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质木 糖脱氢酶；醇脱氢酶基因adhP的编码序列如SEQIDNo.14所示，编码由SEQIDNo.13所示 的氨基酸序列组成的蛋白质醇脱氢酶；苯甲酰甲酸脱羧酶基因mdlC的编码序列如SEQID No.16所示，编码由SEQIDNo.15所示的氨基酸序列组成的蛋白质苯甲酰甲酸脱羧酶；木糖 异构酶基因xylA的编码序列如SEQIDNo.18所示，编码由SEQIDNo.17所示的氨基酸序列 组成的蛋白质木糖异构酶；木酮糖激酶基因xylB的编码序列如SEQIDNo.20所示，编码由 SEQIDNo.19所示的氨基酸序列组成的蛋白质木酮糖激酶。

实施例1、用于生产1,2,4-丁三醇的重组菌BW-025和BW-011的构建

重组菌BW-025是对大肠杆菌BW25113进行下述A1)、A2)、A3)、A4)、A5)、A6)和A7) 的改造得到的重组菌：

A1)将所述受体细胞的2-酮酸脱氢酶基因yiaE和ycdW敲除；

A2)将所述受体细胞的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因yagE和yjhH敲除；

A3)将所述受体细胞的木糖异构酶基因xylA敲除；

A4)将所述受体细胞的木酮糖激酶基因xylB敲除；

A5)向所述受体细胞中导入木糖脱氢酶基因xdh；

A6)向所述受体细胞中导入醇脱氢酶基因adhP；

A7)向所述受体细胞中导入1,2,4-丁三醇相关蛋白基因bsrp。

BW-004的构建方法包括下述1-4，BW-010的构建方法包括下述1-5，BW-025的构建方 法包括下述1-6：

1、将所述大肠杆菌BW25113的所述2-酮酸脱氢酶基因(yiaE)敲除(缺失)，保持所述 大肠杆菌BW25113的其它基因不变，得到所述大肠杆菌BW25113的突变体，将其命名为BW25113 ΔyiaE；

2、将所述BW25113ΔyiaE的所述2-酮酸脱氢酶基因(ycdW)敲除(缺失)，保持所述BW25113 ΔyiaE的其它基因不变，得到所述BW25113ΔyiaE的突变体，将其命名为BW25113ΔyiaEΔ ycdW；

3、将所述BW25113ΔyiaEΔycdW的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE) 敲除(缺失)，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdW的其它基因不变，得到所述BW25113ΔyiaEΔ ycdW的突变体，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE；

4、将所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的所述3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因 (yjhH)敲除(缺失)，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的其它基因不变，得到所述 BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的突变体，将其命名为BW-004；

5、将所述BW-004的木糖异构酶基因xylA和木酮糖激酶基因xylB敲除并向所述BW-004 中导入所述木糖脱氢酶基因(xdh)和所述醇脱氢酶基因(adhP)，得到所述BW-004的突变体， 将其命名为BW-010；

6、向所述BW-010中导入所述1,2,4-丁三醇相关蛋白基因(bsrp)，得到所述BW-010的 突变体，将其命名为BW-025。

重组菌BW-025的具体构建方法如下：

1、BW25113ΔyiaE的构建：

将pKD46(Clontech公司)质粒通过氯化钙转化法转化至大肠杆菌BW25113中，得到含 有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113/pKD46。重组大肠杆菌BW25113/pKD46在阿拉伯糖诱 导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。

利用5’端含yiaE同源臂的扩增引物对yiaE(kan)P1和yiaE(kan)P2(yiaE(kan)P1 和yiaE(kan)P2的序列见表1)，以质粒pKD4(长沙赢润生物技术有限公司，货号：VJC0519) 为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸 序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得 到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段电转至上述BW25113/pKD46中，在含有终浓 度50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为 yiaEup和kan(yiaEup和kan的序列见表1)，目的片段大小为1097bp，其中，yiaEup 和kan引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yiaE基因的上游83-61bp和kan基因的 566-582bp附近区域。PCR扩增出大小为1097bp的阳性克隆为BW25113的突变体，测序分析 结果表明该突变体的基因组上没有yiaE基因。该突变体是将大肠杆菌BW25113的2-酮酸脱 氢酶基因(yiaE)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将大肠杆 菌BW25113的yiaE基因敲除，保持所述大肠杆菌BW25113的其它基因不变得到的突变体，将 该突变体命名为BW25113ΔyiaEkan。

利用表达Flp重组酶的质粒pCP20(长沙赢润生物技术有限公司，货号：VJC0522)消除 上述BW25113ΔyiaEkan的卡那霉素抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入 上述BW25113ΔyiaEkan中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜， 使菌体基因组上的卡那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为yiaE up和yiaEdown(yiaEup和yiaEdown的序列见表1)，目的片段大小262bp。其中，yiaEup 和yiaEdown引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yiaE基因的上游83-61bp和下游 46-70bp附近区域。将扩增出大小为262bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度 为50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗 性基因缺失的菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗 性LB中42℃培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将 其命名为BW25113ΔyiaE。

2、BW25113ΔyiaEΔycdW的构建：

将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至上述步骤1得到的BW25113ΔyiaE中，得到含有 质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔyiaE/pKD46。重组大肠杆菌BW25113ΔyiaE/pKD46在 阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同源重组的能力。

利用5’端含ycdW同源臂的扩增引物对ycdW(Kan)P1和ycdW(Kan)P2(ycdW(Kan)P1 和ycdW(Kan)P2的序列见表1)，以质粒pKD4为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为 两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用 cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因 片段电转至上述BW25113ΔyiaE/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上 筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为ycdWup和步骤1中所述kan(ycdW up和kan的序列见表1)，目的片段大小为1095bp，其中，ycdWup和kan引物结合位置分 别是大肠杆菌BW25113的ycdW基因的上游81-61bp和kan基因的566-582bp附近区域。PCR 扩增出大小为1095bp的阳性克隆为BW25113ΔyiaE的突变体，测序分析结果表明该突变体 的基因组上没有ycdW基因。该突变体是将大肠杆菌BW25113的2-酮酸脱氢酶基因(ycdW) 替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将BW25113ΔyiaE的ycdW 基因敲除，保持所述BW25113ΔyiaE的其它基因不变得到的突变体，将该突变体命名为 BW25113ΔyiaEΔycdWkan。

利用表达Flp重组酶的质粒pCP20消除上述BW25113ΔyiaEΔycdWkan的卡那霉素抗性， 具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEΔycdWkan中，在含有 终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡那霉素抗性 消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为ycdWup和ycdWdown(ycdWup和 ycdWdown的序列见表1)，目的片段大小257bp。其中，ycdWup和ycdWdown引物结合位置 分别是大肠杆菌BW25113的ycdW基因的上游81-61bp和下游43-67bp附近区域。将扩增出大 小为257bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板 上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的菌株，将该菌株于无 抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃培养6小时可将质粒 消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113ΔyiaEΔycdW。

3、BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的构建：

将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至上述步骤2得到的BW25113ΔyiaEΔycdW中，得 到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔyiaEΔycdW/pKD46。重组大肠杆菌BW25113Δ yiaEΔycdW/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白，宿主菌就具有了同 源重组的能力。

利用5’端含yagE同源臂的扩增引物对yagE(Kan)P1和yagE(Kan)P2(yagE(Kan)P1 和yagE(Kan)P2的序列见表1，以质粒pKD4为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两 侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用 cyclepure纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因 片段电转至上述BW25113ΔyiaEΔycdW/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平 板上筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为yagEup和步骤1中所述kan (yagEup和kan的序列见表1)，目的片段大小为1591bp，其中，yagEup和kan引物结合 位置分别是大肠杆菌BW25113的yagE基因的上游598-579bp和kan基因的566-582bp附近区 域。PCR扩增出大小为1591bp的阳性克隆为BW25113ΔyiaEΔycdW的突变体，测序分析结 果表明该突变体的基因组上没有yagE基因。该突变体是将BW25113ΔyiaEΔycdW的3-脱氧 -D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基因(yagE)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439 bp)从而将BW25113ΔyiaEΔycdW的yagE基因敲除，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdW的其它 基因不变得到的突变体，将该突变体命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan。

利用表达Flp重组酶的质粒pCP20消除上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan的卡那霉素 抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan 中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡 那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为yagEup和yagEdown (yagEup和yagEdown的序列见表1)，目的片段大小1200bp。其中，yagEup和yagEdown 引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yagE基因的上游598-579bp和下游493-512bp附近 区域。将扩增出大小为1200bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml 卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的 菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃ 培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113 ΔyiaEΔycdWΔyagE。4、BW-004的构建：

将pKD46质粒通过氯化钙转化法转化至上述步骤3得到的BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE 中，得到含有质粒pKD46的重组大肠杆菌BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE/pKD46。重组大肠杆 菌BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE/pKD46在阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白， 宿主菌就具有了同源重组的能力。

利用5’端含yjhH同源臂的扩增引物对yjhH(kan)P1和yjhH(kan)P2(yjhH(kan)P1和 yjhH(kan)P2的序列见表1)，以质粒pKD4为模板，进行PCR扩增，得到的PCR产物为两侧含 有FRT位点的卡那霉素抗性基因的核苷酸序列，将该PCR产物用DpnI酶处理，并用cyclepure 纯化试剂盒(Omega)回收，将回收得到的两侧含有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段电转至 上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE/pKD46中，在含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB平板上 筛选阳性克隆，并进行菌落PCR验证阳性克隆，引物对为yjhHup和步骤1中所述kan(yjhH up和kan的序列见表1)，目的片段大小为1593bp，其中，yjhHup和kan引物结合位置分 别是大肠杆菌BW25113的yjhH基因的上游579-559bp和kan基因的566-582bp附近区域。PCR 扩增出大小为1593bp的阳性克隆为BW25113的突变体，测序分析结果表明该突变体的基因 组上没有yjhH基因。该突变体是将大肠杆菌BW25113的3-脱氧-D-甘油-戊酮糖酸醛缩酶基 因(yjhH)替换为两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因(约1439bp)从而将BW25113ΔyiaE ΔycdWΔyagE的yjhH基因敲除，保持所述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagE的其它基因不变得 到的突变体，将该突变体命名为BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan。

利用表达Flp重组酶的质粒pCP20消除上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan的卡那霉素 抗性，具体步骤如下：采用化学转化法将质粒pCP20转入上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEkan 中，在含有终浓度25μg/ml氯霉素的LB平板上于30℃下培养过夜，使菌体基因组上的卡 那霉素抗性消除；挑选单克隆菌株，并进行菌落PCR验证，引物对为yjhHup和yjhHdown (yjhHup和yjhHdown的序列见表1)，目的片段大小1179bp。其中，yjhHup和yjhHdown 引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的yjhH基因的上游579-559bp和下游468-489bp附近 区域。将扩增出大小为1179bp的阳性克隆分别在无抗性LB平板和含有终浓度为50μg/ml 卡那霉素的LB平板上划线，只在无抗性的LB平板上生长的菌株为卡那霉素抗性基因缺失的 菌株，将该菌株于无抗性LB中42℃培养6小时。pCP20为温敏型质粒，在无抗性LB中42℃ 培养6小时可将质粒消除，得到卡那霉素抗性和pCP20质粒均消除的菌株，将其命名为BW25113 ΔyiaEΔycdWΔyagEΔyjhH。

对上述BW25113ΔyiaEΔycdWΔyagEΔyjhH进行菌落PCR，引物对为以下四种：yjhHup 和yjhHdown、ycdWup和ycdWdown、yagEup和yagEdown、yiaEup和yiaEdown，其中， 能同时扩增出大小分别为1179bp、257bp、1591bp和262bp四种条带的菌株为成功将yjhH、 ycdW、yagE和yiaE四个基因敲除的菌株，将其命名为BW-004。

5、BW-010的构建：

1)合成SEQIDNo.21所示的DNA片段“xdh-T1T2-adhP-miniPtac”，SEQIDNo.21 的第1-747位核苷酸与序列表中SEQIDNo.12位核苷酸一致，编码SEQIDNo.11所示的氨 基酸序列，SEQIDNo.21的第1315-2325位核苷酸与SEQIDNo.14的第1-1011位核苷酸反 向互补，SEQIDNo.21的第2349-2377位核苷酸与tac启动子的核苷酸序列反向互补，SEQID No.21的第896-924位核苷酸与rrnBT2终止子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第 1055-1009位核苷酸与rrnBT1终止子的核苷酸序列反向互补，SEQIDNo.21的第2334-2337 位核苷酸与RBS的核苷酸序列反向互补。将“xdh-T1T2-adhP-miniPtac”DNA片段替换质粒 pET30a(+)的NdeI和XhoI之间的序列，保持pET30a(+)的其他序列不变，得到重组质粒， 将该重组质粒命名为pET30a-xdh-T1T2-adhP-miniPtac。

2)以步骤1)的重组质粒pET30a-xdh-T1T2-adhP-miniPtac为模板，用引物对xdhminiPtac F和xdhminiPtacR(xdhminiPtacF和xdhminiPtacR的序列见表1)进行PCR扩增，得到 大小为2450bp的DNA片段，将该DNA片段命名为“xdh-T1T2-adhP-miniPtac-1”；以菌株 BL21(DE3)为模板，用引物对xylAupF和xylAupR(xylAupF和xylAupR的序列见表 1)进行PCR扩增，得到长度为1000bp的xylA的上游同源臂序列，将其命名为xylAup，其 中，xylAupF和xylAupR引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylA基因的上游 1000-976bp和上游26-1bp附近区域；以菌株BL21(DE3)为模板，用引物对xylBdownF和 xylBdownR(xylBdownF和xylBdownR的序列见表1)进行PCR扩增，得到长度为1000bp 的xylB的下游同源臂序列，将其命名为xylBdown，其中，xylBdownF和xylBdownR引 物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylB基因的下游1-14bp和下游975-1000bp附近区域； 以上述PCR扩增得到的三种PCR产物：xdh-T1T2-adhP-miniPtac-1、xylAup、xylBdown为 模板，用引物对xylAupF和xylBdownR进行PCR扩增，得到的PCR产物含有 xdh-T1T2-adhP-miniPtac的DNA片段、xylA的上游同源臂序列和xylB的下游同源臂序列， 将该PCR产物命名为“xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown”。

2)用限制性酶XhoI和SalI对xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown和自杀 型质粒pKmTsSacB分别进行双酶切，分别得到xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown 的双酶切产物和自杀型质粒pKmTsSacB的骨架，将xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylB down的双酶切产物和自杀型质粒pKmTsSacB的骨架连接，保持质粒pKmTsSacB的其他序列不 变，得到重组质粒，该重组质粒为从5’端到3’端依次为xylA的上游同源臂序列、 xdh-T1T2-adhP-miniPtac和xylB的下游同源臂序列的DNA片段替换质粒pKmTsSacB的XhoI 和SalI间的序列得到，将测序验证正确的重组质粒命名为pKmTsSacB-xylA up-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown。

3)将步骤2)得到的重组质粒pKmTsSacB-xylAup-xdh-T1T2-adhP-miniPtac-xylBdown 电转至上述步骤4得到的BW-004中，得到重组菌，将该重组菌于37℃下复壮培养2h后涂 布在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上，42℃下过夜培养。挑取过夜培养后的单 克隆菌株，用引物对xylABup-1和miniPtac-1(xylABup-1和miniPtac-1的序列见表1) 进行菌落PCR，验证xylA和xylB是否通过单交换被xdh-T1T2-adhP-miniPtac替换并整合 至大肠杆菌的基因组中，目的片段大小为3679bp，其中，xylABup-1和miniPtac-1引物结 合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylA基因的上游1295-1275bp和xdh-T1T2-adhP-miniPtac 片段2361-2384bp附近区域。将扩增出大小为3679bp的的菌株命名为BW-004 xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylB。

4)将步骤3)得到的BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylB挑取单菌落过夜活 化后，梯度稀释菌液，每个梯度浓度的菌液分别涂布在含有终浓度为100g/l蔗糖的LB平 板和不含蔗糖的LB平板上，37℃下培养。在合适梯度浓度下，含蔗糖的LB平板上有少量菌 落生长、而对应的涂有相同菌液的不含蔗糖的LB平板上有大量菌落生长，其中蔗糖平板上的 菌落则为发生双交换而丢失了sacB基因的菌株，将该菌株命名为BW-004 xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-1。

5)将步骤4)得到的BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-1挑取单菌 落，每个单菌落对应划线于含终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板和无抗性的LB平板上， 37℃下培养。在无抗性的LB平板上生长、且在含卡那霉素的LB平板上不生长的单菌落可能 为xylA和xylB被xdh-T1T2-adhP-miniPtac替换的重组菌，以该重组菌为模板，用引物对 xylABup-1和xylABdown-1(xylABup-1和xylABdown-1的序列见表1)进行菌落PCR， 验证片段xdh-T1T2-adhP-miniPtac是否完整插入至BW-004的基因组中，目的片段大小4828 bp，其中，xylABup-1和xylABdown-1引物结合位置分别是大肠杆菌BW25113的xylA基因 的上游1295-1275bp和xylB基因的下游1127-1149bp附近区域。将扩增出大小为4828bp的 阳性克隆命名为BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-2。

6)将步骤5)得到的BW-004xdh-T1T2-adhP-miniPtacΔxylAΔxylBΔsacB-2挑取单菌 落，在无抗性的LB液体培养基中活化过夜，涂布无抗性的LB平板，37℃培养，再从平板上 挑取单菌落，每个单菌落对应划线于含终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板和无抗性的 LB平板上，37℃下培养。在无抗性的LB平板上生长、且在含卡那霉素的LB平板上不生长的 单菌落可能为xylA和xylB被xdh-T1T2-adhP-miniPtac替换的重组菌，以该重组菌为模板， 用上述引物对xylABup-1和xylABdown-1进行菌落PCR，目的片段大小4828bp，回收PCR 产物并测序，验证片段xdh-T1T2-adhP-miniPtac是否完整插入至BW-004的基因组中，测序 正确的阳性克隆为xdh-T1T2-adhP-miniPtac成功插入至BW-004的基因组中的BW-004的突变 体，将该BW-004的突变体命名为BW-010。

6、BW-025和BW-011的构建：

根据大肠杆菌密码子的偏好性，在不改变序列表中SEQIDNo.1的氨基酸序列的前提下， 对BSRP的编码序列进行密码子优化，得到BSRP编码基因的优化核苷酸序列，如序列表中SEQ IDNo.2所示，将该优化核苷酸序列命名为bsrp。本申请中，将bsrp利用miniPtac启动子 进行组成型表达。

制备miniPtac启动bsrp表达的DNA片段，名称为“miniPtac-bsrp”，该DNA片段(序 列表中SEQIDNo.2)自5’端至3’端依次为：TGGCGCCGGTG+GAGCTG+miniPtac+ TGTGGTCACAC+AAGGAG+ATATCAT+bsrp+CCATGGCTG，其中CGCCGGTG为限制性内切酶SgrAI 的识别序列,CCATGG为限制性内切酶NcoI的识别序列，AAGGAG为RBS，miniPtac为启动子， 代表SEQIDNo.2的17-45位的核苷酸，bsrp为1,2,4-丁三醇相关蛋白基因，代表SEQID No.2的70-1716位的核苷酸，“+”表示直接相连。将质粒pET30a(+)的SgrAI和NcoI的 之间的序列替换为商业合成的“miniPtac-bsrp”的SgrAI和NcoI的位点之间的序列，保持 pET30a(+)的其他序列不变，将序列正确的重组质粒命名为pET30a-miniPtac-bsrp， pET30a-miniPtac-bsrp的结构图谱如图1所示。

按照上述方法，将pET30a-miniPtac-bsrp中的bsrp替换为SEQIDNo.16的mdlC(mdlC 为根据大肠杆菌密码子的偏好性，在不改变MDLC氨基酸序列的前提下，对MDLC的编码序列 进行密码子优化得到的核苷酸序列)，其他序列不变，得到重组质粒pET30a-miniPtac-mdlC， pET30a-miniPtac-mdlC的结构图谱如图2所示。SEQIDNo.16的mdlC编码SEQIDNo.15的 苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)。

将上述重组质粒pET30a-miniPtac-bsrp和pET30a-miniPtac-mdlC分别电转至步骤5得 到的BW-010中，在含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，将含有重 组质粒pET30a-miniPtac-bsrp的重组菌命名为BW-025，将含有重组质粒 pET30a-miniPtac-mdlC的重组菌命名为BW-011。

表1、引物序列表

实施例2、重组菌BW-011和BW-025的D-木糖生物转化

1、重组菌BW-011和BW-025的D-木糖生物转化

本实施例中M9盐溶液为无菌溶液，M9盐溶液各组分及其在M9盐溶液中的终浓度分别 为：6.78g/LNa₂HPO₄，3.0g/LKH₂PO₄，0.5g/LNaCl，1.0g/LNH₄Cl，1mMMgSO₄，0.1 mMCaCl₂，10mMNaHCO₃，100mMMOPS，50μg/ml卡那霉素，其余为水。其中，卡那霉 素溶液经0.22μm膜过滤除菌后，加入到经高温灭菌的含有除卡那霉素外其他所有组分 的M9盐溶液中，使卡那霉素在M9盐溶液中的终浓度为50μg/ml。

实验重复三次，每次重复实验的方法如下：

将实施例1步骤6得到的BW-011和BW-025的分别在含有终浓度为50μg/ml卡那霉 素的LB无菌平板上划线，于37℃下培养过夜，分别得到BW-011单克隆和BW-025的单克 隆。分别挑BW-011单克隆和BW-025的单克隆，将分别加至10ml含有终浓度为50μg/ml 卡那霉素的LB无菌液体无菌培养基中，于37℃、200rpm下过夜培养，分别得到BW-011 菌液和BW-025菌液。分别吸取1mlBW-011菌液和1mlBW-025菌液接种至100ml含有 终浓度为50μg/ml卡那霉素的LB液体无菌培养基中，于37℃、200rpm下摇瓶培养10h， 收集含有等量的BW-011和BW-025的菌体的培养液，于4℃、8000rpm下离心5min，弃 上清，得到BW-011菌体和BW-025菌体。分别向等量的BW-011菌体和BW-025菌体加入8ml M9盐溶液，分别重悬BW-011和BW-025的菌体，分别得到BW-011和BW-025的重悬液，分 别将BW-011和BW-025的重悬液转移至厌氧瓶中，并分别加入2ml100g/L的D-木糖溶 液，将厌氧瓶瓶盖上均分别插入一根1ml无菌注射器的针头通气，针头在厌氧瓶瓶外的 通气孔用0.22um无菌滤膜封闭。将含有上述BW-011重悬液与上述D-木糖溶液的厌氧瓶、 含有上述BW-025重悬液与上述D-木糖溶液的厌氧瓶置于37℃、200rpm的培养条件下培 养72h，进行D-木糖的生物转化，分别得到BW-011和BW-025的转化液。每种处理3瓶。

分别取上述BW-011的转化液和BW-025的转化液各1ml，于16000rpm下离心5min， 得到含有1,2,4-丁三醇的BW-011上清液和BW-025上清液，分别将BW-011上清液和BW-025 上清液用0.22μm滤膜过滤，并分别转移至液相色谱瓶中。

用液谱仪器(Agilent1260infinity)按照HPLC法以D-木糖(国药集团化学试剂北 京有限公司，货号：63012037)为标准品检测转化产物，采用标准曲线法(外标法)进行 定量分析待测样品中D-木糖的含量；用液谱仪器(Agilent1260infinity)按照HPLC 法以1,2,4-丁三醇(Aldrich，货号：296678)为标准品检测转化产物，采用标准曲线法(外 标法)进行定量分析待测样品中1,2,4-丁三醇的含量。BW-011转化液的HPLC检测结果 如图3所示，BW-025转化液的HPLC检测结果如图4所示，1,2,4-丁三醇标准品的HPLC 检测结果如图5所示，D-木糖标准品的HPLC检测结果如图6所示。

HPLC法检测条件：AminexHPX-87H有机酸分析柱(300mmx7.8mm；BioRad)，流动 相为0.015mol/LH2SO4水溶液，流速为0.5ml/min，进样量为10μL，柱温为15℃，检 测器为示差折光检测器，检测器温度为30℃。

计算BW-011和BW-025转化D-木糖的1,2,4-丁三醇产量(g/L)和D-木糖的消耗量 (g/L)，并计算1,2,4-丁三醇的得率(1,2,4-丁三醇的得率等于1,2,4-丁三醇的产量除 以D-木糖的消耗量)。BW-011转化D-木糖的1,2,4-丁三醇产量(g/L)和D-木糖的消耗量 (g/L)见图3，BW-025转化D-木糖的1,2,4-丁三醇产量(g/L)和D-木糖的消耗量(g/L) 见图4。

结果显示，重组菌BW-025的1,2,4-丁三醇的产量为1.35g/L±0.146g/L，1,2,4-丁 三醇的得率为0.17g/g±0.021g/g；而重组菌BW-011的1,2,4-丁三醇产量为0.49g/L ±0.011g/L，1,2,4-丁三醇的得率为0.08g/g±0.003g/g；重组菌BW-025的1,2,4-丁三 醇的产量和得率是重组菌BW-011的2.8倍和2.1倍。说明BSRP或其编码基因与来自恶臭 假单胞菌的苯甲酰甲酸脱羧酶(MDLC)或其编码基因相比，可大幅提高1,2,4-丁三醇的产 量和得率，本发明的1,2,4-丁三醇相关蛋白(BSRP)比已报道的来自恶臭假单胞菌的苯甲 酰甲酸脱羧酶(MDLC)更有利于1,2,4-丁三醇生物合成。

2、转化产物中1,2,4-丁三醇的鉴定

步骤1的BW-025的转化液利用Agilent液质联用仪(Agilent1200HPLC/6520QTOFMS) 检测目的产物1,2,4-丁三醇。色谱检测条件：AminexHPX-87H有机酸分析柱(300mm×7.8 mm；BioRad)，流动相为1‰的甲酸，流速为0.5ml/min，进样量为10μL，柱温为15℃， 检测器为示差折光检测器，检测器温度为30℃。质谱条件为：电喷雾电离正离子模式 (ESI+)，干燥气温度300℃，干燥气流速12L/min，雾化器压力25psi，毛细管电压3500 V，碎裂电压130V，扫描范围80-1000m/z。经液质联用分析，HPLC分离得到的保留时间 为16.285min的目标峰，为1,2,4-丁三醇，且目标峰成分单一，未检测到其他杂质物质 (图7)。